《基因工程》复习重点
第一章绪论
1.克隆：当它作为名词使用时，是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代，或具有相同遗传性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体；当它作为动词使用时，是指从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。因此，基因工程也可称为基因克隆或DNA分子克隆。
2.基因工程诞生于1973年。
3.在现代分子生物学研究领域中，理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用。
1）理论上的三大发现
（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA而不是蛋白质。
（2）50年代明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。
（3）60年代确定了遗传信息的传递方式，即中心法则的建立和遗传密码子的破译。
2）技术上的三大发明
（1）利用限制酶和连接酶体外切割和连接DNA片段。
（2）质粒改造成载体以携带DNA片段克隆。
（3）逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条通路。
4.基因工程：对不同生物的遗传物质--基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体(质粒、噬菌体、病毒等)转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。五个方面的工程技术系统（基因、细胞、酶、微生物发酵、生化工程）是相互依赖、相辅相成的，但系统中基因工程占主导地位。
5.基因工程研究内容包括以下几个主要步骤：
（1）从现有的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等方法，获得带有目的基因的DNA片段。
（2）在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到具有选择标记的载体分子上，形成能够自主复制的重组DNA分子。
（3）将重组DNA分子转移到适宜的受体细胞，并使其一起增殖。
（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。
（5）由筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。
（6）将分离到的目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
6.基因工程的四大要素：目的基因、工具酶、载体、受体。
7.1976年6月23日，美国国立卫生研究院（NIH）正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。
8.我国的基因工程相关法规：
1990年制定《基因工程产品质量控制标准》；1993年发布《基因工程安全管理办法》；
1996年发布《农业生物基因工程安全管理实施办法》；2001年发布《农业转基因生物安全管理条例》
第二章基因工程的理论基础与基本技术
1.操纵子：由几个功能相关的结构基因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位，称为操纵子。如：调节基因、启动子、操纵基因、结构基因共同组成一个操作子。
2.内含子：是一个基因中非编码DNA片段，它分开相邻的外显子。
3.外显子：是一个基因中编码蛋白序列。严格地说，外显子是指保留在初级mRNA中不被剪切掉的区域，包括5’非翻译区(5’UTR)、编码序列和3’非翻译区(3’ UTR)。
4.GT-AG法则：序列分析表明，几乎每个内含子5’端起始的两个碱基都是GT，3’端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和存在的广泛性，有人把它称为GT-AG法则，即5’ GT … AG 3’。
5.卫星DNA：真核生物基因组中高度重复的DNA，有一些20～30bp的极短序列，且以数千个拷贝的串连方式排列，这种序列称为卫星DNA。（在染色体DNA片段的氯化铯密度梯度离心中，由于浮力密度的不同，这种重复序列在主带DNA附近出现的卫星带，因此称之为卫星DNA。）
6.Poly（A）尾巴在基因工程操作中的作用：
A、用Poly（T）作为合成cDNA第一链的引物；
B、用Poly（T）纯化柱从总RNA中分离mRNA。
7.可诱导调节是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。
可阻遏调节是指基因平时都是开启的，处在产生蛋白质和酶的工作过程中，但由于一些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭，阻遏了基因的表达，所以称为可阻遏基因。
8.基因工程操作中应注意的真核生物与原核生物的差异
①基因结构的差异
②启动子和RNA聚合酶的差异
③蛋白质的翻译后修饰加工（前体切割、二硫键、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、软脂化）
④基因表达的调节（表达量）
⑤载体的差异
⑥蛋白质的纯化方便
9.结构基因是可以转录成为各种RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者转录成信使RNA(mRNA)然后翻译成多肽链，最终形成各种功能蛋白质和酶。
从广义上讲，任何一种能够调节或限制其他基因活性的基因都可叫做调节基因，一般情况下则是指基因产物参与调节别的基因活性的基因(如阻遏基因等)。首先转录成mRNA，然后由mRNA翻译成阻遏蛋白质或激活蛋白质，通常也称为转录因子或反式作用因子。它们通常结合到结构基因的非编码区的顺式元件上起调控作用。
10.具有相同遗传信息的个体细胞间其所利用的基因并不相同，有的基因活动是维持细胞基本代谢所必需的，而有的基因则在一些分化细胞或受到外界刺激的细胞中活动。前者称为管家基因，如编码核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖酵解酶等的基因；而后者被称为奢侈基因。
11.假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性的多肽。
12.基因组是指一个生物体、细胞器或病毒的全部基因。原核生物基因组仅由一条环状的双链DNA分子组成，含有一个复制起点，它的基因组就是它的整个染色体。但对于二倍体的高等生物，能维持配子体正常功能的最低数目的一套染色体构成的一个基因组。对于植物细胞而言，则有3个基因组，即染色体基因组(核基因组)、线粒体基因组和叶绿体基因组。
13.碱抽提法提取质粒DNA
（1）原理
DNA双链在强碱条件下变性为DNA单链，而单链在中性条件下又可复性为双链。
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和（或）有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
（2）所用试剂
①溶菌酶【在碱性条件（pH>8）下有活性。】：能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1，4糖苷键。
②葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。
③EDTA：Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。
④NaOH-SDS
NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。
SDS：溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA 酶）变性沉淀。
⑤NaAc-HAc缓冲液（冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8）：用来中和NaOH变性液，使DNA复性。【高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。】
⑥乙醇：用于沉淀DNA。（DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。）
⑦RNase A：降解RNA，以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。
