禽流感HN血凝和血凝抑制试验培训课件(一)
禽流感是一种由禽类传播的病毒性疾病，它严重影响禽类养殖业的稳定和人们的健康。为了加强对禽流感的诊断和监测，现已开展了许多相关培训课件，其中包括HN血凝和血凝抑制试验培训课件。
一、 HN血凝试验
HN血凝试验是一种有效检测禽流感的方法。该试验涉及到鸭或鸡的腹腔内的红白血球，以及指定的病毒抗原和抗体。该试验的转化需要将抗原和抗体分别注入鸡和鸭体内，然后观察细胞凝集的形成情况，最终确定结果。
二、血凝抑制试验
血凝抑制试验是检测禽流感的另一种方法。这种试验依赖于血红蛋白联合病毒和抗体。在正常情况下，抗体能够识别并抑制病毒，防止病毒感染红血球。但是，当感染病毒时，一些抗体会被该病毒绑定，使掉血集合的凝固作用被阻止，从而导致血小板和红细胞受到影响。
三、培训课件的优点
1. 它可以提高禽类人员的技能和能力，他们可以通过学习这些课件加强对禽流感的认知。
2. 通过学习HN血凝和血凝抑制试验的原理和流程，人们能够更好地理解各种试验的工作原理，包括试验的优缺点和最佳实践。
3. 通过掌握这些试验技巧，专业人员将可以更高效地诊断出禽流感。
四、总结
HN血凝和血凝抑制试验是两种有效的禽流感检测方法。培训课件可使
禽类专业人员更好地掌握这些技巧，并提高他们处理这类病毒的能力。最终，这些技能和知识将有助于确保禽类养殖业的稳定和人类的健康。
禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与 阴、阳性血清使用说明书 【主要成分与含量】抗原为灭活的H5亚型禽流感病毒，血凝效价≥7log 2 。阳性 血清为SPF鸡感染禽流感病H5亚型制备的高免血清，HI效价≥7log 2 。阴性血清为SPF鸡血清。 【性状】抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。 【作用与用途】用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型抗体。 【用法与测定】 1、材料 1.1 96孔V型（90°）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。 1.2 PH值7.2 0.01mol/L PBS 1.2.1 配制25倍PB 称量2.74 Na 2HPO 4 和0.79gNaH 2 PO 4 ·H 2 O,，加蒸馏水至 1000m1; 1.2.2 配制1倍PBS 量取40m1 25倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸馏水至1000m1; 1.2.3 用Na0H或HCL调pH值至7.2; 1.2.4 69Kpa15min高压灭菌或用微孔滤膜过滤除菌。 1.2.5 PBS一经使用，于2-8℃保存不超过3周。 1.3 阿氏(Aisevers)液称葡萄糖 2.5g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0. O55g、氯化钠0.42g,加蒸馏水至1OOm来ml，加热溶解后调pH值至6.1， 69Kpa 15min 高压灭菌，2-8℃保存备用。 1.4 1%鸡红细胞悬液采集采集2-3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH值7.2 0.Olmol/L PBS液洗涤3次，每次均以3000rpm/mi n离心5min，洗涤后用PBS配成1% (V/V)红细胞悬液，2-8℃保存备用。（采5ml鸡血，分置3管，添加盐水6ml，多一点也没关系，充分用吸管反复吹打混均，放置在离心机离心，把上清液去掉，反复3次。） 1.5 抗原溶解冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用PBS溶解。 2、操作术式 2.1血凝（HA）试验 2.1.1在v型微量反应板中，每孔加0.025m1 PBS。 2.1.2第1孔加0.025m1抗原，反复抽打3-5次混匀。 2.1.3从第1孔吸取0. 025m1抗原加入第2孔，混匀后吸取0. 025m1加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025m1弃去。
禽流感血凝-血凝抑制试验操作方法及注意事项 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。 2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。 6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。 3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。 6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min 后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。 三、试验过程中的注意事项 1样品的保存及试验前处理 1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧烈震动。 1.2 一般情况下，在5天内检测的样品可放置在4℃的冰箱中冷藏，否则低温冷冻保存。 1.3 在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采用上下缓慢颠倒几次的方法即可，切忌剧烈振荡而引起产生气泡及血清中蛋白变性。 1.4 对出现胶冻状的血清样品，可采用反复搅动几下再离心的方法有助于缓解该状态。胶状物是含纤维蛋白和纤维蛋白原的血清，可能是由于放置时间不够造成的血清未完全析出状态。不建议直接吸取其中少量的清亮血清。 1.5 水禽等样品为排除非特异性反应，还应相应进行灭能反应。具体操作方法：56℃水浴锅30min或加等量10%鸡红细胞，轻摇后静置30分钟，离心，收集上清液即可。 2器材的选择 2.1 酶标板的选择： 建议使用96孔90°V型板进行试验，通过反复试验证明：90°V型板相对于110°板及130°板来讲，具有红细胞沉降速度快，产生的凝集图像清晰、结果容易判定等优点。 2.2 移液枪的选择及使用： ①单道、多道可调微量移液枪应选择合适的量程，以便精确度的提高。 ②使用时应采用一档吸液二档排液的方法。吸取液体时，枪头要深入液下缓慢平稳吸液。加缓冲液时
