摘要
我们试验中对目的基因AKP进行了克隆和表达，并分析了表达产物的活性。我们利用PCR方法扩增目的基因并提取大肠杆菌质粒，对扩增产物和质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析，琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物和质粒纯度符合实验要求；对质粒DNA和目的基因AKP进行双酶切后用琼脂糖凝胶电泳分析结果，并回收酶切产物以及连接载体和AKP，Ca2+诱导法将连接产物转化到感受态细胞；利用菌落特征和琼脂糖凝胶电泳分析结果筛选重组子；对确定正确的重组子用Ca2+诱导法转化，提取表达产物；对表达产物（AKP）进行酶活性检测，结果显示表达产物活性显著高于对照组；SDS-PAGE检测和蛋白印迹显示目的基因AKP成功表达。
关键词：目的基因AKP，表达产物
In our test, we cloned and expressed the gene of AKP, and analysis the activity of the product of expression, We make use of the polymerase chain reaction (PCR) to product purpose gene and extract the E·coli of plasmid, using agarose gel electrophoresis analysis the product of PCR and plasmid, the results show that the purity of the product of PCR and plasmid comply with the requirements; using enzyme cut the plasmid DNA and purpose gene(AKP),then, analysis the results of enzyme cut with agarose gel electrophoresis and recycling enzyme products, after that ,we connect the carrier and the AKP, using Ca2+put the products of connect into the feeling state cells; we screening recon with the features of colonies and the results of agarose gel electrophoresis; we transform the right recon into the feeling state cells with Ca2+, then, we collect the products of expression; we test the AKP on the activity enzyme, the results show us that the activity of enzyme is significantly higher than the control group; the test of SDS-PAGE and Western-blot show that the gene of AKP express successes.
KEY WOEDS: purpose gene of AKP, the products of expression
一、引言
1 PCR技术原理
1.1 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）：简称PCR技术，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。PCR 原理示意图如图一。
图一：PCR原理示意图
1.2 PCR反应参数
1)变性：94℃下预变性2-10min，一般变性温度与时间为94℃1min。对于
富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2)退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的
长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。
3)延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃.
实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围
可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4)循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般
而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加, 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。
1.3 扩增条件的优化
1)优化反应参数：退火温度和时间、变性温度和时间
2)优化Mg2+浓度
3)模板的纯度，优化模板浓度（含有污染物等）
4)优化dNTP的浓度
5)优化引物浓度（一般是10pmol/L）
6)PCR仪：热盖、升降温速度、精度
7)PCR管的质量等
2 核酸的凝胶电泳
1)电泳：带电粒子在电场中的涌动现象
a)丙烯酰胺凝胶电泳，5bp—500bp（分辨率高，1 bp)
b)琼脂糖凝胶电泳，200bp—50kb（分离范围广、方便）
2)琼脂糖介质结构均一，含水量大（98-99%），可通过调整琼脂糖的浓度改
变孔径的大小，起到分子筛的作用。
3)空隙大小决定其分辨分子大小的能力。
a)空隙小，分辨率高：小分子较易通过，大分子难通过
b)空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过
4)核酸为两性分子，在pH 3.5时，碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一
个磷酸解离，整个分子带正电；pH=8左右时，碱基几乎不解离，而磷酸
