微生物检测手段及注意事项
微生物检测手段及注意事项
微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文对生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。
一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而
测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。
1. 微生物计量法
1.1 体积测量法
又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10 mL）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5 min）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
称干重法
可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
1.3 比浊法
微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600 nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.coli的生长及诱导时间。
1.4 菌丝长度测量法
对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。
2. 微生物计数法
2.1 血球计数板法
血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1 mL菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2.2 染色计数法
为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。
2.3 比例计数法
将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。
2.4 液体稀释法
对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5 mL试样，接种1 mL到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（Most Probable Number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。
2.5 平板菌落计数法
这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘
以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9 cm的平板上出现50~500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。
2.6 试剂纸
在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC，无色）待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。
2.7 膜过滤法
用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。
3. 间接测定法
微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。因此可利用生理指标等间接参数来测定生物量。
3.1 测定含氮量
大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，
如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas 测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。
3.2 测定含碳量
将少量（干重0.2~2.0 mg）生物材料混入1 mL水或无机缓冲液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加热30分钟后冷却。加水稀释至5 mL，在580 nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。
还原糖测定法
还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加N a2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。
3.4 氨基氮的测定
离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02 mol/L 的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02 mol/L的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。
3.5 其他生理物质的测定
P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸，产气，产CO2（用标记葡萄糖做基质），耗氧，黏度，产热等指标，都可用于
生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。
4. 商业化快速微生物检测法
微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：
4.1 试剂盒，培养基等手段
抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物
检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。如：抗干扰微生物培养基，新型生化鉴定管，微生物计数卡，环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。
4.2 借助新型先进仪器
BACTOMETER全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法（Impedance Technology）将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，
大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。
微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是Optical Density （光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物测定的范围，需要紫外分光光度计测最大吸收波长。用得最多的是：505 nm测菌丝菌体、560 nm测酵母、600 nm测细菌。用测OD方法画微生物生长曲线时，同一株菌的起始培养浓度可以准备多管（根据检测点的需要，如需检测10个点，就准备10管），然后每个点取一管出来测OD值就行了。
一般测菌体密度的OD的波长范围是580 nm-660 nm，如枯草芽孢杆菌用600 nm，已经属于可见光区（200 nm～400 nm为紫外光区，400 nm～800 nm为可见光区）。空白如用水做，需要离心洗涤菌体；空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤，但是不接种的培养基要和接种的同时培养以求条件一致，最后注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在这个区内的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀释后再测，因为OD太大，分光光度计的灵敏度就会显著降低。