血凝和血凝抑制试验 作者：陈美艳罗福斌任芬 来源：《云南农业》 2020年第9期 陈美艳1，罗福斌1，任芬2 （1.新平县动物疫病预防控制中心，云南新平 653400；2.新平县畜牧站，云南新平653400） 摘要：血凝、血凝抑制试验是目前兽医实验室用于禽疫苗免疫抗体水平监测技术。试验通过首先制备红细胞沉降良好的分数为1%鸡红细胞悬液；其次抗原血凝效价准确；第三4HAU工 作抗原配制；第四血凝抑制滴定读数准确。 关键词：4HAU抗原；血凝；血凝抑制 血凝、血凝抑制试验是目前兽医实验室用于禽疫苗免疫抗体水平监测技术，也可用已知标 准阳性血清（抗体）监测是否有该病毒（抗原）的存在。实验室用血凝、血凝抑制试验检测鸡 血清中禽流感和新城疫抗体，其血凝反应（HA）可以理解为，禽流感病毒和新城疫病毒或其血 凝素能和鸡红细胞发生凝集反应致使红细胞不能自然沉降。血凝抑制反应（HI）理解为，当禽 流感和新城疫工作抗原和血清样品中抗体反应后，则红细胞就不能再与工作抗原发生反应，这 时红细胞就呈现出自然沉降现象，当血清样品抗体不足以和工作抗原反应时，工作抗原就和红 细胞发生凝集反应。 1 材料与方法 1.1 供试材料和试剂 96孔U型微量反应板、移液枪及配套滴头，禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原、禽流 感病毒H9亚型阳性血清、阴性血清、体积分数为1%鸡红细胞悬液、灭菌生理盐水和加样槽。 1.2 试验方法 1.2.1红细胞沉降良好的体积分数为1%鸡红细胞悬液制备 为避免出现红细胞自凝现象，一般选用至少3只健康公鸡分别采血，并清洗红细胞后配制 成体积分数为10%红细胞悬液，最后配制成体积分数为1%红细胞悬液。若1%鸡红细胞悬液用量 大于100 mL时也可直接配制。一般按照等比例混匀体积分数为1%鸡红细胞悬液，如在试验过 程中遇到特殊情况，无法满足等量比例混合时也可适当调整比例。整个试验过程只能使用同1 份鸡红细胞悬液，并保持混匀以确保红细胞均匀；如有红细胞破裂或者被污染情况，试验无效。 1.2.2 血凝（HA）试验，即抗原效价 按照中华人民共和国国家标准进行血凝试验，根据熟练程度选择平行测定抗原血凝效价， 一般选择3个平行测定，U型微量反应孔反应体系为0.075 mL混合液。使用抗原：禽流感病毒 H9亚型血凝抑制试验抗原，批号：2018006，生产日期：20181228，有效期至20201227，生产 厂家：哈尔滨维科生物技术有限公司。 1.2.3 4HAU抗原标定试验
高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验 一、材料准备 1、96孔90℃V型微量反应板，微量移液器（配有滴头）。 2、阿氏（Alsevers）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录。 3、PH7.2、0.01mol/L PBS. 4、高致病性禽流感病毒血凝素抗原和阳性血清以及阴性血清。 二、操作方法 1、血凝（HA）试验（微量法） 1.1在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025ml PBS,换滴头。 1.2吸取0.025ml病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第1孔，混匀。 1.3从第1孔吸取0.025ml病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃之，换滴头。 1.4每孔加入0.025ml PBS。 1.5每孔加入0.025ml体积分数为1％的鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录。 1.6振荡混匀，在室温（20℃～25℃）下静置40min后观察结果（如环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。 1.7结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU)。 2、血凝抑制（HI）试验（微量法） 2.1根据1试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1：256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256除以4）。 2.2在微量反应板的1孔～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。 2.3吸取0.025ml血清加入第1孔，充分混匀后吸取0.025ml加入第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。 2.41孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025ml，室温（约20℃）静置至少30min。 2.5每孔加入0.025ml体积分数为1％的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高，可置4℃条件下进行，对照孔红细胞将呈明显钮扣状沉于孔底。 2.6结果判定 以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。 只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，实验结果才有效。 判定的原理依据：血清中有抗体，且抗体水平越高，则剩余抗原越少，红细胞结合越少，越无凝集，即沉淀下来。 根据农业部医发【2007】1号文件要求： 1.灭活疫苗免疫效果判定：禽流感血凝抑制试验（HI)抗体效价≥24为免疫合格。 2.禽流感弱毒疫苗的免疫效果判定：鸡群免疫抗体转阳率≥50％判定合格。 正常合格为从高浓度到低浓度（即从前到后）红细胞沉积依次减少，完全沉淀为标准，若1～4孔出现不完全沉淀，即凝集现象，即五抗体或抗体水平较低，不合格。反之，5～11孔出现沉淀，则抗体水平较高，出现沉淀的孔越晚，抗体水平越高，合格。 附录： 1、阿氏（Alsevers）液配制：葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g。
病毒的血凝及血凝抑制试验 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求] 4-1）。 弃50 4.结果判定：从静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。 以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32
稀释的病毒液为4个血凝单位。 (二)血球凝集抑制(HI)试验 1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50?L生理盐水。 3.第１孔加被检鸡血清50?L，吹吸混合均匀，吸50?L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50?L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8……；第12孔加新城疫阳性血清50?L，作为血清对照。 4.自第1孔至12孔各加50?L4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照， ）。 附录 1.阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液 枸橼酸钠（5H2O）0.80g 枸橼酸（H2O）0.055g 葡萄糖2.05g 氯化钠0.42g 双蒸水加至100ml