全部解离，整个分子带负电
5)在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有
相同的电荷密度，其电泳行为与SDS-PAGE类似，线性分子在凝胶中的迁
移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小。
6)胶浓度与适用线性DNA分离范围，见表一。
表一：胶浓度与适用线性DNA分离范围
7)常用电泳缓冲液：1×TAE
8)上样缓冲液：增加样品密度、使样品带颜色，起指示作用、本身有一定迁
移率，指示相对位置
9)常用染料:
a)SYBR:新型低毒，高灵敏度荧光染料，可直接加入样品中，价格较昂贵，
对DNA的迁移率有一定的影响
b)GoldView TM: 无明显的致癌作用灵敏度与EB相当，加入胶中5uL/100mL
胶，紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光而单链DNA呈现红色荧光。对皮
肤、眼睛有刺激，操作时带手套。
3载体（vector）
1)基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。
2)载体的特点：
a)自我复制:复制子，是一段特殊结构的DNA序列，载体有复制点才能使
与它结合的外源基因复制繁殖。
b)筛选标记:有一个或多个利于检测的遗传表型，如抗药性、显性表性反应。
c)合适的限制酶切位点，便于外源基因插入
d)适当的拷贝数，以便于载体的制备和克隆基因的剂量增加
3)目前载体主要有:
a)大肠杆菌中的质粒：pUC19、pBR322、pETBlue-2等
b)噬菌体载体：λ噬菌体、M13噬菌体
c)酵母人工染色体载体
d)动、植物病毒载体
4质粒pETblue-2（3653bp）
4.1 质粒pETblue-2图谱如图二。
图二：质粒pETblue-2（3653bp）图谱（lac operator ，T7 promoter ，E. coli promoter，lacZ α-peptide ORF，multiple cloning region，His?Tag? coding sequence ，HSV?Tag? coding sequence，f1 origin ，pUC origin，bla coding sequence）
4.2 pETBlue-2系统的优点：
1)在E.coli中克隆目的基因：Ori、MCS、lacZ α-peptide ORF、Ap R
2)在E.coli中表达重组蛋白：受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿
主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。在非诱导条件下，目的基因处于沉默状态而不转录。
4.3 Nova Blue宿主菌
1)Genopyte:endA1 hsdR17 (rK12– mK12+) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac
F′[proA+B+ lacIqZΔM15::Tn10 (Tet R)
2)非表达宿主菌，常规克隆，制备质粒
3)NovaBlue 适合用作初始克隆宿主菌的K-12 菌株，具有高转化效率、蓝/
白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒DNA 高产的recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的lacI q 阻遏蛋白，NovaBlue 的DE3溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。
5 DNA重组
1)外源DNA分子与载体的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA称为
重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子和外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA 连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来的功能。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
2)影响重组效率的因素
a)酶切效果
b)载体和目的基因的比例（1：3－10）
c)细菌的生长状态(5x107个/mL)
d)感受态细胞的质量
e)试剂的质量
f)外源DNA的质量与数量
g)污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行
h)器皿的洁净度
6连接产物转化克隆菌株
1)细菌处于0度，二价阳离子CaCl2存在的低渗溶液中，细菌膨胀成球形，
处于感受态。
2)此时转化混合物中的外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏
附于细胞表面。重组DNA加热在42度的短时间的热冲击下吸附在细胞表面，进入细胞。
3)在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。
4)转化的确切机制还不清楚。
5)优点：简单、稳定、可重复性高。转化效率为105~106/ugDNA
6)缺点：转化效率稍低，而且不能转化大质粒（＞15Kb）。
7)转化过程见图三。
图三：转化示意图
7表达产物（AKP）的酶活性检测
1)碱性磷酸酶简介：大肠杆菌碱性磷酸酶(E.coli alkaline phosphatase) 也称大
肠杆菌碱性磷酸酯酶，简称AKP/ALP，EC.3.1.3.1) 在碱性环境下能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
2)对硝基酚磷酸（pNPP）为含磷化合物，能被AKP水解为对硝基酚（pNP）
和游离的磷酸基团。对硝基酚磷酸在碱性条件下为无色化合物而对硝基酚则为黄色化合物，在410nm处有光吸收值，利用此反应的颜色变化可以测定AKP的酶活性。
3)AKP测活原理如图四。
图四：AKP测活原理示意图
=17500L mol-1cm-1；C:光吸收物质的浓4)比尔-朗伯定律：ODλ = ?LC【?