一般都测吸光值，而且最好是整个实验过程中，保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，吸光值与稀释倍数不一定成正比，可保证整个实验点有可比性。且取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。
另，用分光光度计测微生物的OD值为什么要把波长设为600 nm
这个波长其实只是针对浊度，而分光光度计在600 nm处对浊度的反应比较灵敏。测吸收峰的实际意义并不大，比如LB摇瓶培养过夜的大
肠杆菌，其实在400多纳米处的吸收最大，但那很可能是培养液的吸收峰。
部分发酵产品配方和工艺(二)
纤维素酶
菌种：黑曲霉GD-6。
种子培养基：麸皮 2.0%，葡萄糖3.0%，(NH4)2SO4 0.15%，pH 5.5～6.0，28～30 ℃，培养40 h。
发酵培养基：酵母膏 1.0%，蛋白胨 0.2%，(NH4)2HPO4 0.2%，
K2HPO4 0.02%，KH2PO4 0.08%，MgSO4 0.09%，pH 5.5～6.0，28～30℃，培养140 h。
黄原胶
菌种：黄单孢菌。
发酵培养基：葡萄糖 4%，酵母粉 0.05%，豆粕粉 0.02%，无机盐适量。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量1:0.5/分，pH在7.0左右，28 ℃,发酵周期72 h，发酵液最高粘度14600 mPas左右。
虫草多糖
发酵培养基：葡萄糖 4.0%，黄豆饼粉 4.0%，酵母膏 0.5%，
KH2PO4 0.25%，MgSO4 0.15%。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:0.5/分，罐压0.5公斤，培养45～72小时。
细菌纤维素
菌种：Acetobacter xylinum NUST4。
发酵培养基：葡萄糖 2.4%，蔗糖 2.2%，蛋白胨 1.6%，醋酸0.24%，Na2HPO4 3.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.6%，FeSO40.0015%，pH 6.0。Mg2+最适添加量为6 g/L;0.015 g/L Fe2+时纤维素产量达最大；添加0.003 g/L烟酸、0.02 g/L生物素和20 mL/L乙醇时纤维素产量达9.87 g/L。
菌种：木醋杆菌1.1812。
发酵培养基：蔗糖 5.0%，蛋白胨 1.5%，柠檬酸 0.2%，Na2HPO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4 0.03%，乙醇 1%。
培养条件：pH 6.8，温度28 ℃，培养周期6ｄ。细菌纤维素产量干重为2 g/L。发酵完毕后过滤收集粗纤维，再用4% NaOH溶液冲洗，去离子水和0.5%
乙酸反复冲洗，即获细菌纤维素。
头孢菌素
菌种：顶头孢霉。
种子培养基：玉米浆，蔗糖，葡萄糖，DL-蛋氨酸，豆油，CaCO3，pH 6.5～6.6。
发酵培养基：玉米浆，淀粉，糊精，蛋氨酸，葡萄糖，豆油，CaCO3，MgSO4，(NH4)2S04，FeSO4，MnSO4，ZnSO4，CuSO4，pH 6.0～6.1。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量1:1/分，pH在6左右，周期150小时。
螺旋霉素
菌种：螺旋霉素链霉菌。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量1:1/分，发酵周期130小时左右。根据螺旋霉素生物合成的研究结果，短链脂肪酸是合成螺旋霉素的前体，结果发现在发酵培养48 h后添加0.5%浓度的乙醇，能够提高其发酵效价10%左右。加入豆油能较大幅度地提高螺旋霉
素的发酵效价。在培养48 h时加入较在基础料中加入更能提高螺旋霉素发酵效价，豆油的浓度以1%为好。
利福霉素
菌种：地中海诺卡氏菌。
培养基：葡萄糖 10%，液化淀粉 2%，黄豆饼粉 1%，蛋白胨 1%，鱼
粉 0.5%，各种无机盐适量。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量1:1/分，发酵周期130小时左右。
红霉素
菌种：红色链霉菌。
培养基A：液化淀粉 4%，葡萄糖 4%，黄豆饼粉 4%，正丙醇 1%，无机盐适量。
培养基B：黄豆饼粉 4％，葡萄糖4％，淀粉4％，糊精2%，CaCO3 0.6％，(NH4)2SO4 0.15%，KH2PO4 0.02％，NaC1 0.2%，MgSO4 0.02%。
发酵参考环境：10～100吨罐，搅拌转速115转/分，最高通风量1:1/分，pH自然，28℃，周期160小时。
洁霉素
菌种：链霉菌。
发酵培养基：黄豆饼粉 2.5%，玉米浆 0.6%，(NH4)2SO4 0.5%，NaNO3 4%，NaCl 0.6%，CaCO3 0.9%，玉米淀粉 2.5%，葡萄糖 3%，KH2PO4 0.07%。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:0.5/分，罐压0.7公斤，pH 6.5～7，培养温度：0～60 h，31 ℃；60～130 h，30 ℃；130 h至放罐31 ℃。发酵液初期粘度最大到130 mPas，发酵周期150小时。土霉素
培养基：黄豆饼粉 3%，玉米浆 0.65%，淀粉 8%，(NH4)2SO4 1.2%，NaCl 0.2%，CaCO3 1.1%，KH2PO4 0.015%，每罐外加CoCl2 5～10 g/吨。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:0.7/分，罐压0.7公斤。
环孢素
培养基：葡萄糖 2%，面粉 4%，干酪素0.6～1.2%，NaNO3 0.15%，KH2PO4 0.2%，KCl 0.05%，MgSO4 0.005%，CaCO30.2%。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:0.7/分，罐压0.7公斤，pH 6.5，发酵时间4天左右，温度25度左右。其中通气和培养温度对CyA的生物合成量影响非常大。
纳他霉素
菌种：褐黄孢链霉菌。
培养基：大豆蛋白胨 l.8%，酵母粉 0.45%，葡萄糖 3.6%，pH 7.5。发酵时间96 h左右。
庆大霉素
菌种：庆大小单孢菌。
培养基：淀粉 4%，玉米粉 2%，黄豆饼粉 3%，蛋白胨 0.3%，
(NH4)2SO4 0.1%，CaCO3 0.5%，每罐外加CoCl2 8～10 g/吨。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:1/分，罐压0.5公斤，pH 7.5～8.0，发酵周期80小时。
金霉素
菌种：金色链霉菌。
培养基及培养条件：玉米淀粉 8.5%，花生粉 1.5%，黄豆粉 2.5%，淀粉酶(酶活力2000 IU/mL) 0.004%，NaCl 0.25%，(NH4)2SO4 0.5%，CaCO3 0.7%，蛋白胨 1.0%，酵母粉 0.2%，MgSO4 0.025%，豆油 4.0 mL/100mL。在温度29±0.5℃，发酵培养166 h。
小诺霉素
菌种:棘孢小单孢
种子培养基：黄豆饼粉 l.5%，葡萄糖 0.1%，玉米粉 2%，鱼粉 0.2%，淀粉4%，pH 7.5。
发酵培养基：葡萄糖 0.5%，淀粉 4%，玉米粉 1.5%，热榨黄豆饼粉 2.5%，蛋白胨 0.2%，硫酸铵 0.05%，pH7.2。
四环素
培养基主要成分：液化淀粉，玉米浆，黄豆粉， KH2PO4，每罐外加二巯基苯并噻唑和NaBr。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:0.7/分，罐压0.7公斤，pH 6.0左右。
部分发酵产品配方和工艺(一)
赤霉素发酵
10～60吨罐，搅拌转速115 转/分，通风量1:1/分，培养温度大多采用29 ℃～32 ℃。培养基的起始pH值控制在5.5左右，而将发酵过程的pH值维持在3.5～4.5之间为宜。
种子培养基：葡萄糖 1.5%，豆饼粉 1.5%，淀粉 1.0%，KH2PO4 0.1%，(NH4)2SO4 0.05%，MgSO4 0.1%，自然pH值。
发酵培养基：豆饼粉 0.9%．淀粉 7.0%，葡萄糖 1.0%，KH2PO4 0.15%，MgSO4 0.08%，α-淀粉酶 0.003%，pH 5.0～5.5发酵周期130小时
阿维菌素：