实验二、血凝和血凝抑制试验 实验目的 １血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)，采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。 ２血凝抑制试验：应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒． ３检测实验用鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状态。 ４掌握基本操作技术,了解其实用价值 实验原理： 一些动物红细胞(如鸡、豚鼠等)以及人“O”型血红细胞上有病毒受体，遇相应病毒可产生红细胞凝集现象，简称血凝。若将特异性抗体与病毒(血凝素)预先作用后，抗体与病毒结合，血凝素无法吸附于红细胞表面的受体上，再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制现象。用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为血凝抑制抗体效价。 实验材料 器材：U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头 试剂： 1%鸡红细胞（公鸡）、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生理盐水 实验步骤： 血凝实验 1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul生理盐水 2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。 3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。 4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡，室温静止感作15-30min，每5min观察一次结果。 5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用．实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1∶320，为1个单位，4个单位即为1∶80稀释。正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验。 血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。 鸡红细胞悬液的制备：从静脉或心脏抽取正常健康鸡血，用前以生理盐水洗3次，末次经2000r/min离心10min，将红细胞用生理盐水配成1％浓度。 血凝抑制实验 1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul生理盐水。 2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。 3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡后，室温静止作用5min。 4.在1-12 孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震荡，室温感作15-30min，每5min观察一次结果。 5.观测结果，记录实验数据． 思考问题： 血凝试验中为什么要加补充液？
病毒的血凝及血凝抑制 试验 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】
病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求] 掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。 [材料与试剂] 孔“U”形或“V”形微量反应板，50L定量移液器，滴头，微型振荡器。 2.生理盐水，%鸡红细胞悬液。 3.新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。[实验内容及操作方法] （一）血球凝集(HA)试验 1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。 2.于左侧第1孔加50L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50L 至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L；第12孔为红细胞对照。 3.自右至左依次向各孔加入%鸡红细胞悬液50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。 表4-1病毒血凝试验的操作方法（单位：L）
4.结果判定：从静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。 以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。 (二)血球凝集抑制(HI)试验 1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50L生理盐水。 3.第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8……；第12孔加新城疫阳性血清50L，作为血清对照。 4.自第1孔至12孔各加50L4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min。 5.自第l孔至12孔各加%鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。 表4-2病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）