⑧TE缓冲液：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。【Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。】⑨酚-氯仿: 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。
（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。
14.计算DNA浓度：
ssDNA：[ssDNA]=33×（OD260—OD310）×稀释倍数
dsDNA：[dsDNA]=50×（OD260—OD310）×稀释倍数
ssRNA：[ssRNA]=40×（OD260—OD310）×稀释倍数
15.衡量提取DNA 的纯度
OD260/OD280＞1.8 可能有RNA污染
OD260/OD280＜1.8 可能有蛋白质污染
16.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳
迁移率。
17.琼脂糖凝胶电泳的原理：溴化乙锭（EB）是扁平分子，能插入DNA碱基之间，300nm
紫外光照射下能发红色荧光。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。
18.相同分子量的DNA：闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。
19.琼脂糖凝胶的分辨力：空隙大小决定其分辨分子大小的能力。
空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；
空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。
20.影响DNA琼脂糖凝胶电泳迁移率的因素有哪些？
（1）DNA分子的大小。
（2）DNA的构象。
（3）琼脂糖浓度。
（4）溴化乙锭使DNA迁移率下降15%。
（5）电压。
（6）电泳缓冲液的成分及浓度。
21.聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。
（琼脂糖凝胶电泳：分离300—50000bp ；
聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离1—1000bp ）
22.核酸的分子杂交：
Southern blot--用DNA （或RNA ）探针检测DNA 样品。
Northern blot--用DNA （或RNA ）探针检测RNA 样品。
原位杂交--对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。
Polymerase Chain Reaction ）技术是利用酶促反应在体外指导特定DNA 序列扩增的方法，以热变性的双链DNA 分子为模板，利用引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs ）为原料在DNA 聚合酶的作用下大量扩增了特定的DNA 片段。
1986年 H.A. Erilish 从嗜热水生菌分离出耐高温的Taq DNA 聚合酶，代替大肠杆菌DNA 聚合酶Klenow 片段（37℃)，PCR 技术才进入实用阶段。1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA 聚合酶用到PCR 反应中，使PCR 自动循环仪成为可能。
PCR 技术的原理：
引物：人工合成的单链DNA 小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA 双链的5’端相
同。
引物为什么优先与模板互补配对？（浓度高，配对序列短）
PCR 的特点：
（1）特异性强
（2）敏感性高
（3）快速
（4）简便
（5）可以扩增mRNA
Taq DNA 聚合酶的特点：
（1）热稳定性，最适温度高（为75-80℃）；
（2）具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性；（因此不能修
复错误的碱基配对！）
（3）Taq 的PCR 产物3’端往往带有一个A ；
（4）Taq DNA 聚合酶的激活剂，金属离子敏感（尤其是Mg 2+）。
Pfu DNA Polymerase ：有3 ’→5’的外切酶活性，5’ →3’外切酶活性。是目前已发现的所有耐
高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR 产物为平端！
影响 PCR 的因素：
（1）DNA 聚合酶活性
（2）引物 （3）模板（纯度、模板的量）
（4）dNTPs
模板DNA 变性
引物DNA 复性 引物DNA 延伸
（5）Mg 2+的浓度
引物设计应注意的问题有：
1）引物的位置：与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5’端相同）；
2）引物的长度：一般引物设计为长15—30bp；
3）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力，碱基随机分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右；
4）避免形成引物二聚体；
5）避免连续相同碱基排列或内部回文序列；
6）3`端碱基最好选T,C,G而不选A,这样有利于延伸；
7）3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对，5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便于以后操作。
注----引物的Tm值手工计算：Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2
标准的PCR反应体系
100ul 25ul
1. 引物各0.1umol
2. 4种dNTP 各200umol/L
3. 10×buffer 10ul 2.5ul
4. 模板DNA 0.1～2ug 0.025～0.5ug
5. Taq酶 2.5u 0.625u
6. Mg2+ 1.5mmol/L
7. ddH2O 加至100ul 加至25ul
如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。套嵌引物：设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。PCR技术的延伸技术：
（1）荧光实时定量PCR 【Real—time PCR（或TaqMan PCR）】
借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。
Ct值：样品到达阈值水平所经历的循环数。
（2）反向PCR
扩增两个引物外侧的未知序列。
技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子。
（3）不对称PCR
用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。
技术关键：两个引物的浓度相差100倍。
（4）反转录PCR（RT-PCR)
扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。
技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。（5）巢式PCR（Nest-PCR）
（6）原位PCR(in-situ PCR)
（7）锚定PCR（anchored PCR）
定义：扩增已知序列侧翼未知序列的一种PCR方法，未知的3’端添加一同聚物尾（polyG），以互补的同聚物引物（polyC）和按已知序列设计的引物一起作PCR扩增。
关键：利用末端转移酶在未知一端创造引物结合位点。
（8）长片段PCR（Long PCR）
（9）多重PCR（multiplex PCR）
定义：又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。
（10）RAPD【随机扩增多态性DNA (Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记)】
定义：用一个（有时用两个）随机引物（一般6-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。
（11）AFLP【扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP 标记）】
（12）RFLP【限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP 标记）】