pnp
度（mol·L-1）；L:光路长度（cm）】
8变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
1)SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键，β－巯基乙醇或
二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开，二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质－SDS复合物，由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷
2)SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于雪茄烟形
的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比
3)SDS-PAGE中，SDS－蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影
响，而只与蛋白质的分子量正相关
4)用途：亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等
9 蛋白质免疫印迹（Western blotting)
1)印迹(blotting)是70年代中后期出现的一种生化技术，类似于吸墨迹的过程
2)常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交及许多灵敏的检测技术
相匹配而进行
3)广泛应用于DNA、RNA、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大分子
的研究
4)Western blotting，免疫印迹，与Northern 杂交与Southern 杂交类似，但
Western采用的是PAGE电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
5)Western印迹技术的基本过程：
a)蛋白质的凝胶电泳分离：蛋白质印记的第一步，一般是将蛋白质进行
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测蛋白质按分子大小在胶上排列。
b)蛋白区带的电转移和固定：第二步是将凝胶电泳分离的蛋白质区带用
电转移法或其它方法转移到特殊的固相载体上，并牢固地结合于固相
载体上形成并保持与相应的抗原或抗体特异性结合的特性，经得起各
种处理的稳定的蛋白条带。现在固相载体用的较多的是NC膜和一种
尼龙衬底的膜（ZB膜），它们和生物大分子都是非共价形式吸附结合。
c)免疫印迹显色：通过抗原抗体的特异性结合检测转移到载体上的蛋白
质区带。将印迹有蛋白质区带的固相载体与特异性的抗体或单克隆抗
体温育，再与酶、荧光素或同位素标记的特异抗体的二抗反应，最后
通过底物的显色反应、荧光检测、放射自显影等方法显示目的蛋白的
存在和相对分子大小。
d)转移：虹吸作用转移、真空转移、电转移。半干式转移装置见图五。
图五：转膜示意图
e）检测：印迹在载体膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。
一般经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。一抗对抗原是特异的。酶标二抗是商品化的，对某种动物的一抗都可以反应，这是因为Ig的恒定区在同一种动物Ig同一型轻链和重链中是比较恒定的具有相同的抗源性。二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、同位素等标记。辣根过氧化物酶的底物有DAB（二氨基联苯氨），OPD(邻苯二氨）等。示意图如图六。
图六：检测过程示意图
二、实验材料、试剂及仪器设备
1实验材料
大肠杆菌、NovaBlue菌、氯仿、异戊醇、酚、葡萄糖、Tris-HCl、EDTA、NaOH、乙酸钾、冰醋酸、水、胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、乙醇、生理盐水、甘油、甘氨酸、甲醇、R-250、K2HPO4、脱脂奶粉、DAB、H2O2、柠檬酸钠
2主要试剂
LB液体培养基、LB固体培养基、表达培养基、SDS储液、组织匀浆液、酶解液、5x电泳缓冲液（pH 8.3）、印迹缓冲液（pH 8.3）、R-250染色液、封闭液、显色底物、变性溶液、中和缓冲液、马来酸（顺丁烯二酸）缓冲液、洗涤液、检测缓冲液
3部分试剂的配制
表二：试剂配方
4仪器
PCR仪、离心机、分光光度计、恒温水浴箱、稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、垂直电泳槽、蛋白转移槽、数字化凝胶成像分析仪、超声细胞破碎仪、灭菌锅、恒温培养箱、摇床、PH计、电子天平
三：实验步骤
1 目的基因PCR扩增及扩增产物的回收
1.1PCR扩增目的基因AKP
1.1.1在0.2mlPCR管内配制50uL反应体系
双蒸水35.7uL
2.5mmol/L dNTP 4uL
10xbuffer 5uL
引物sense（10umol/mL）2uL
Antisense 2uL
模板DNA 1uL
Ex－Taq E 0.3uL（1.5U）
1.1.2按下述程序进行扩增
1)94℃预变性5min
2)94℃变性1min
3)55℃退火1min
4)72℃延伸1min
5)重负步骤2）—4）30次
6)72℃补齐10min
1.2琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
配制0.8%琼脂糖凝胶电泳（1×TAE），50uLPCR扩增产物＋6 uL10×loading-buffer，10 uLmarker，恒压80v。凝胶成像仪观察记录电泳结果。
1.3扩增产物的回收
1)切胶、称胶重（减重法）
2)每100mg胶加入500uL溶胶液，55℃溶胶
3)将溶解的胶液体转移至吸附柱，12000rpm离心30秒，去除废液
4)漂洗:向吸附柱的正中央加入500uL漂洗液，12000rpm离心30秒，去除废
液
5)重复漂洗一次去除废液。
6)空柱12000rpm离心2min，以彻底去除废液
7)将吸附柱置于一新的干净无菌的1.5mLEP管中，向吸附柱的正中央加40uL
洗脱buffer，室温放置5分钟。12000rpm离心30秒，以洗脱DNA。
8)再次向柱子的正中央加10uL无菌水，室温放置5分钟；12000rpm离心2
分钟。合并回收液。
9)SYBR检测回收产物
10)﹣20℃保存产物
2 质粒DNA的提取及其定性定量分析
2.1质粒DNA的提取
1)先在3mlLB液体培养基中加入3 uL羧苄（终浓度是50ug/mL）、10uL四环