病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求] 掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。 [材料与试剂] 1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50?L定量移液器，滴头，微型振荡器。 2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。 3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。[实验内容及操作方法] （一）血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50?L生理盐水。 2. 于左侧第1孔加50?L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50?L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50?L；第12孔为红细胞对照。 3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50?L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：?L） 弃50 4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。 (二) 血球凝集抑制(HI)试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50?L生理盐水。 3. 第１孔加被检鸡血清50?L，吹吸混合均匀，吸50?L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50?L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 ……；第12孔加新城疫阳性血清50?L，作为血清对照。 4. 自第1孔至12孔各加50?L 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。
实训九 NDV的血凝及血凝抑制试验（微量法） 目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。 仪器及材料pH7.2生理盐水、1％鸡红细胞悬液、NDV、新城疫病毒待检血清、微量血凝板（96孔V型板）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。 方法与步骤 （一）病毒的血凝（HA）试验 1．1％鸡红细胞悬液的制备 （1）采血先在注射器中吸入抗凝剂（3.8％枸橼酸钠液）1ml，采成年健康鸡血，心脏或静脉采血3-4ml。 （2）离心洗涤共3次，每次2000r/min，5min，每次离心后弃去上清液和白细胞，仅留纯的红细胞，最后读出红细胞的体积。 （3）配制用生理盐水将纯的红细胞稀释成体积比为1%的红细胞悬液。 2．操作术式 振荡1min，室温(18℃～20℃)下作用30～40min,或置37℃恒温培养箱中作用15～30min观察结果 （1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。 （2）NDV病毒液倍比稀释换吸头，吸取50μl病毒液，加于第1孔的生理盐水中，并用移液器吹打3～5次使液体混和均匀，然后取50μl移入第2孔，混匀后取50μl移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。第12孔不加病毒抗原，作盐水对照。 （3）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。
加样完毕，振荡1min ，室温（18～20℃）下作用30～40min ，或37℃恒温箱中作用15～30min ，观察并判定结果。 3．结果判定及记录 完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。 伞 完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。 点 不完全凝集（±）：介于＋与－之间。 病毒的血凝价（或称血凝滴度）：能使一定量红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度，或称血凝价。 （二）病毒的血凝抑制（HI ）试验 采用同样的血凝板，每排孔可测1份血清样品。 1．配制4单位病毒 根据病毒的血凝价，用生理盐水配制4单位病毒。 4单位病毒的稀释倍数＝病毒的血凝滴度/4。 如病毒的血凝价为128（27），则4单位病毒的稀释倍数为32倍（25）。 2．制备被检血清 静脉或心脏采血，不加抗凝剂，待血液完全凝固后自然析出血清或离心获得血清。 3．操作术式 （1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl 。 （2）被检血清倍比稀释 换吸头，取待检血清50μl 置于第１孔的生理盐水中，吹打3～5次混匀，吸出50μl 放入第2孔中，然后依次倍比稀释至第10孔，并将第10孔的液体混匀后取50μl 弃去。第11孔为病毒对照，第12孔为盐水对照。 （3）加4单位病毒 换吸头，用微量移液器吸取稀释好的4单位病毒，向1～11
高致病性禽流感红细胞凝集(HA)与凝集抑制(HI)试验 1.原理：禽流感病毒具有凝集鸡的红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(Hl)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 2.用途：用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定和抗体检测。 3.试剂：禽流感病毒标准抗原、禽流感标准阴、阳性血清、阿氏液、1%的鸡红细胞、pH7.2的磷酸盐缓冲液。 4.设备耗材：普通天平、分析天平、普通离心机、微量振荡器、微量移液器、高压灭菌器、微量移液器、V形血凝反应板、吸头等。 5.操作步骤 6.1血凝试验： 5.L1取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔〜12孔每孔加25μLPBS; 5.L2吸取25μL病毒悬液加入第1孔中，吹打3〜5次充分混匀； 5.L3从第1孔中吸取25uL混匀后的病毒液到第2孔，混匀后吸取251IL加入到第3孔，依次进行倍比稀释至第11孔，最后从第11孔吸取25UL弃之，设定第12孔位PBS对照；每孔再加入25μLPBSo 5.1.4每孔加入25μLl%的鸡红细胞悬液（用前将鸡红细胞悬液充分混匀）；振荡混匀反应混合液，室温（20-25。C）静置40min后观察结果。 5.L5结果判定：在PBS对照出现正确结果的情况下，将反应板