种子培养基：淀粉 3.0%，豆饼粉 2.0%，酵母粉 0.2%，CoCl2·6H2O 0.5 ppm，pH 7.0～7.2。
发酵培养基：淀粉 5.0%，玉米粉 l.0%，酵母粉 l.0%，豆饼粉 1.0%，CaCO3 0.2%，CoCl2·6H2O 0.5 ppm，pH 7.0～7.2。
妥布霉素
发酵菌种：黑暗链霉菌。
发酵培养基：黄豆饼粉 2.5%，葡萄糖 1.0%，玉米粉 1.0%，玉米淀粉 1.5%，(NH4)2SO4 0.5%，鱼粉 0.4%；MgS04 0.6%，油1.0%，ZnSO4 0.05%，CaCO3 0.6%，温度37 ℃，发酵时间112 h左右。
氢化可的松
菌种：蓝色犁头霉(AS365)
发酵培养基：葡萄糖 1.0%，酵母浸膏 0.23%，玉米浆 1.5%，硫酸铵 0.5%，pH 6.4～6.5。28 ℃培养24 h，投入0.25%的RSA（醋酯化合物：17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，RSA），转化36～42 h。
宁南霉素
菌种：诺尔斯链霉菌西昌变种
孢子斜面培养基：可溶性淀粉 2%，蔗糖 1.0%，硝酸钾 1.0%，
K2HPO4 0.5%，MgSO4 0.5%，NaCl 0.5%，CaCO3 0.5%，硫酸亚铁 0.01%，琼脂 2.0%，灭菌前pH 7.2～7.4。
种子培养基：玉米粉 2.0%，黄豆饼粉 3.0%，酵母粉 0.01%，
K2HPO4 0.01%，MgSO4 0.0025%，NaCl 0.02%，CaCO30.03%，初始pH 7.0。
发酵培养基：玉米粉 2.0%，淀粉 1.0%，花生饼粉 3.5%，酵母粉 0.05%，K2HPO4 0.02%，MgSO4 0.05%，(NH4)2SO40.25%，CaCO3 0.5%，初始pH 7.0。发酵48 h达到发酵高峰。
多抗霉素
发酵培养基：玉米粉 1.5%，豆饼粉 2.0%，饴糖 2.0%，KH2PO4 0.1%，NaCl 0.1%，CaCO3 0.3%，pH 6.5。10％接种量，28℃，120h。
BT
该菌生长的最适pH在7.0~7.2，弱碱性条件有利于芽泡及晶体的形成；
增加培养基中糖含量显著提高菌体的生长量，但对芽孢及晶体的形成均有一定影响；高通气量有利于菌的生长，并可缩短发酵周期，但后期通气量过大影响
芽孢及晶体形成。该菌发酵的最佳工艺条件为：控制发酵温度在30℃；
发酵前期(包括延迟期、加速期、对数期)：pH控制在7.0，采用达1:2.0 v/(v·min)的大通气量，达1:2.0 v/(v·min)，为菌的生长提供良好的环境，尽可能提高菌数(高于7.5 1010/mL)；
发酵后期(减速期、恒定期)：不控pH，并适当减小通气旦到1:0.5、1:1.0 v/(v·min)，更有利于菌体向芽孢及伴孢晶体转化(98％以上)。
液体培养基：I号培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.5%，NaCl 0.5%，pH 7.2；II号培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖 1.0%，pH7.2。
衣康酸
菌种：土曲霉。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:0.2/分，罐压0.7公斤，pH 4.0左右。
培养基：葡萄糖 14%，米糠 0.3%，各种无机盐适量。发酵周期90小时。
曲酸
菌种：黄曲霉。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:0.2/分，罐压0.7公斤，pH 4.0左右。
培养基：主要成分为液化淀粉 14%，各种无机盐适量。发酵周期130小时。
菌种：米曲霉。
利用豆渣的发酵培养基：豆渣 80%，麸皮 24%，酵母膏 1.2%，
MgSO4·7H2O 0.16%，pH自然；30℃发酵培养，5～6 d菌体生长量和曲酸
产量最大。
利用黄浆水发酵培养基为：葡萄糖 12%，酵母膏 0.5％，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO4 0.05%，黄浆水 100%，pH为6.0。30℃发酵培养，5～6 d
菌体生长量和曲酸产量最大。
柠檬酸
菌种：黑曲霉。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:1/分，罐压0.7公斤，pH在3左右；
培养基主要成分为液化淀粉 14%，各种无机盐适量，产酸温度为34～
36 ℃，发酵周期90小时。
谷氨酸
菌种：谷氨酸棒杆菌。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:1/分，罐压0.7公斤，pH在7.0左右；
培养基主要成分：葡萄糖 13%，MgSO4·7H2O 0.08%，KH2PO4 0.08%，玉米浆 3%~9%，糖蜜 0.5%~1%，豆浓 3%~5%，KCl 0.1%，发酵周期30
小时。
赖氨酸
菌种：谷氨酸棒杆菌。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:1/分，罐压0.7公斤，pH在7.0左右。
种子培养基：葡萄糖 1.5%，(NH4)2SO4 0.4%，MgSO4·7H2O 40 mg，玉米浆 2.0%，尿素0.1%，CaCO3 3.0%，乙酸铵0.1%，K2HPO4 0.15%，豆浓 0.86%，pH 7.2～7.4，115℃高压灭菌15 min。
发酵培养基：葡萄糖 15.0%，(NH4)2SO4 3.5%，MgSO4·7H2O 20 mg，玉米浆 2.5%，乙酸铵 0.9%，生物素20 μg，K2HPO40.15%，豆浓 1.6%，pH7.2～7.4。115 ℃高压灭菌15 min。
碱性蛋白酶
菌种：芽孢杆菌
发酵培养基I：可溶性淀粉 1%，蛋白胨 0.5%，Na2HPO4 0.4%，
KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.1%，pH中性，121℃灭菌25 min。
发酵培养基II：玉米粉 2%，豆饼粉 3%，麸皮 3%，Na2HPO4 0.4%，KH2PO4 0.03%，ZnCl2 0.1%，pH 8.0，121℃灭菌25 min。
发酵培养基III：黄豆饼粉5%，玉米粉 5%，麸皮 2.5%，KH2PO4 0.03%，Na2HPO4 0.4%，Na2CO3 0.1%，自然pH。
在36 ℃下通风培养，前期通风1:0.15，后期通风1:0.2，培养40 h左右。
低温碱性蛋白酶
菌种：黄海黄杆菌。
发酵培养基I：豆饼粉(水解液，加0.5% NaOH，121 ℃水解30 min，冷却、过滤) 4.5%、玉米浆 6%，Na2HPO4 0.4%，KH2PO40.03%，
Na2CO3 0.1%，MgSO4 0.02%，CaCl2 0.2%，泡敌适量，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。
发酵培养基II：豆饼粉(水解液．加0.5% NaOH，121 ℃水解30 min，冷却、过滤) 4.5%、葡萄糖 1%，Na2HPO4 0.4%，KH2PO40.03%，
Na2CO3 0.1%，MgSO4 0.02%，CaCl2 0.2%，泡敌适量pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。
弹性蛋白酶
菌种：芽孢杆菌。
发酵培养基：酪蛋白胨 3%，葡萄糖 4%，玉米提取液 0.2%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.01%，pH 7.0。
耐高温酸性蛋白酶
菌种：黑曲霉黄色变株A-2580。
发酵培养基：麸皮 2.2%，豆饼粉 4.8%，NH4Cl 0.2%，KH2PO4 0.08%。
发酵条件：起始pH为4～5，接种量30 mL发酵液中2 108个孢子，发酵温度30 ℃，时间72 h。
高温中性蛋白酶
菌种：耐热芽孢杆菌XJT9503。
种子培养基：玉米粉 2.0%，豆饼粉 1.0%，Na2HPO4 0.4%，
MgSO4 0.02%，CaCl2 0.02%。
发酵培养基：玉米粉 2.0%，豆饼粉 1.0%，葡萄糖 0.5%，Na2HPO4 0.4%，Na2CO3 0.085，MgSO4 0.02%，CaCl2 0.02%。