素（终浓度是12.5ug/mL），然后接入一个含pETBlue2质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2)将过夜培养的菌液加入1.5ml小指管中，4000rpm、离心1min，吸取培养
液，收集所有菌体于一个小指管中。
3)加入100uL溶液I于含菌体细胞的小指管中，漩涡震荡将细菌沉淀悬浮，
室温放置10min。
4)加入200uL溶液II（冰上预冷），室温静置菌液裂解变清（不要超过5min）。
5)加入200uL溶液III冰上静置15min，使质粒DNA复性。
6)12000rpm，离心10min，将上清转移至另一1.5ml小指管。
7)向上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇，漩涡混匀，12000rpm，离心5min，
将上清转移至另一1.5ml小指管。
8)向上清加等体积的氯仿：异戊醇，漩涡混匀，12000rpm，离心5min，将上
清转移至另一1.5ml小指管。
9)上清加2倍体积的无水乙醇，漩涡混匀后，室温放置30min ，充分沉淀质
粒DNA。12000rpm，离心10min，吸去上清液。
10)沉淀用75%乙醇1mL洗涤2次（每次12000rpm，离心5min），吸去上清
液，沉淀于超净台中风干。
11)沉淀加入30uL RTE，60℃水浴30min溶解。
12)-20℃保存。
2.2质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
1)用1xTAE配制1%琼脂糖凝胶，以及电泳缓冲液。
2)上样：4uL质粒DNA + 0.5 uL 10xloading buffer
3)Marker 5ul
4)80伏恒压电泳
5)用凝胶成像仪分析照相
3 质粒DNA和目的DNA（AKP）的双酶切
3.1酶切
1)在灭菌的1.5ml小指管中按表三准备双酶切反应体系：
表三：酶切反应体系
2）37℃酶切3小时
3.2酶切产物的凝胶电泳分析
1)用1xTAE配制1%琼脂糖凝胶，以及电泳缓冲液。
2)上样：
a)2uL pETBlue-2 + 1 uL 10xloading buffer
b)2uL目的基因AKP+ 1 uL 10xloading buffer
c)全部管1酶切产物+ 1 uL 10xloading buffer
d)全部管2酶切产物+ 1 uL 10xloading buffer
e)Marker 10ul
3)80伏恒压电泳
4)用凝胶成像仪分析照相
3.3酶切产物的回收
1)切胶、称胶重（减重法）：每管内的胶块不应超过700mg。
2)溶胶：每1mg胶加入1uL膜结合液（MB）的比例（1:1）加入膜结合液（MB）,
混匀后55℃溶胶，每间隔1-2分钟混匀一次，直至胶块完全溶解。
3)DNA结合：待凝胶结合液冷却至室温后，将溶解的胶液体转移至吸附柱内，
静置1分钟，室温下12000rpm离心1分钟，弃除收集管中的废液，将吸附柱重新插回收集管中。
4)漂洗:向吸附柱的正中央加入600uL漂洗液，室温下12000rpm离心30秒，
去除废液。
5)再次漂洗：加入600uL漂洗液（MW）于离心吸附柱中，室温下12000rpm
离心30秒，去除废液。将吸附柱开盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。
6)洗脱：将吸附柱置于一新的干净无菌的1.5mL离心管中，向吸附柱的正中
央加15uL无菌水，室温放置3分钟。12000rpm离心1分钟，以洗脱DNA。
7)再次向柱子的正中央加5uL无菌水，室温放置3分钟；12000rpm离心1
分钟。合并回收液。
8)检测：SYBR检测回收产物
3.4载体和AKP的连接
1)在无菌小指管中按比例加入表四中试剂制成连接体系
表四：连接反应体系
2)控制载体和目的基因的比例为1：3－10
3)14℃水浴保温连接过夜
4)－20℃保存，用于转化受体细胞
4连接产物的转化
4.1感受态细胞的制备
1)预培养：接NovaBlue单菌落到含12.5ug/mL Tet的3mL LB培养基中，37℃、
190rpm振荡培养过夜
2)取0.5mL预培养菌液转移到含12.5ug/mL Tet 的35mL LB液体培养基的
锥形瓶中，37℃、250rpm振荡培养2.5-3小时
3)将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min
4)4℃，4000rpm ，离心10min
5)到出培养液，将管倒置使培养液流尽
10mL，用5 mL枪头轻轻吹散菌体细胞，6)菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl
2
冰浴30min
7)4℃，4000rpm ，离心5min，充分去上清
8)用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 2mL用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作
9)分装细胞200uL/份，此为感受态细胞，于-70℃或-20℃冻存
4.2转化
1)取200uL感受态细胞，加入连接产物10uL
2)取200ul感受态细胞，加入酶切过的质粒2ul (阴性对照）
3)取200uL感受态细胞，加入质粒DNA 2uL（5－50ng)（阳性对照）
4)取200uL感受态细胞，加入2uL无菌水（阴性对照）
，加入连接产物2uL （阴性对照）
5)取200uL 0.1 mol/L的CaCl
2
6)用枪头轻柔混匀，冰上放置30min
7)42℃水浴热激90秒
8)冰浴2分钟
9)复苏：每管加800uL LB液体培养基，37度慢摇45min到1小时（150rpm ）
10)选择性筛选：将复苏菌液4000r/min离心1min，先吸去900uL上清，再将
细胞吹散成细胞悬液，取50uL细胞悬液直接涂布在含50ug/mL Carb、
12.5ug/ mL Tet 、70ug/mL X-gal和80umol/L IPTG的LB选择平板上，直
至液体全部吸收，倒置培养过夜（37℃）
5重组子的筛选
5.1 预培养：
将白色单菌落接入3ml含抗生素（50ug/mL Carb和12.5ug/mL Tet）的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜（150rpm ）
5.2质粒DNA的提取
1)先在3mlLB液体培养基中加入3 uL羧苄（终浓度是50ug/mL）、10uL四环
素（终浓度是12.5ug/mL），然后接入一个含pETBlue2质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2)将过夜培养的菌液加入1.5ml小指管中，4000rpm、离心1min，吸取培养
液，收集所有菌体于一个小指管中。