（13）SSR
简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）
微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。
（14）ISSR
ISSR（inter-simple sequence repeat）重复序列的间隔序列的扩增
（15）SSCP分析
单链构象多态性分析(Single-Strand Conformation Polymorphism)
PCR技术的应用：
（1）扩增某一段DNA
（2）基因的体外诱变（3）基因组的比较研究
24.双脱氧链终止法
原理：
（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。
（2）脱氧核糖的连接是以3’→5’磷酸二酯键。
（3）复制反应可以在体外进行。
（4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。
（5）各碱基随机终止产生所有不同长度的产物。
（6）根据电泳条带的先后次序，读出合成链碱基序列，互补配对推出模板链碱基序列。
技术要点：
（1）制备单链DNA模板
（2）特殊的DNA多聚酶
①不能有5’→3’和3’→5’的外切酶活性；
②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。
（3）制备2’和3’双脱氧的ddNTP（dNTP / ddNTP = 100 / 1）
（4）制备一小段单链引物（DNA或RNA）
注----化学裂解法读出的序列就是要测的序列。
Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。
第三章基因工程的工具酶
一、限制性核酸内切酶
1.定义：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割
DNA双链的核酸内切酶。
2.限制作用：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定的保护机制。
修饰作用：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA 得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用机制。
3.类型：I 型、II型、III型
4. II型限制性内切酶（分离的第一个酶是Hind Ⅱ）
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与
DNA的来源无关。
（2）切割位点: 识别位点处。
（3）同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。
①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
②不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
（4）同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。
注：同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。（5）如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。EcoR I和BamH I等都有*活性。
（6）Ⅱs型限制性内切酶
移动切割：Ⅱs型限制与修饰系统，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的(不是从识别位点序列中间断裂），长度为4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。
应用：基因表达系列分析技术(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。
任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。
5.命名：
（1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。（2）用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Eco k, Eco R（现在都写成平行，如EcoR I）。（3）如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。
（4）限制酶前面要带上R（R estriction)，
修饰酶前面要带上M（M odification）。（现已省略）。
6.识别序列的长短与切割频率：
识别序列越长，切割频率越小（越短，越大）
7.相邻序列效应：大多数限制性核酸内切酶对只含识别序列的寡核苷酸是不具催化活性。
位点偏爱：不仅侧翼序列长短与限制性核酸内切酶的切割效率有关，而且发现侧翼序列的核苷酸组成与切割效率也有关系。
8.影响限制性内切酶活性的因素
1）DNA的纯度
2）DNA的甲基化程度
3）温度（大多数是37 ℃，少数要求40-65 ℃）
4）缓冲液
9.完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。（通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。）
10.几种常用限制酶识别位点：
二、DNA连接酶
1.两种DNA连接酶：
（1）大肠杆菌连接酶（只能连接粘性末端）
（2）T4噬菌体的连接酶（不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端）
2.连接条件：
（1）必须是两条双链DNA；
（2）DNA 3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）；
（3）需要能量：动物或噬菌体中：ATP
大肠杆菌中：NAD+
3.影响连接反应的因素：
1）插入片段与载体的浓度比例
插入片段浓度高，至少2︰1。
增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。
2）反应温度（一般14~16℃）
三、DNA聚合酶
1.常用的DNA
把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
A、都以dNTP为底物。
B、都需要Mg2+激活。
C、聚合时必须有模板链和具有3’-OH末端的引物链。
5'→3'。
持续合成能力和外切酶活性不同。
2.用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶I 可以切掉N端的5’→3’外切酶活性部分，就成为Klenow fragment。
3.切口平移法：DNA聚合酶I 同时具备5’→3’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性（以及3’→5’外切酶活性）。5’→3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。
4.放射性标记的优点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。
缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害、要求在专门
实验室操作。
5.地高辛的识别——抗地高辛抗体，生物素的识别——亲和素
6.常用的两种偶联酶：辣根过氧化物酶（HRPO）、碱性磷酸酶（AP）
作用：催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光
（或生成有色的产物）。
7.用非放射性标记的探针检测原理：
探针DNA用生物素或地高辛标记。
亲和素或地高辛抗体与酶偶联。
酶催化一个发光或显色反应。
亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。
四、DNA修饰酶
（一）末端脱氧核苷酸转移酶的特性：
①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液；
②不需要模板；
③底物可以是单链DNA、3’—OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以；
④随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。
（二）T4多核苷酸激酶的功能：催化γ磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH
端。不论5’-OH端突出与否。
（三）碱性磷酸酶
1.种类：①细菌性碱性磷酸酶（BAP）：从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。
②小牛肠碱性磷酸酶（CIP）：从小牛肠中纯化出来，SDS中加热68℃可完全失活。
2.特性：催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。
3.功能：防止线性化的载体份子自我连接
（四）S1核酸酶
1.特性：（1）高度单链特异性
（2）反应条件：①低水平Zn2+②pH4.0~4.3
2.功能：（1）催化单链RNA或DNA降解。
（2）切掉双链核酸中的单链区。
（3）降解限制酶切形成的单链突出端。
（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链。
第四章基因工程载体
质粒载体的容量相对较小，受转化率、拷贝数的影响。
M13噬菌体包装DNA分子的能力可达其DNA长度的6倍。6407bp*6
噬菌粒能插入10kb的外源DNA。
λ载体的最大克隆容量是23kb。（实际上为15kb）
柯斯质粒45kb。（最少不能低于30kb）
细菌人工染色体克隆容量可达300kb。
载体的定义
广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
基因工程对载体的要求
（1）具有对受体细胞的可转移性，可提高载体导入受体细胞的效率。
（2）具有与特定受体细胞相适应的复制原点或整合位点，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。
（3）具有多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点)，可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。
（4）具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测。
（5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害。载体的种类
1）按来源基因工程中常用的载体有5类：质粒、单链DNA噬菌体M13、 噬菌体的衍生物、柯斯质粒、动物病毒
2）按功能分：克隆载体--克隆一个基因或DNA片段
表达载体--用于一个基因的蛋白表达
整合载体--把一个基因插入到染色体组中
一、质粒载体
1.质粒：是独立于染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
2.氯化铯密度梯度离心结果
自上而下依次为：蛋白质、ocDNA/L-DNA、cccDNA、RNAs
3.质粒的类型：
1）依据质粒自身传递的性质分类
在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒--能自我转移
非接合型质粒--不能自我转移
2）依据可否引起宿主细胞出现新性状分类
显性质粒：宿主细胞由于含有质粒而获得新性状
隐蔽质粒：宿主细胞含有此类质粒而无异样性状
3）依据质粒的复制特性分类
A. 严紧型质粒（拷贝数少，接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。
B. 松弛型质粒（拷贝数多，非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
4.质粒的不亲和性：
能同寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒。
不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不亲和性质粒或不相容性质粒。
亲缘关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒，如野生型质粒与其衍生的重组质粒往往属于不亲和性质粒。
5.第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1 kb。
6.人工构建的质粒载体的类型
（1）高拷贝数的质粒载体
（2）低拷贝数的质粒载体
（3）失控的质粒载体
（4）插入失活型质粒载体
（5）正选择的质粒载体
（6）表达型质粒载体
7.利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌中进行表达,该质粒载体应具备哪些元件?
1）普通载体元件：复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS
2）大肠杆菌操纵子元件：
阻遏基因I、操纵基因O、启动基因P、核糖体结合位点序列（SD）、
转录终止信号区
8. pBR322：F. B olivar和R.L. R odriguez人工构建载体。
9.蓝白斑选择原理：
1）Xgal
2）β-半乳糖苷酶Xgal显色反应：β-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。
3）lacZ的α肽互补
①α-肽（lacZ’）：
β-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。
②受体菌lacZ突变
受体菌基因组的β-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失α肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。
③载体lacZ’与α互补
pUC质粒载体上的lacZ’编码α肽与这个缺失突变的β-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。
④α互补的插入失活
pUC载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。
4）IPTG的诱导作用
IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ’α肽都表达。从而互补。
但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生α肽！
IPTG诱导的结果：
MCS无插入时，互补，蓝菌斑；MCS有插入时，不互补，白菌斑。
10.穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
11.TA克隆载体：研制出的一种线形质粒，其3’端各带一个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体被称为TA克隆载体。（原理：Taq酶特点）
12.质粒载体增加寄主新陈代谢负荷：①复制负荷②转录和翻译负荷（使寄主细胞生长减缓；丢失质粒的细胞反而会成为优势群体。）
13.原噬菌体：整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。
14.M13噬菌体没有包装限制：M13噬菌体包装DNA分子的能力可达M13DNA长度的6倍。6407bp*6
15.噬菌粒载体：由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。
16.噬菌体展示：将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白
上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。
17.cos 位点：DNA 两端各有12bp 的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos 位点。
18.pBluescript SK/KS （+/-）区分：
SK ：表示lacZ ’的转录方向是沿MCS 上的 S
acI K pnI
KS ：反向（ K pnI S acI ，MCS 相反）
+（f1+）：单链复制起始方向背离lacZ ’，能回收lacZ ’的编码链（+）
-（f1-）：能回收lacZ ’的非编码链（-）
19.噬菌粒载体的包装：
1）辅助噬菌体：自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。
20.λ载体的体外包装
（1）定义：在试管中与λ噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA 注入受体菌中。
（2）λ噬菌体外壳蛋白的合成
E 基因：λ的E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。