倾斜，观察红细胞是否完全凝集，以完全凝集的病毒最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。 5.2血凝抑制试验： 1.1.11配制4单位抗原：根据血凝试验结果配制4单位抗原，以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4血凝单位抗原即为最高稀释倍数除以4。加入抗原的血凝滴度为1:256,则4HAU抗原的稀释倍数为1:64,即ImI抗原加入到63mlPBS中即为4HAU 抗原； 1.1.2取96孔V形微量反应板，用移液器在第1〜11孔各加入25ULPBS,第12孔加入50ULPBS； 1.1.3第1孔加入25UL新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出25μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μL,第11孔做阴性对照，第12孔为PBS对照。 1.1.4在第1〜11孔各加入25μL4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物充分混匀，室温下（20〜25℃）静置30min;每孔加入25UL1%的红细胞悬液，轻晃混匀后，室温（20〜25℃）静置40min,当PBS对照红细胞呈明显纽扣状沉到孔底判定结果； 1.1.5结果判定： 1.对照孔红细胞呈明显的纽扣状沉到孔底，将反应板倾斜,红细胞星泪滴状流淌，试验成立。 2.完全凝集（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）o 3.根据血凝试验结果配制4HAU的抗原。以完全凝集的病毒最高
血凝抑制试验 1.适用范围 本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。 本标准适用于禽流感抗体的检测（主要适用于血清样品）。 2 血凝试验 2.1 材料与试剂 2.1.1 器材：一般天平、分析天平、一般离心机、微型振荡器、注射器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。 2.2.2 pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，配制方法参见附录A。 2.2.3 1%鸡红细胞悬液，配制方法参见附录B。 2.2.4 阿氏液，配制方法参见附录C。 2.2.5 标准禽流感病毒抗原，购入的标准禽流感病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。若不符，应重复检测并到相关试验室验证。 2.2 操作程序 A. 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1~12孔每孔加25 L PBS，共滴8排，后四排的第1列孔再补加25 L PBS。 B. 吸取25 L标准禽流感抗原加入到第1列孔中，吹打3~5次充分混匀。
C. 从第1列孔吸取25 L混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀 后吸取25L加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最终从第11列孔各吸取25 L弃之，设第12列孔为红细胞对比。 D. 自右向左依次向各孔加入25 L 1%的鸡红细胞悬液。 E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温（20-25℃）静 置45 min后观看结果，若环境温度过高，可于4℃静置60 min，红 细胞对比孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。 2.3 结果判定 A. 在红细胞对比孔消失正确结果的状况下，将反应板作45倾斜，观看红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原 的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。 B. 最终结果取2倍、3倍倍比稀释抗原的血凝滴度的几何平均值。 3 血凝抑制试验 3.1 材料与试剂 3.1.1 器材：一般天平、分析天平、一般离心机、微型振荡器、 煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。 3.1.2 pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法参见附录A。 3.1.3 1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。
鸡新城疫血凝（）和血凝抑制（）抗体水平测定法 1．本次实验的目的和要求 掌握鸡新城疫血凝（）和血凝抑制（）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。 2．实验内容或原理 某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象()。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验()。 3．需用的仪器或试剂等 动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。 器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2聚乙烯塑料管100、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。 药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（）；（3）细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清 4．实验步骤 (1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。 (2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。 （3）免疫机体抗体效价的测定： 3.鸡新城疫（）的和 （1）试验准备 ①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或系冻干苗作为已知抗原，进行试验。 ② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。 红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。 ③被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内(微量法可用孔径2-3毫米塑料管由翅静脉采血)，在室温中静置或离心，待血清析出后使用。