发酵参考环境：3000 L发酵罐，将培养8 h的种子罐种子，以5%接种量移种于3000 L发酵罐，46℃，180 r/min，4 L/(L·Min)通气量下发酵培养18 h左右，测定发酵酶活达10000 u/mL以上，还原糖含量低于0.5%，镜检
有大量芽孢产生时即可终止发酵，为保证后处理过程中酶活不会大量损失，需迅速降温。
植酸酶
菌种：毕赤酵母。
发酵参考环境：5～100吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量1:1/分，pH 7.0左右。发酵培养基主要成分为甘油和氨水，发酵时间140小时左右。
碱性淀粉酶
菌种：地衣芽孢杆菌ATCC9789
发酵培养基：酵母膏 0.5%，玉米淀粉 2.0%，玉米浆 1.5%，豆饼粉 1.0%，NaCl 0.5%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.02%，pH 10.0。
补料培养基：蛋白胨 1.0%，玉米淀粉 1.5%，玉米浆 1.5%，NaC1 0.5%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.02%，CaCO3 0.5%，pH 10。发酵周期60小时。普通中温淀粉酶
菌种：a-淀粉酶枯草芽孢杆菌BF-7658变异株
发酵培养基：玉米粉 7%，豆饼粉 5%，Na2HPO4 0.8%，(NH4)SO4 0.4%，NaCl 0.15%，灭菌前pH 7.0~7.5，灭菌后pH 6.5~7.0。37.4±1℃下培养44～48小时。
微生物检查中无菌操作注意事项 一、关于采用酒精棉球消毒的注意事项 1.用酒精棉球擦拭双手，包括手掌、手背，尤其是手指，更换一个酒精棉球擦拭酒精灯附近（约10cm）桌面。 2.点燃酒精灯，在酒精灯附近拆器皿包装，并对器皿做相应标记。 3.用酒精棉球再次擦拭双手，开始实验操作。 4.消毒用酒精棉球湿度以不挤压出酒精为宜。 二、关于酒精灯正确使用的注意事项 1.酒精量以大于1/3，小于2/3为正确量。 2.防风罩应小口朝上放置于酒精灯上，反过来放置会导致氧气没有充分燃烧。 3.使用酒精灯前要检查灯芯帽是否盖得太紧，以防酒精不能上升，影响酒精灯燃烧。点燃酒精灯时严禁两个酒精灯对点。 4.熄灭酒精灯方法：先用灯芯帽扣压并熄灭火焰，再揭帽重新扣压一次。这样可防止蒸汽倒吸灯帽，再次使用酒精灯时难以揭开灯帽。 5.做样品稀释及从试管取样实验时，酒精灯应放在操作人员和试管架之间，便于无菌操作。 三、关于吸量管使用的注意事项 1.左手拿洗耳球，右手持吸量管，用右手食指平按住吸量管的顶部。 2.吸取样品后进行定量时，吸量管吸液口应贴附于试管内壁；放样时，吸量管吸液口也应贴附于试管约1/2内壁，不应贴附在管口处放液。吸量管应尽可能垂直放液。 3.用吸量管往空平皿加入1ml溶液时，吸量管应贴附于平皿底部中央位置放液；用吸量管在平板上加入溶液做涂布接种时，吸量管应垂直、悬空放液于平板中央。 4.因吸量管拆封包装后应马上使用，故无须对吸量管吸液口过火焰消毒。 5.整个取样放样的过程应尽可能保证试管口或锥瓶口靠近酒精灯火焰附近。
四、关于样品梯度稀释的注意事项 1.从试管架上取出所需试管于酒精灯火焰附近拔出试管塞，并在火焰外焰处对试管口过火焰进行消毒。 2.将试管放回试管架后用吸量管进行取样，然后取出该试管于火焰附近调节吸量管内溶液体积。 3.取样完成后对试管口再次消毒并塞上试管塞，将试管放回试管架原处。 4.从试管架上取出所需加样的试管于火焰附近进行加样放液操作。 五、关于培养皿记号的注意事项 1.标记统一写在平皿底部边缘，以“字数少、字体小、清晰、明确”为原则。 2.标记内容包括：班级、学号、日期、培养基名称、稀释级。 六、关于平板制备的注意事项 1.打开培养皿的方法：左手小指、无名指、中指及一部分掌腹托住平皿底部，食指和拇指张开轻握皿盖侧部，以食指为支点，摆动拇指打开皿盖。打开的皿口应向着酒精灯的外焰。切勿把开口朝向操作人员。 2.手持锥形瓶中下部将瓶中培养基倾倒入平皿中央位置，锥瓶口不应接触平皿。培养基应一次注入够量，不应分次加入（除实验特殊规定）。 3.混匀培养基时应将装有混合培养基的平皿于手中顺时针轻微摇匀2-3次，平放于桌面上后再次顺时针摇匀2-3次，整个过程应在培养基尚未开始凝固时完成。学生只要有其中一个摇匀动作也算完成混匀培养基。 4.手中装有培养基的平皿应水平放置于台面上，不应从台面边缘往里推。在位置允许的情况下，应分开平摊放置待凝。 七、关于涂布方式的注意事项 型涂布棒应放平涂布。 2.涂布时应从中间按同一个方向打圈方式往周边涂布，可以重复涂布。 3.从高稀释级往低稀释级涂布时，可以不用更换涂布棒，也不用灼烧涂布棒。涂布同一个稀释级的不同平板时也不用灼烧涂布棒。但是从低稀释级往高稀释级涂
实验室各种安全注意事项 一、实验室防火安全 1．实验室内必须存放一定数量的消防器材，消防器材必须放置在便于取用的明显位置，指定专人管理，全体人员要爱护消防器材，并且按要求定期检查更换。 2．实验室内存放的一切易燃、易爆物品(如氢气、氮气、氧气等)必须与火源、电源保持一定距离，不得随意堆放。使用和储存易燃、易爆物品的实验室，严禁烟火。 3．不得乱接乱拉电线，不得超负荷用电，实验室内不得有裸露的电线头，严禁用金属丝代替保险丝；电源开关箱内不得堆放物品。4．电器设备和线路、插头插座应经常检查，保持完好状态，发现可能引起火花、短路、发热和绝缘破损、老化等情况必须通知电工进行修理。电加热器、电烤箱等设备应做到人走电断。 5．使用电烙铁，要放在非燃隔热的支架上，周围不应堆放可燃物，用后立即拨下电源插头。 6．可燃性气体钢瓶与助燃气体钢瓶不得混合放置，各种钢瓶不得靠近热源、明火，要有防晒措施，禁止碰撞与敲击，保持油漆标志完好，专瓶专用。使用的可燃性气瓶，一般应放置室外阴凉和空气流通的地方，用管道通入室内，氢、氧和乙炔不能混放一处，要与使
用的火源保持10m以上的距离。所有钢瓶都必须有固定装置固定，以防倾倒 7．实验室内未经批准、备案，不得使用大功率用电设备，以免超出用电负荷。 8．严禁在楼内走廊上堆放物品，保证消防通畅通。 二、实验室化学药品安全 1．各级各类实验室所用化学药品的必须由学校统一组织购置，任何实验室和个人不得私自购置。购置剧毒类和易制毒类药品需经公安部门许可，持许可证方可购置。 2．化学药品要分类存放，相互作用的药品不能混放，必须隔离存放。所有药品都必须有明确的标签，贮存室和柜必须保持整齐清洁。有特殊性质的药品必须按其特性要求存放。无名物、变质过期的药品要及时清理销毁。实验室内不得存放剧毒类药品。 3．危险化学药品容器应有清晰的标识或标签。遇火、遇潮容易燃烧、爆炸或产生有毒气体的危险化学药品，不得在露天、潮湿、漏雨和低洼容易积水的地点存放；受阳光照射易燃烧、易爆炸或产生有毒气体的危险化学药品应当在阴凉通风地点存放。危险化学药品的存放区域应设置醒目的安全标志。
兽医微生物学实验复习题 1、兽医微生物实验室注意事项是什么？ 答：①防止病原微生物的散布；②防火；③节约；④标记；⑤记录；⑥安全；⑦清洁与秩序 2、观察细菌常用什么显微镜？它主要有哪几部分组成？ 答：光学显微镜光学部分:目镜、物镜、反光镜、聚光器；机械部分：镜座、镜臂、镜筒、粗调节器、细调节器。 3、油镜用毕后，为什么必须把油镜擦净？ 答：油镜的原理是通过香柏油的光路折射能更加清晰的观察微生物，油具有粘附性，且不溶于水，所以，在观察完后，香柏油会粘附在镜头上，不擦去的话，风干后镜头就变得模糊不清，甚至报废了，又因为是油所以简单的用擦镜纸擦拭是擦不干净的，二甲苯属于有机溶剂， 4、用过多的二甲苯或酒精乙醚混合液擦拭镜油有什么危害？ 答：过多的二甲苯或酒精乙醚混合液容易脱胶，使油镜脱落。 5、使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种？ 答：可用与玻璃的折光系数相近的油类，有7种，如柏木油。 6、观察细菌时显微镜的操作步骤是什么？主意事项是什么？ 答：将显微镜物镜镜头转为油镜对好光线（开高集光器，开大光圈，调好反光镜）使亮度最强在载物台上放上载玻片，并在玻片上放一滴香柏油将标本移至载物台正中转动粗准焦螺旋，使油镜浸入油滴中左眼由目镜注视镜内，慢慢地转动细准焦螺旋，直至物像清晰为止 注意事项：1.调节粗准焦螺旋的时候要慢 2.观察完后要用二甲苯擦拭油镜 7、微生物绘图要求有哪些？ 答：①绘出一个视野，圆形。 ②细菌大小比例合理，必须标明名称。 ③标名显微镜的放大倍数，标明菌名。 ④绘图一律用铅笔。 8、制备细菌染色标本片时应注意哪些事项？ 答：①干燥好的抹片固定时，使抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热，以不烫手为度进行固定。 9、涂片固定的意义何在？固定时应注意什么问题？有哪些固定方法？答：意义：涂片固定可将涂片上的细菌杀死，使之固定而不会到处漂移，并且死菌比活菌更容易着色，为后面染色做准备。 注意：若用火焰固定时，抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热。固定方法：火焰固定和化学固定。 10、细菌染色的原理是什么？ 答：细菌的等电点较低，约在pH 2～5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。 11、试述细菌革兰氏染色法的步骤及结果。革兰氏染色的原理是什么？ 答：原理：G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈蓝紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