D 基因：λ的D 基因的产物也是头部蛋白，但主要与λ DNA 进入头部和头部的成熟有关（只
占20%）。
注----λ噬菌体体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的75%-105%（36—51kb ）之
间。
21.cosmid 载体（粘粒）
1）组成：
①λ DNA ：cos 序列和控制包装的序列。
②pBR322：质粒的复制子；抗药性基因；几个限制性酶的单一位点。
2）特点：
①具有λ噬菌体的特性：
在寄主细胞内形成环化DNA （但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。
克隆外源DNA 后可以体外包装成噬菌体颗粒。
②具有质粒载体的特性：
大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。
③方便的选择：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。
④高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于30kb ）。
3）应用cosmid 载体在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组DNA 技术，叫“柯斯克隆”（cosmid
cloning ）。
理论依据：
①cos 位点：包装识别。
②“多联体”复制：λ噬菌体的生命周期中，会产生数百个λDNA 通过cos 位点连接的“多联
体”
分子。
③Ter体系：在包装的时候，λ噬菌体具有位点特异的末端酶体系（Ter体系），识别cos位点，把多联体切成单个λDNA长度。
④包装限制：两个cos位点之间，必须保持38—45kb的DNA，Ter体系才能识别。野生型
λ
噬菌体DNA的75％——105％。
22.酵母人工染色体（Y AC）的特点：
（1）只能在酵母细胞中扩增。
（2）克隆容量大，为230kb-1700kb。
（3）构建原理，按染色体结构构建。
YAC的组成结构：
（1）着丝粒区（CEN）
（2）端粒（TEL）
（3）复制起点（ORI）
（4）克隆位点
（5）在酵母中的标记基因
（6）在细菌中操作的复制起点ori和抗生素标记Amp r
23.染色体复制和遗传的三个基本组件：
DNA复制起始点（ori）、着丝粒（cen）、两个端粒（tel）
24.F质粒的特点：
（1）单拷贝复制。（2）克隆容量可达300kb。
（3）比较稳定。（4）便于提纯。
第五章目的基因的获取
目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因
1.关于亚磷酸三酯法：
化学合成的方向：3’→5’；
核苷酸单体的磷酸基团在3’端；
亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。
2.寡聚核苷酸化学合成的优点：
1）直接合成基因：①mRNA的含量很低，很难作cDNA
②有些基因比较短，化学合成费用较低
2）合成引物（20mer左右）
3）合成探针序列
4）定点突变合成
5）合成人工接头或衔接物
6）合成DNA芯片
3.衔接物：用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。人工接头：用化学合成法合成的一段不等长双链DNA序列，一头平末端、另一头粘性末端（为某种酶切所产生的粘性末端）。
4.基因文库：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片
段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些
重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。
5.基因组文库的大小：
一个文库要包含99%的基因组DNA 时所需要的克隆数目。
P ：文库包含了整个基因组DNA 的概率（99%）
F ：插入载体的DNA 片段的平均长度占整个基因组DNA 的百分数
N ：所需的重组载体数（克隆数）
文库的查询：
用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot 杂交。
6.cDNA ：以mRNA 为模板逆转录出的DNA 。
cDNA library ：利用某种生物的总mRNA 合成cDNA ，再将这些cDNA 与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA 文库。
7.cDNA 文库的特点：
（1）不含内含子序列。
（2）可以在细菌中直接表达。
（3）包含了所有编码蛋白质的基因。
（4）比DNA 文库小的多，容易构建。
cDNA 文库的大小：一个cDNA 文库要包含99%的mRNA 时所需要的克隆数目。
P ：文库包含了完整mRNA 的概率（99%）
1/n ：某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA 占细胞整个mRNA 的比例
N ：所需的重组载体数（克隆数）
8.cDNA 的合成：
① cDNA 第一链合成
逆转录酶能以RNA 为模板合成DNA 。用Oligo dT （或随机引物）作引物，合成cDNA 的第一链。
② 降解mRNA 模板
用碱处理或用RNaseH 降解mRNA-DNA 杂交分子中的mRNA 。
③ cDNA 第二链合成
剩下的cDNA 单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA 链的引物。用DNA 聚合酶合成第二链DNA.。
④ 去掉发卡结构
用核酸酶S1可切掉发卡结构（会导致cDNA 中有用的序列被切掉）。
9.妙用RNaseH
这种酶能识别mRNA-cDNA 杂交分子中的mRNA ，并将其降解成许多小片段。小片段正好成为DNA 聚合酶的引物，用来合成冈崎片段。
DNA Pol I 除去引物并修补后再使用DNA 连接酶连成一整条DNA 链。
10. mRNA 消解杂交
原理：羟基磷灰石柱
结合DNA-RNA 或DNA-DNA 双链，不结合单链DNA 。 N= ln (1-p)
ln (1-1/n) N= ln (1-p)
ln (1-f )
从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。
将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。
不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。
用羟基磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。
11.mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）
（1）3’端的锚定引物
Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。
（2）12种锚定引物
（3）5’端的随机引物
（4）随机引物与锚定引物成对扩增
（5）随机--锚定引物PCR的产物电泳比较
不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步PCR 作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。
12.cDNA差示分析法：
1）cDNA模板制备；
2）用DpnⅡSau 3A分别消化两组cDNA，再接上接头R，经补平末端后作为下一步PCR扩增的模板；
3）加入根据R设计的一对引物，利用PCR技术使两组的cDNA片段得以富集后，再用Dpn ⅡSau 3A去除cDNA两端的R；
4）消减杂交。将上一步获得的tester的cDNA接上新的接头J，按tester:driver为1：100的比例混合两组cDNA，在一定的反应体系中解链并进行充分的杂交反应，这样便有3种形式的杂交体形成，即①A driver：driver②B driver：tester③C tester：tester；
5）利用PCR反应使tester的特异基因得以富集。A不能扩增、B线性扩增、C 指数扩增。
13.盒式PCR（Cassette PCR）是利用Cassette(人工合成的带有适当限制性内切酶粘末端较长的双链DNA分子)和Cassette上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法。
14.RACE技术
RACE（Rapid Amplification of cDNA ends）是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA 第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3`或5`之间的未知序列的方法,分别称为3’-RACE或5’-RACE。