3)加入100uL溶液I于含菌体细胞的小指管中，漩涡震荡将细菌沉淀悬浮，
室温放置10min。
4)加入200uL溶液II（冰上预冷），室温静置菌液裂解变清（不要超过5min）。
5)加入200uL溶液III冰上静置15min，使质粒DNA复性。
6)12000rpm，离心10min，将上清转移至另一1.5ml小指管。
7)向上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇，漩涡混匀，12000rpm，离心5min，
将上清转移至另一1.5ml小指管。
8)向上清加等体积的氯仿：异戊醇，漩涡混匀，12000rpm，离心5min，将上
清转移至另一1.5ml小指管。
9)上清加2倍体积的无水乙醇，漩涡混匀后，室温放置30min ，充分沉淀质
粒DNA。12000rpm，离心10min，吸去上清液。
10)沉淀用75%乙醇1mL洗涤2次（每次12000rpm，离心5min），吸去上清
液，沉淀于超净台中风干。
11)沉淀加入20uL RTE，60℃水浴30min溶解。
12)-20℃保存。
5.3重组质粒的双酶切分析
5.3.1 酶切
1)在灭菌的1.5ml小指管中按表五准备双酶切反应体系：
表五：酶切反应体系
2)37℃酶切3小时
5.3.2 1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物
1)用1xTAE配制1%琼脂糖凝胶，以及电泳缓冲液。
2)上样：
a)2uL 未酶切pETBlue-2 + 1 uL 10xloading buffer
b)4uL质粒＋0.5uL 10 x loading buffer
c)Marker 10ul
3)80伏恒压电泳
4)用凝胶成像仪分析照相
6 阳性重组子转化表达菌株
6.1感受态细胞的制备
1)预培养：接Tuner TM(DE3)placI单菌落到含34ug/mL Cam的4mL LB培养基
中，37℃、190rpm振荡培养过夜
2)取0.5mL预培养菌液转移到含34ug/mL Cam的的35mL LB液体培养基的
锥形瓶中，37℃、250rpm振荡培养2.5-3小时
3)将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min
4)4℃，4000rpm ，离心10min
5)到出培养液，将管倒置使培养液流尽
10mL，用5 mL枪头轻轻吹散菌体细胞6)菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl
2
，冰浴30min
7)4℃，4000rpm，离心5min，充分去上清
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
Western-Blot 操作流程 （一）组织中总蛋白的提取 用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min, 段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，） 20-30s,每隔5min 后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。 （二）BCA法蛋白含量的测定 (1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 (3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。 (4)酶标仪测定OD值。 (5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。 （三）稀释蛋白及蛋白变性 如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。 （四）制作SDS电泳胶 ⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。 ⑵配置10%的分离胶 配方：H2O2 4.0ml 30%丙烯酰胺液 3.3ml 1.5mol/l Tris （ PH8.8） 2.5ml 10%SDS 100ul 10%过硫酸胺 100ul TEMED 4ul ⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。 ⑷制备5%的浓缩胶 配方；H2O2 3.4ml 30%丙烯酰胺液 0.83ml 1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml 10%SDS 50ul
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
Western-Blot操作流程 试剂配制 1.RIPA裂解液： 10mM Tris（MW121.14，PH7.5） 1%NP40 0.5%TritonX-100 0.2%脱氧胆酸钠 2 mM EDTA 1 mM PMSF 20%甘油 调pH值至7.5。 混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 制胶用（1-6）： 1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3.10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g
（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。 6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。 10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）： 依次加入去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。 7．5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8．10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
Western Blot 原理和操作方法（详细） 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数
蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴
原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