微生物实验室安全操作规范 微生物实验室的布局和设计应考虑良好的微生物操作和安全。本质是最大程度的减少微生物菌种的交叉污染，微生物样本的处理环境也是重要，因为环境也能引起也污染的可能。规范微生物实验室内仪器、设备的安全操作及染菌的微生物培养物处理程序，保证微生物实验室安全操作意义重大。 一、员工安全操作规范 1、实验室主任（对实验室直接负责的人员）负责制订和采用生物安全管理计划以及安全或操作手册。 2、实验室安全主管（向实验室主任汇报）提供常规的实验室安全培训。 3、接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后和离开实验室前要洗手。 4、禁止在工作区饮食、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物。 5、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。实验室的门应保持关闭。 6、实验过程中，严格按有关操作规程操作，降低溅出和气溶胶的产生。 7、每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时用75%乙醇或巴氏消毒液消毒。
二、高压灭菌锅的安全使用操作规范： 1、堆放：将需灭菌的物品予以妥善包扎，依次堆放在灭菌锅。需灭菌物品外需黏上高压指示胶带以检验灭菌温度是否达到要求。 2、加水：在锅体内注入生活用水，水位一定要超过电热管2厘米以上（不宜过多）；连续使用时，每次操作前，必须补足上述水位，以免烧坏电热管和意外发生。 3、密封：在每次使用高压锅前，都必须认真检查高压锅的出气伐和安全阀，确保其状态完好，如有故障，在故障排除之前不得使用高压灭菌锅。把堆放好物品的灭菌桶放在锅体内，盖上锅盖并锁紧。 4、加热灭菌：将灭菌器接通电源，指示灯亮，表示电源已正常输入，按下开始按纽电热管开始加热工作；灭菌期间工作人员需监视高压锅指示面板上的压力、温度和时间等。 5、开盖：灭菌结束后，切勿立即将灭菌锅内的蒸汽排出，应待压力表指针归零位后，方可开启锅盖。 三、电炉使用操作程序及注意事项： 1、将盛有液体的玻璃容器（应垫石棉网）或不锈钢器皿置于电炉上，方可打开电炉加热。
什么是食品微生物检验 吴崇食质12级1班学号：20122629 微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50 亿个细菌。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广
微生物实验室安全及操作规定1目的： 为规范微生物实验操作，确保操作安全有效，制定本规定。 2.适用范围：化验室的微生物检测。 3.要求： 3.1无菌室的门要随手关闭，以防外界微生物的进入。 3.2微生物室内应保持清洁，不得存放与实验室无关的物品。 3.3进入无菌室前要更换经过灭菌的专用工作衣.帽.鞋。 3.4无菌室内应备有体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液.体积分数为70~75%的酒精棉球，以便样品表面及意外污染消毒。 3.5无菌室内应备有镊子.剪刀.接种针.接种环，每次使用前后应在酒精灯火焰上灼烧至无菌。3.6检验人员在操作过程中需严格按照要求进行操作，不得随意减少工序。 3.7无菌室禁止交谈，操作过程中不得用手触摸其它未消毒.灭菌的区域，与该工作无关人员不得随便出入无菌室。 3.8微生物（无菌室.缓冲间）每次使用前，用紫外灯照射30min，要每周检测一次室内空气清洁度，确保其符合实验条件。每周对微生物室进行至少一次2h以上紫外灯消毒。微生物室内的的菌种总数>5cfu/平皿时，需要对无菌室.缓冲间用85~95%乳酸熏蒸1h，熏蒸结束后（必要时可以将空间密闭整晚），用体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液或体积分数为70~75%的酒精棉彻底对洁净室.缓冲间及其内所有设备.物品进行清洗；后对无菌室.缓冲间进行半小时以上紫外线消毒，结束后，验证室内空气清洁度是否合格，仍不合格，则可加大乳酸熏蒸时间及紫外线灭菌时间。3.9每次微生物试验紫外灯灭菌前，需将所用的吸头.剪刀.纱布等物品浸泡于消毒剂中。 3.10接种前所用的试管.平皿及培养基必须经消毒灭菌，打开包装未使用完毕的器皿，不能再继续使用，金属用具应高压灭菌或用酒精灯过火三次后方可使用。 3.11切忌用手直接接触标本及已灭菌的器材内部，打开瓶塞或管塞时，应夹持在手中适当位置，避免污染。使用完毕的吸管.三角瓶.样品等应及时撤离，不可随意放在洁净工作台内。 3.12微生物检验每批必须做空白.对照试验（菌落总数做1个盐水对照.1个琼脂对照，大肠菌群做单料.双料各1个琼脂空白培养，整个检验过程超净台内的环境空白），同时记录。当有菌生长时必须保留样品及时汇报，分析原因再做处理，如果空白试验不符合要求，微生物结果不能出具。 3.13每次微生物实验结束后，所有物品及时撤离无菌室，并用体积分数为0.1%的新洁尔灭溶液将超净台内清理干净，酒精灯、剪刀等物品上的样品擦拭干净，用体积分数为0.1%的新洁尔灭溶液浸手或以肥皂洗手，再用清水冲洗干净。 3.14凡要丢弃的培养物，必须进行妥善处理，培养霉菌的培养物和玻璃器皿要先高压灭菌、再洗刷干净，然后再进行灭菌处理。 3.15严格控制培养箱温度以及培养时间，对培养箱的温度每个班至少监控两次。 3.16每周进行消毒剂擦拭一次培养箱内金属孔架及内壁，再有平皿破碎的情况时必须马上进行清理消毒，防止污染。．
数学趣味小知识 1、一个人花8块钱买了一只鸡,9块钱卖掉了,然后他觉得不划算,花10块钱又买回来了,11块卖给另外一个人.问他赚了多少? 答案：2元 2、假设有一个池塘,里面有无穷多的水.现有2个空水壶,容积分别为5升和6升.问题是如何只用这2个水壶从池塘里取得3升的水. 答案：先用5升壶装满后倒进6升壶里,在再将5升壶装满向6升壶里到,使6升壶装满为止,此时5升壶里还剩4升水，将6升壶里的水全部倒掉,将5升壶里剩下的4升水倒进6升壶里,此时6升壶里只有4升水，再将5升壶装满,向6升壶里到,使6升壶里装满为止,此时5升壶里就只剩下3升水了 3、一个农夫带着三只兔到集市上去卖,每只兔大概三四千克,但农夫的秤只能称五千克以上,问他该如何称量. 答案：先称3只,再拿下一只,称量后算差. 4、有只猴子在树林采了100根香蕉堆成一堆,猴子家离香蕉堆50米,猴子打算把香蕉背回家,每次最多能背50根,可是猴子嘴馋,每走一米要吃一根香蕉,问猴子最多能背回家几根香蕉？ 答案：25根，先背50根到25米处,这时,吃了25根,还有25根,放下.回头再背剩下的50根,走到25米处时,又吃了25根,还有25根.再拿起地上的25根,一共50根,继续往家走,一共25米,要吃25根,还剩25根到家. 5. 兄弟共有45元钱，如果老大增加2元钱，老二减少2元钱，老三增加到原来的2倍，老四减少到原来的1/2，这时候四人的钱同样多，原来各有多少钱？ 答案：老大8 老二12 老三5 老四20 6.一根绳子两个头，三根半绳子有几个头？答案：8个（半根绳子也是两个头） 7.一栋住宅楼，爷爷从一楼走到三楼要6分钟，现在要到6楼，要走多少分钟？ 答案：15分钟