锚定(Anchored PCR)和反向PCR都可以用于RACE技术，经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计的，而高特异性的RACE是借助于反向PCR技术。
15.转座子标签法
转座子是一类可以在同一条染色体不同位点或不同染色体间转移的一段特殊的DNA。
16.图位克隆法：根据目的基因在基因组上的位置特性而不是其编码产物来进行基因克隆。
17.染色体步移：利用与目的基因紧密连锁的标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆的DNA片段的末端DNA为探针继续筛选，如此进行下去，直到获得含目的基因两侧序列为止。
18.染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃或因为基因组的复杂性高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。如能找到与目的基因的物理距离小于基因组文库的平均插入片段的长度的紧密连锁的分子标记，就可以通过筛库直接获得含目的基因的大片段克隆，接着从中分离出目的基因。这样就完全避开了步移，这种方法称为染色体登陆。
19.酵母双杂交系统
1）作用：有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质
2）原理：
①结构域（Domain）合作：
许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4；实验发现--只要DNA binding domain（DNA-BD）与Active domain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。
②拆开Domain：用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因
的能力。
③重组Domain：
用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。
④观察报告基因表达：通过效应基因是否被激活来检查：在体内，蛋白A与蛋白B是否能
结合。
Ⅰ.如果蛋白A与蛋白B不能相互结合
GAL4的DB domain与AD Domain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。Ⅱ.如果蛋白A与蛋白B能相互结合
GAL4的DB domain与AD Domain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。
第六章基因的重组与转移
一、齐平末端的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接；T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的10%。
2. 人工加尾形成“粘性末端”
（1）同聚加尾法
①原理：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补：分别给载体和插入片段加上互补的核苷酸。
（2）衔接物(linker)连接
①linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。
②linker的作用：用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性
末端。
（3）DNA接头(adapter)连接法
①adapter：一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。
②adapter的作用：用T4DNA连接酶连到平端DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。
二、PCR产物的连接
1. 在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则：符合载体的多克隆位点；避免与所扩增的DNA片段内部酶切位点重复。（2）带酶切位点的引物的结构：3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp起保护碱基作用）
2. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A
（2）平末端载体两个3’端各加一个T
三、DNA体外连接应注意的事项
1.插入片段与载体的酶切位点互补
相同的粘性末端才能有效地连接；尽量避免平端连接；决不能进行非粘性末端连接。
2. DNA插入的方向正确
用双酶切：由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。
3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确
（1）DNA定向插入
（2）起始密码：尤其当载体上有A TG起始密码的时候，更要注意。
4. 防止载体自身环化连接
（1）提高插入片段的用量（2）用碱性磷酸酶处理载体
四、感受态大肠杆菌的制备
1.目的：增加受体菌细胞膜的通透性。
2.菌种：使用丧失了限制体系的大肠杆菌。
3.制备原理：用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
4.制备过程（了解）
五、重组DNA导入大肠杆菌
1.外源DNA导入细菌的几种方法：
（1）转化（transformation）：大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。
（2）转染（transfection）：大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。
（3）转导（transduction）：借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。
2.转化率：每μgDNA转化成功的细菌克隆数。
3.转化方法：（1）热休克法：简单，但转化效率不高
（2）电转化法：转化效率高
六、感受态细胞
（1）生长状态：制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
（2）必须在冰冷的条件下制备。
（3）CaCl2处理：要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。
（4）储存感受态菌要在-70℃以下。
（5）使用感受态菌时必须梯度融化。（融化后一般不能再次冻存使用）
七、cI857基因突变的λ噬菌体
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，λDNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。
但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。S和R是控制寄主细菌发生溶菌作用的两个基因，故称溶菌基因。
八、互补型噬菌体
在cI857基因突变的λ噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型λ噬菌体。
λ噬菌体1：外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。
λ噬菌体2：外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
九、导入植物细胞
1.叶盘法
2.电击法
3.基因枪法
十、导入哺乳动物细胞
1.磷酸钙沉淀法
2.脂质体载体法
3.显微注射法
4. DEAE---葡萄糖转染法
5.病毒介导
第七章重组体克隆的筛选和鉴定
一、pBR322抗菌素标记选择
1.四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。
2.氨苄青霉素抗性基因：
产生β-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（蓝灰色）褪色。
3.环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
