Western Blot操作全过程
一,收蛋白
a(如果要收集死细胞)
1.取冰,将4°C离心机提前降温。
2.将死细胞收集到离心管:孔板内的细胞用PBS洗1-2遍,用适量
的胰酶消化,用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来,收集到离心管,室温离心1000rpm,5min。
3.弃上清,将离心管倒扣在滤纸上,尽量吸尽残留上清。
4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。(1×Cell Lysis Buffer:
PMSF=100:1,1×Cell Lysis Buffer,PMSF-20°C保存。PMSF 常温易降解,拿出时间不得超过30min,必须放置冰上。)
5.冰上裂解15min,将裂解液转移至EP管离心,4°C,12000rpm,
15min。
6.小心将上清转移至另一EP管,记下吸取的量。如:100μL。
7.将收集好的蛋白保存与—20°C。(可长期保存)
b (如果不收集死细胞)
1.弃上清,孔板PBS洗1-2遍,吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。(同上)
2.冰上裂解15min,用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。(不同的孔不能用同一个刮子,刮前用水冲洗,擦干。)
3.将裂解液转移至EP管离心,4°C,12000rpm,15min。
4.小心将上清转移至另一EP管,记下吸取的量。
5.将收集好的蛋白保存与—20°C。(可长期保存)
二,测蛋白浓度
BCA法(或者按照自己的试剂盒说明操作)
1.需96孔板,测蛋白浓度的A液,B液,标准蛋白,要测的样品蛋
白。
2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液,每孔需AB混合液80μl(A:
B=50:1)。例:有5个样品,加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880μl,B液取880÷50=两液混匀,加入96孔板,每孔80μl。然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。
(标准蛋白先配好浓度125,250,500,1000,2000)
3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。
4.用酶标仪测蛋白浓度。
5.记下蛋白浓度,根据要上样的μg量算出μl量。例:蛋白浓度为
1000,需上样15μg。则需上样15÷1000=上样量不超过20μl。
三,配胶
1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净,对齐,夹好。(板必须擦干净,
下端对齐,否则容易漏胶。)
2.配分离胶,根据要跑的蛋白分子量,配相应浓度的胶。
3.快速将分离胶加入薄厚板之间,不能太满,留出浓缩胶的部分。
(浓缩胶高度大约1CM)
4.在分离胶上灌水,要缓慢,为了让胶凝的更好。
5.30分钟左右,分离胶凝了,将水倒掉,滤纸吸干,找好梳子。制
浓缩胶。
6.灌胶,快速插入相应的梳子。
7.约15min胶可以凝固。
四,煮蛋白
1.煮蛋白前将蛋白中加入6×SDS+DTT(即上样缓冲液)。例样品蛋白
共有100μl,则需加100÷5=20μl 6×SDS+DTT。混匀。(加有DTT的SDS应-20°C保存。DTT应-20°C保存。SDS:DTT=9:1)。
2.将蛋白沸水煮10min。煮过的蛋白在两周内有效。
五,上样,跑胶,转膜
1.电泳巢内加入电泳液,夹好胶板。拔去梳子。
2.每孔上样量不超过20μl,每块胶应上有Maker。剩余的孔里上1
×SDS。
3.蛋白上样前要震荡混匀。
4.浓缩胶80V,分离胶120V。
5.转膜
半干法转膜或者湿转自己的试验条件决定。
根据分子量的大小,按照Maker的位置裁胶,根据胶的大小,剪相应大小的NC膜。(NC膜要先用甲醇活化)。
六,封闭
5%牛奶(TBST稀释的脱脂牛奶)室温封闭1-2h,
七,封一抗
摸清抗体要用的浓度。用TBST或5%牛奶加抗体。室温1-2h,或4°C过夜。
用过的抗体要回收,做记号,用的第几次。放入-20°保存。
八,洗膜
用TBST摇床上洗3遍,每次10min。(一抗不要摇的太剧烈)
九,封二抗
摸清二抗的浓度。室温45min-2h。抗体回收,做记号,用的第几次。放入-20°保存。
十,洗膜
用TBST摇床上洗3遍,每次10min。(二抗可以摇的稍快些)
十一,发光
1.在发光板内放入干净的可以夹住NC膜的薄膜,放好已经洗好
的膜。用滤纸吸干膜上的水。
2.拿齐发光板,发光液,1ml的枪及枪头(至少两根),胶片,一
张滤纸,一个离心管。
3.进入暗室,反锁好门,开红灯,在离心管内配发光液,A液:B
液=1:1。先A后B。切记换枪头,打开薄膜,将AB液混匀,均匀的洒在NC膜上。盖上薄膜,将多余的发光液推开,以防水多膜移动。漏出薄膜外的可用滤纸吸干。
4.关灯,看见荧光,盖上胶片。胶片盖上之前先在左上角(个人
习惯)折个角,好辨认方向。
5.根据荧光强度按压几秒或几分钟。将胶片放入洗片机冲洗。
6.等片子完全洗好,可开灯。
或者DAB显色需要买试剂盒。
十二,扫描保留结果