实验一细菌涂片的制备及革兰氏染色 1、制备细菌染色标本时应注意什么？ 涂片不要太厚，要均匀，固定的时候一定按照要求，快速，染色脱色时间要控制好2涂片2、固定的意义何在？固定时应注意什么问题？ 固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 3、革兰氏染色的原理及染色成败的关键？ 机制：结果为阳性（紫色）和阴性（红色）两大类，与细菌细胞壁的结构组成有关。细菌经结晶紫初染和碘液媒染之后，所有细菌都染上不溶于水的结晶紫与碘的复合物，呈深紫色；阴菌的细胞壁含脂类较多，当以95%乙醇脱色时，脂类被乙醇溶去，而肽聚糖少，且交联疏松，不易收缩，在细胞壁中形成的孔隙较大，复合物极易被乙醇溶解洗脱，最后被红色的染料复染成红色；阳菌与阴菌相反，复合物不能脱出，经红色染料复染后仍为紫色。｛（碱）结晶染色→碘媒染→酒精脱色→①可脱为G+②不脱为G—｝ 关键：革兰氏染色四大基本步骤： 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 沙黄复染 其中乙醇脱色是关键 因为如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性 如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性 实验二培养基的制备 1、为什么在校正培养基pH时,少量培养基时用0.1摩尔每升氢氧化钠,而大量时用1摩尔每升氢氧化钠? 少量培养基在校正时，需要的氢氧化钠少，所以用浓度底的校正的结果会更准确。而大量的就需要大量的，如果还用浓度低得话，结果会准确，但是工作量极大，而换1mol/L的话，结果误差不会很大，综合考虑：在校正大量的培养基时，应使用浓度高的。 2、为什么肉汤培养基在高压灭菌之前ph要略调高些？ 牛肉膏中有些物质在加热后会分解出酸性物质导致pH下降。因此初始pH应比需要值高0.2左右。 3、试述普通肉汤和琼脂培养基的主要用途？ 琼脂培养基是在实验室做实验时专门配置的，一般植物源琼脂培养基适用于培养真菌一类的微生物；动物源琼脂培养基适用于细菌类微生物培养。动物源琼脂培养基主要成分与肉汤差不多，只是培养基可以根据实验的要求进行调整营养成分，以适应实验要求。琼脂培养基一定会成“冻”，肉汤不一定。 实验三细菌分离培养、移植及培养特性观察 五、注意事项 1、接种环必须做得圆整平滑，使用前后须烧灼灭菌。 2、接种培养基时应严格无菌操作，要尽一切可能防止外界微生物的进入。 3、选择适宜的培养基，如果培养基选择不当，则材料中的细菌就可能难以分离。 4、要注意记录好接种名称及时间。 六、思考题 1、分离培养的目的是什么?何谓纯培养? 分离培养的目的是：主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。 纯培养:把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。
微生物实验室的安全操作规程 1 实验室安全 1.1 微生物实验室的生物安全性 1.2 科室安全文档 （a）生物危害防护：实际操作规程见（《实验室生物安全通用要求》，中华人民共和国国家标准GB19489-2004。2004-01-05发布，2004-10-01实施。） （b）实验室安全：原则和措施见（《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，中华人民共和国卫生行业标准WS 233-2002。2002-12-03发布，2003-08-01实施。）1.3 应用： 以上的操作规程应用于微生物科室的所有部门。工作人员或访问人员必须遵守各项规定。 1.4 关于新规定或现行规定的修改案： 任何新规定或现行规定的修改案必须通知负责科室安全的人员及相关人员，他们将建议科室主任考虑实施。 1.5 生物性危害 1.5.1 与各种操作有关的生物危害水平取决于： a.处理的传染性物质的本身： 按照传染性物质对个人和社区的潜在危险性以及经空气传播的可能性，其划分成不同等级。所采用的等级划分详见＂《实验室生物安全通用要求》＂；原则和措施（见《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》）。 b.使用的设备和设施： 处理不同等级的传染性物质的要求在＂实验室安全＂中已规定。这些符合要求的设备都要承担重要临床工作，科室负责人必须保证中应污染物水平。 c.培训，特别是员工的安全性培训和安全性经验积累。所有员工应该接受一定训练，能安全处理任何实验室可能碰到的物质，避免将实验不能处理或规定之外的传染性物质暴露在实验室，即使暴露事故在实验室，即使暴露事故发生也要会正确处理。 1.5.2 传染性物质的分类 1.5. 2.1分类系统
英语趣味小知识(2)——你会犯这样的错误吗？ 你会犯这样的错误吗？ 英语有时候真是莫名其妙，你觉得你明明懂了，可实际上你又没有懂。所以，今天我想讲几件轶事，都是因为没有理解听到看到的东西而闹出的笑话。也许，从他们的经验中，你也可以学到一些东西。 第一个故事发生在秘鲁，一位美国妇女在餐馆里用餐。她问服务员： Excuse me. Where could I wash my hands? 服务员把她带到洗手间，可不巧，正有一些工人在粉刷洗手间的墙壁。工人们一看有人要用洗手间，就准备离开。服务员拦住他们，说： That’s Ok. Stay. She only wants to wash her hands. 在英语里，wash my hands实际上是上厕所的委婉说法。那个服务员按照字面意思理解，结果闹了笑话。还有一次，一个留学生在国外的学校第一天上学，心里又兴奋又紧张。一个美国人见到一张新面孔，为了表示友好，就问： Hi! What’s the good word? 留学生一听到这个，立刻傻眼了，他想， My God! I don’t know the good word. I’ve studied English for years, but no one told me about the good word! 他犹豫再三，想，反正我也不知道，就问问他好了。于是他吞吞吐吐地问： Hello. What’s the good word? 老美听了，很随意地说： Oh, not much. 这下，这个留学生就更吃惊了！ 原来，What’s the good word? 在美语里，是一句问候语，意思是“你还好吗？”但问话的人并不指望你把遇到的高兴的事情都一一告诉他，只是打个招呼而已。但这个留学生以为对方真的在问什么是Good word，所以闹了笑话，不过还好，也算给他歪打正着了。 下面的故事就更有意思了。一次，一个美国公司的管理人员给公司一个驻外分部发了一份传真，要求对方把职员的人数报上来。他是这么说的： I need a head count telling the number of people in your factory, the number of people in your office, broken down by sex. 在上面的传真里，broken down by sex是“按照性别分开”的意思，但是分公司的外国职员没有理解“broken down by sex”的意思。不过break something/someone down倒是还有一个意思，就是“把某事物，把某人压服”。
微生物实验注意事项 1.实验过程中要及时详细标清除产物和日期，实验做完以后要对以前的过度产品做个清 理，以免东西积累过多。 2.实验后的DNA和RNA要及时放回冰箱，以免时间长降解，特别是用水溶解的时候。 3.要及时甘油保存你鉴定出的细菌，每个细菌保存两份，存放在-80度冰箱里。 4.实验用的酶类虽然在室温下放一段时间也没什么问题，但还是要及时放回冰箱，以免 活性降低。 5.要及时清理实验台面，保持干净，整洁，有序。 6.无菌操作台用后及时清理干净，操作真菌和细菌等最好不要交叉使用。 7.培养基使用的时候要注意无菌操作，移液器不要插入培养基中，之准许无菌枪头进入 瓶子腔体，如培养基较少，可以倾斜瓶子，移液器取液体最好不要用到最大量程，以免吸液过猛导致与移液器接触。 8.灭好的培养基标签一定要写好，包括名称，日期，是否加抗生素，是否加抗生素非常 重要，特别是在共用培养基的实验室。 9.实验用过的试剂盖子一定要盖好，以免挥发。特别是有毒的物品，如氯仿，苯酚等， 用完后的瓶子及时拿出实验室。 10.带手套接触有毒物品后，要及时处理掉手套。不管是否接触过有毒物品，，不要戴着 手套乱接触其他东西，如开窗等。 11.做实验过程中不要接电话，说话，考虑其他事情。特别是PCR和配溶液的时候。做PCR 和配溶液的时候要把所用的试剂找全，一字排开，加完一种东西就把这种东西放到一边，可防止自己少加错东西。 12.同时作几个实验的时候一定要有定时器，防止自己忘记，特别是在煮东西，加热溶化 溶液等危险操作的时候，切忌。 13.饭前，有活动前不要做实验，这时候匆匆忙忙非常容易出错，特别是作有危险的实验， 更要注意。 14.作好试验记录，不管有没有结果，一定要坚持。还有点用图片，测序结果等，如果不 清楚记录东西多了，就乱了，混了。这个一定要认真做好。 15.要随时写下自己的想法，因为有些想法稍纵即逝。