注：如果在Tet r上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tet r失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tet r不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。
二、β-半乳糖苷酶显色反应选择法
原理：载体上有一段β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的α片段（氨基端），其上有外源DNA 的插入位点。受体菌基因组中有突变的β-半乳糖苷酶基因（α片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的β-半乳糖苷酶。
三、根据插入基因的表型选择
1.弥补缺陷
2.增加新性状
四、DNA电泳检测法
1.直接电泳检测法
2.酶切电泳筛选法
五、PCR扩增检测法
1.原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。
2.过程：（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。
（2）用外源DNA插入片段引物作PCR。
（3）电泳PCR产物。
（4）检查是否有PCR产物。
（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
六、核酸杂交检测法
1. Southern blotting
2. Northern blotting
3.原位杂交
4.R-环检测法
原位杂交筛选的特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。
R-环检测法：
1）R-环：是指RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA 单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构。
2）原理：DNA-RNA杂交。
3）选择过程：用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见R-环形结构。
七、免疫化学检测法
对表达产物的检测：蛋白——蛋白“杂交”；
免疫沉淀检测法：抗原—抗体凝集反应，形成“沉淀圈”；
酶联免疫吸附测定（ELISA）；
免疫印迹（western blotting）法。
八、转译筛选法
适用于mRNA转录丰度高的外源基因。
无细胞翻译系统：能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。
1.杂交抑制转译法
原理：mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。
2.杂交释放转译法
原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。
九、DNA-蛋白质相互作用筛选法
专门设计特异DNA探针，检测能同该DNA结合的蛋白质因子。
十、凝胶阻滞试验
又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单快捷，是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。
在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也就相在缩短了。所以当特定的DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。
十一、DNasel足迹试验
尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的DNA蛋白质之间相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准确部位。要解答这个问题，则需要应用DNasel足迹试验。它是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。
十二、哺乳动物基因转移的选择标记
1.胸苷激酶（tk）
2.二氢叶酸还原酶基因（DHFR）
3.新霉素抗性基因（neo r）G418（geneticin）
4.氯霉素乙酰转移酶（CAT）
注----HAT培养基：含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(h ypoxanthine，a minopterin，
t hiymidine）
第八章基因工程相关技术
1.RNAi （RNA interference）：将与内源性mRNA 互补的dsRNA导入细胞后,引起该mRNA
特异性的降解，导致mRNA 编码的基因不能表达，发生基因沉默。
2.基因芯片（gene chip）或DNA芯片（DNA chip）：实质上是在固体支持物上高密度排列的
DNA片段或寡核酸，所以又称DNA微阵列或寡核苷酸微阵列。
DNA芯片的主要类型：
按制备方式分为
1）原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡
核苷酸而制备的芯片。探针较短。
2）DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有
序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活。
DNA芯片的功能：
1）DNA测序：杂交测序（SBH）；
2）基因表达分析；
3）基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析；
4）基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达；5）药物研究与开发。
第九章克隆基因的表达
1.基因工程最佳启动子必须具备的条件：
①必须是一种强启动子；
能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。
②应呈现低水平的基础转录；
便于表达毒性蛋白等。
③应是可诱导型的；
用温度或化学试剂诱导。
2.常用的原核启动子：
（1）乳糖启动子lac
（2）色氨酸启动子trp
（3）PL和PR启动子
（4）Tac 和Trc启动子
Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构建而成的杂合启动子，-35区为Trp启动子顺序，-10为LacUV5启动子顺序，二者之间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。（5）T7启动子
3.包涵体：是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的
晶体结构物。
4.周质：格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。
5.表达融合蛋白的优点：
（1）融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。
（2）如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
简述Southern blot,northern blot,western blot的原理，比较它们的不同. 答：Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。DNA => 琼脂糖电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或显色Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 mRNA提取=> 甲醛变性电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或化学发光 Western Blot 与 Southern Blot或 Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 不同：所用于分析的对象不同。 Northern杂交用于分析RNA； Southern杂交用于分析DNA； Western杂交用于分析蛋白质。 转基因动物与转基因植物的产生有什么不同？ 答：技术原理相同，用转基因技术将具体特殊经济价格的外源基因导入动植物体内，不但表达出人类所需要的优良性状（如抗虫，抗病，抗除草剂，抗倒伏，产肉，产蛋量高）,还可以通过蛋白质重新组合得到新的品种。但是，对动物和植物进行目的基因导入的方法不同。动物一般采用显微注射法将带有目的基因的病毒注入细胞；而植物一般采用农杆菌转化法或基因枪法将目的基因导入受体细胞。