Western 操作步骤 （三）SDS——PAGE电泳 （1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。 （2）灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边） 2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。 3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。 4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。 5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。 6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。 7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul （3）电泳：恒流25mA每块胶，两块胶50mA。电泳至溴酚兰刚跑出来即可终止电泳，进行转膜 （四）转膜 （1）转一张膜需准备四张滤纸和一张硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套（以防手上的蛋白污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转膜缓冲液浸湿。 （2）夹子黑的一面：海绵—2张滤纸—NC膜—胶—两张滤纸—海绵（刘老师的顺序），将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回赶几遍以赶走里面的气泡。在垫子上垫两层滤纸（光滑面临膜），放膜于滤纸上，将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于膜上，用手调整对齐，再放两张滤纸（光滑面临膜）用玻璃棒赶去其中的气泡。最后盖下另一块海绵垫，擀几下就可以合起来了。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，否则会发生短路。如果同时做两块胶，转膜时要记住样本的位置。 （3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的红面，夹的白面对槽的黑面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用35V过夜（刘老师）。 转膜时点击方向注意是膜正胶负转膜结束前配制封闭液（3%脱脂牛奶）及1×TBST缓冲液。 （五）免疫反应 （1）封闭：将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭30分钟。 （2）一抗 A.从封闭液中取出膜，1×TBST 5min ×4次 B.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1小时后，4度过夜，次日用1×TBST
Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；
SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
Western Blot操作全过程 一，收蛋白 a（如果要收集死细胞） 1.取冰，将4°C离心机提前降温。 2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量 的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。 3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。 4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。（1×Cell Lysis Buffer： PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。） 5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm， 15min。 6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。如：100μL。 7.将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存） b （如果不收集死细胞） 1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。（同上） 2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。） 3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。 5．将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存） 二，测蛋白浓度 BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作） 1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋 白。 2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl（A： B=50：1）。例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000） 3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。 4.用酶标仪测蛋白浓度。 5.记下蛋白浓度，根据要上样的μg量算出μl量。例：蛋白浓度为 1000，需上样15μg。则需上样15÷1000=？上样量不超过20μl。 三，配胶 1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。（板必须擦干净， 下端对齐，否则容易漏胶。）
Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生
Western blot基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ 水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳 将电泳装置与电源连接。调节电压为100-200V，电泳50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。
蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。