趣味十足的英语文化小常识 Honeymoon 同学们一定都知道honeymoon吧，honey(蜂蜜)和 moon(月)结合在一起的意思就是“蜜月”。 honeymoon指的是新婚夫妇结为伉俪的最初一段时光(并非一定是结婚后的第一个月，虽然很多人都有这样的错觉)。 爱情经过长久的期盼和耕耘，相爱的情侣终于手拉手走到了一起，双方的感觉能不像蜜一样甘甜醇美吗? 有一种说法认为honeymoon这个词来源于巴比伦的民俗传统。 这个古老的国家一直保留着这样一个传统，在女儿出嫁的第一个月，女孩的父亲每天都会让女婿喝mead(蜂蜜酒)，以希望后辈们的婚姻永远幸福甜蜜。 然而，从词源学的观点来看，这种说法是错误的。 honeymoon 最早出现于16 世纪，honey 用以喻指新婚的甜蜜，但moon并不是指很多人认为的阴历月份(lunar-based month)，它是一种苦涩的暗示，旨在告诫人们婚姻固然是幸福甜美的。 但这种甜蜜就像月亮的盈亏，只是暂时的(因此要十分珍惜才对喔!)，婚姻更多的意味着双方要一起肩负生活的重担，一起承受人生的酸甜苦辣，一起经受生活的风风雨雨
Darling darling可能是英语中最流行的昵称了，也是最古老的词语之一。早在公元888年，darling就以deorling的形式出现了。 darling一词有多种用法，一般作名词表示“亲爱的人”，作形容词表示“亲爱的;可爱的”，同时darling也可以用来称呼所爱的人或家庭中的成员，如Darling, fetch me another bonbon, please.(亲爱的，请再帮我拿一颗小糖果吧。) darling还可以用作比喻，但经常带有轻微的讽刺意味，表示某人深受一个不大招人喜欢的人或机构的喜爱。比如，Senator is the darling of the oil companies.(参议员是石油公司的宠儿。) 尽管用途广泛，darling的来源却相当简单。darling源于古英语单词deor或deore，表示“所爱的人”或“亲爱的”，这会让你很自然的联想到今天的dear。 词缀ling表示one who is，所以deorling和今天的darling 的意思都是one who is dear. 此外，在夫妇之间，除了darling，还可以用sweetheart、pet、dear、love等称谓。 在男女恋人之间经常使用honey、baby等带有感情色彩的词汇，而一些有了孩子的守旧的老夫妻喜欢互称mother、father。
微生物实验室安全及操作规定 1目的：为规范微生物实验操作，确保操作安全有效，制定本规定。 2.适用范围：化验室的微生物检测。 3.要求： 3.1无菌室的门要随手关闭，以防外界微生物的进入。 3.2微生物室内应保持清洁，不得存放与实验室无关的物品。 3.3进入无菌室前要更换经过灭菌的专用工作衣.帽.鞋。 3.4无菌室内应备有体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液.体积分数为70~75%的酒精棉球，以便样品表面及意外污染消毒。 3.5无菌室内应备有镊子.剪刀.接种针.接种环，每次使用前后应在酒精灯火焰上灼烧至无菌。 3.6检验人员在操作过程中需严格按照要求进行操作，不得随意减少工序。 3.7无菌室禁止交谈，操作过程中不得用手触摸其它未消毒.灭菌的区域，与该工作无关人员不得随便出入无菌室。 3.8微生物（无菌室.缓冲间）每次使用前，用紫外灯照射30min，要每周检测一次室内空气清洁度，确保其符合实验条件。每周对微生物室进行至少一次2h以上紫外灯消毒。微生物室内的的菌种总数>5cfu/平皿时，需要对无菌室.缓冲间用85~95%乳酸熏蒸1h，熏蒸结束后（必要时可以将空间密闭整晚），用体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液或体积分数为70~75%的酒精棉彻底对洁净室.缓冲间及其内所有设备.物品进行清洗；后对无菌室.缓冲间进行半小时以上紫外线消毒，结束后，验证室内空气清洁度是否合格，仍不合格，则可加大乳酸熏蒸时间及紫外线灭菌时间。 3.9每次微生物试验紫外灯灭菌前，需将所用的吸头.剪刀.纱布等物品浸泡于消毒剂中。 3.10接种前所用的试管.平皿及培养基必须经消毒灭菌，打开包装未使用完毕的器皿，不能再继续使用，金属用具应高压灭菌或用酒精灯过火三次后方可使用。 3.11切忌用手直接接触标本及已灭菌的器材内部，打开瓶塞或管塞时，应夹持在手中适当位置，避免污染。使用完毕的吸管.三角瓶.样品等应及时撤离，不可随意放在洁净工作台内。 3.12微生物检验每批必须做空白.对照试验（菌落总数做1个盐水对照.1个琼脂对照，大肠菌群做单料.双料各1个琼脂空白培养，整个检验过程超净台内的环境空白），同时记录。当有菌生长时必须保留样品及时汇报，分析原因再做处理，如果空白试验不符合要求，微生物结果不能出具。 3.13每次微生物实验结束后，所有物品及时撤离无菌室，并用体积分数为0.1%的新洁尔灭溶液将超净台内清理干净，酒精灯、剪刀等物品上的样品擦拭干净，用体积分数为0.1%的新洁尔灭溶液浸手或以肥皂洗手，再用清水冲洗干净。 3.14凡要丢弃的培养物，必须进行妥善处理，培养霉菌的培养物和玻璃器皿要先高压灭菌、再洗刷干净，然后再进行灭菌处理。 3.15严格控制培养箱温度以及培养时间，对培养箱的温度每个班至少监控两次。 3.16每周进行消毒剂擦拭一次培养箱内金属孔架及内壁，再有平皿破碎的情况时必须马上进行清理消毒，防止污染。
微生物检验规程 1.实验注意事项 1.1无菌操作要求 1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 1.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。 1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。 1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。1.2无菌间使用要求 1.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 1.2.2无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 1.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 1.3消毒灭菌要求 1.3.1灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。 （3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。
生物趣味小知识 大家知道在生物学的世界还隐藏着什么样的有趣的事情么？下面就来为你们介绍一些趣味的生物知识，让大家在妙趣横生中收获知识。 一、世界上最小的花是一种浮在水面的水生浮萍科植物——无根萍，其实无根萍这种植物还创下了另外2个世界记录，那就是世界上最小的开花植物和世界上果实最小的植物。 二、世界上最大的花是苏门答腊热带森林里的一种寄生植物——大王花，它的最大的直径可达1.4m，重量可达10kg，同时它还是世界上最臭的花。 三、世界上最小的种子是天鹅绒兰的种子，它究竟小到哪种程度？据估计，50万粒的天鹅绒兰的种子加起来不足1g重。 四、世界上最大的种子是复椰子树的种子，一粒复椰子树的种子长达50cm，重量可达15kg。 五、苍蝇、蚊子飞过的时候，听到一阵嗡嗡的声音，并不是它们会叫，而是其飞行的速度在20～20000次/秒之间，人们听到的是空气的振动声。 六、白兔的身体里不含色素，它的眼睛其实是无色的，我们看到的红色是眼球的血液反映出来的颜色，并不是眼球的颜色。 七、很多动物，例如青蛙、蛇等到了冬天都会进行冬眠，但是海参却与之相反，它是一种夏眠动物。你知道是什么原因吗？原来海参是以一些小生物为食，夏天的时候，由于太阳光比较强烈，导致上层的海水温度高，于是海底的小动物都浮上海面进行大量的求食和增殖，导致海参断了食物的来源，故海参只能进行夏眠。 八、白蚁是蚂蚁吗？其实不然，白蚁和蚂蚁虽然同称“蚁”，但它们分属于不同的两目，白蚁是等翅目昆虫，蚂蚁是膜翅目昆虫。而在分类地位上，白蚁属于较低级的半变态昆虫，蚂蚁则属于较高级的全变态昆虫。所以白蚁和蚂蚁不能混为一谈。 九、蛇在捕捉食物的时候，是借助眼睛与鼻子之间颊窝对远处的猎物进行“热定位”。它们天生具有红外感知能力，能够“看”到发出热量的哺乳动物。蛇在吞食猎物时，会张大嘴巴，下颚临时脱臼，以便尽可能张大吞下猎物，吞完后下颚再恢复原位。十、蜘蛛结网，不仅为了捕捉猎物，而且还能够预测天气，如果看见蜘蛛张网，那么阴雨天气将会转晴；而看见蜘蛛收网的话，天气将转为阴雨。这是因为在蜘蛛尾部有许多小吐丝器，吐丝器部分既粘又凉，当阴雨天气来临时，由于空气中湿度大，水汽多，水汽易在蜘蛛吐丝器部分凝结成小水珠，这样蜘蛛吐丝时感到困难，便停止放丝而收网。 高考生物答题技巧 理综答题的唯一目标的得分最大化。 第一时间分配：正对理科综合而言时间分配是很要命的。建议按额定时间为标准根据自己的目标定位调整取舍。1、额定时间计算。该科目分值占总分比值乘以总时间，例如生物90分占理综300分的30%，理综时间150min，所以生物的额定时间应该是150的
微生物实验注意事项 一、无菌操作要求 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 3.接种食品样品时， 4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有 0.5- 0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。
2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W 3.无菌间使用前后应将门关紧，紫外灯，距离在 1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5.在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置 三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 （一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法 1．灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。 2．装放（1）干热灭菌器： 装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅： 放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。 3．设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
微生物学实验报告格式 专业学号 姓名 实验一、???培养基的配制和高压蒸汽灭菌 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际用到哪些试剂、材料、玻璃器皿等都要写出，包括数量） 四、实验步骤（按照实际步骤填写,切忌抄袭） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、简述培养基的配制原则？ 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？ 实验二自生固氮菌的分离纯化 （这是个综合实验，请大家回顾三周来的所有操作步骤，将其整理成连贯完整的一份报告，注意每次实验的衔接，不要把其他的实验项目写进来，但也不要漏写该实验的相关步骤。） 一、实验目的
二、实验原理 三、实验材料（整个综合实验有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙每周所做的相关步骤） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 2、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养？ 实验三平板培养测数法 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际操作有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙相关步骤） 五、实验结果 六、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 七、思考题 1、平板菌落计数法中，为什么溶化后的培养基再冷却至45℃左右才能倒平板？
2、本次实验是否成功？如果失败，试分析原因。 实验四简单染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述所观察到的细菌的显微形态） 六、思考题 1、简单染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 实验五革兰氏染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并判断自己分离到的菌种是G还是G+-？） 六、思考题 1、革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？
生物趣味性小知识 Δ一个人一天平均走两万步，一年要走七百万步。人活七十岁的话，加起来要走五亿步，即三十八万四千公里。这个数字，正好是地球到月球的距离。 Δ我们所穿的衣服每天把成千上万个表皮细胞揩掉。人们其实每27天就换上一层新的表皮。 Δ人眼的直径总是大致相等的——24毫米，而且几乎不因人们的年龄而改变，所以，孩子们的眼睛看起来似乎大些。 Δ1977年6月25日，美国佛罗里达州的特德·圣马田，在一次篮球表演赛中，站在罚球线上投篮，连续命中2036次。 Δ中指的指甲比其他指甲长得快。 Δ通过显微镜，我们可以看出：蚊子有22只牙齿。 Δ鲸的心脏每小时只跳540次。 Δ海狮的胡子比耳朵还灵，能辨别几十海里外的声音。 Δ长颈鹿打架时，就只会把长颈摇来晃去，用它们瘦骨嶙峋的头部拍击对方。 Δ骆驼喝了含盐的水也能解渴。 Δ意大利西西里岛埃特纳火山每日朝天喷出大量气体，其中含银9克、金2.4克。Δ铁片薄到只有0.001毫米厚时，就会像玻璃一样透明。 Δ把一掬盐放入一杯水中，水平面不仅不会升高，反而会降低些。 Δ据测定，地球上昼夜平均温差不超过20℃；而月亮对着太阳一面温度为110℃，背着的那一面为－170℃，二者相差280℃。 Δ你身体的几乎一半热量是通过头顶失掉的。 Δ在16世纪时，英国的男人是允许在晚上10时前殴打太太的。 Δ在古希腊，象征婚姻幸福的标志是一个三角形。 Δ在英国，当现代接骨手术还未发现之前，接骨的工作是由铁匠负责的。 Δ在本世纪之前，所罗门群岛的土著都是用狗牙来作钱币的。 Δ早期的高尔夫球其实是一个塞满羽毛的皮袋。 Δ原来头痛是产生于脑子周围的肌肉及神经而不是脑子本身；因脑子是不能够感受痛楚的。 Δ从含盐的多少来看，与人血最接近的物质是海水。 Δ每一个人平均每年要消耗一吨的食物和饮料。 Δ在我们吸入的氧气之中，有1／5是被脑细胞消耗的。 Δ婴儿可以同时地呼吸和吞咽，但成人却不可以。 Δ飞蛾是不会吃东西的，因为它没有口和胃。 Δ大象是唯一能够做头手倒立的动物。 Δ由于猪身有厚脂肪层的保护，令它不受蛇类的毒液影响，因此它不但能将蛇踏死，还会把它吃下 Δ并不是所有的蚊子都吸人血的，只有雌蚊才这样做，雄蚊只吸植物的汁液。 Δ在家猫的一生中，只有1／3的时间是清醒的。这跟它们的主人——人类——只花生命中的1／3时间来睡眠，有着明显的不同。 Δ爱斯基摩人用电冰箱的目的是防止食物结冰。 △很多鸟类总把它生下来时第一个看到的活动物认作是它的妈妈。 △让某人解算问题时，他的瞳孔会扩大起来，直到问题解答完为止。