5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 （时间：90分钟分数：100分） 一．选择题（本大题包括25题，每题2分，共50分。每题只有一个选项符合题意。） 1．以下说法正确的是（） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B．质粒是基因工程中惟一的运载体 C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不．相符的是（） A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B．植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C．植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3．有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4．能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是（） A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养人的B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6．PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7．以下对DNA的描述，错误的是（） A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（） A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9．细胞工程的发展所依赖的理论基础是（） A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10．下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是：（） A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11．在以下4种细胞工程技术中，培育出的新个体中，体内遗传物质均来自一个亲本的是（） A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12．动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是（） A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13．下列哪一项属于克隆（） A．将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B．将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C．将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
第一章基因克隆 基因工程的基本技术有哪些？ 答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。 构建基因文库一般使用什么作为载体？ 答：一般使用大肠杆菌作为载体 克隆与亚克隆？ 答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？ 答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。 第二章分子克隆工具酶 限制与修饰系统？ 答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。 使用最广泛的限制酶？ 答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶 限制性内切酶的命名？ 答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。 如：HindIII 限制与修饰系统分类？ 答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。 限制酶识别的序列长度？结构？
答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列 限制酶产生的末端？ 答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端 什么是同裂酶？分类？ 答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他 限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？ 答： 什么是同尾酶？ 答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。 酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？ 答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。 酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。 什么星星活性？抑制其发生的办法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。 影响酶活性的因素有？ 答：可分为内因和外因 外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。 内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋） 原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？ 答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
专题一基因工程单元测试 A卷 一、选择题(共50分) 1．限制性内切酶的特点是( ) A．只能识别GAATTC序列 B．识别特定的核苷酸序列和具有特定的酶切位点 C．识别黏性末端 D．切割质粒DNA的标记基因 2．上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转基因牛，可以想象这头牛( ) A．发生了基因突变 B．发生了染色体变异 C．发生了基因重组 D．没发生可遗传的变异 3．“工程菌”是指( ) A．用物理或化学方法诱发菌类自身某些基因得到高效表达的菌类细胞株系 B．用遗传工程的方法，把相同种类不同株系的菌类通过杂交得到的新细胞株系 C．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 D．从自然界中选择出的能迅速增殖的菌类 4．基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备的四个必要条件是( ) A．目的基因限制性内切酶运载体受体细胞 B．重组DNA RNA聚合酶内切酶连接酶 C．模板DNA信使RNA质粒受体细胞 D．工具酶目的基因运载体受体细胞 5．用DNA限制酶切割DNA时识别的核苷酸序列和切口是( ) A．一种限制酶只识别一种核苷酸序列，有专一性酶切位点 B．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列不同 C．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列相同，但酶切位点不同 D．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列和酶切位点都不同 6．根据mRNA的信息推出并获取目的基因的方法是( ) A．用DNA探针测出目的基因 B．用mRNA探针测出目的基因 C．用mRNA反转录形成目的基因 D．用PCR技术扩增mRNA 7．在人类染色体DNA不表达的碱基对中，有一部分是串联重复的短序列，它们在个体之间具有显著的差异性，这种短序列可用于( ) A．生产基因工程药物 B．侦查罪犯 C．遗传病的产前诊断
生物实训实验报告 篇一：细胞生物学实验社会实践报告 建立一个动物细胞培养室与植物细胞培养室所需的条件与社会价值 无菌环境是细胞离体培养的最基本条件，所以构建一个细胞培养室需要保证工作环境不受微生物和其他有害物质污染，并且干燥无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室。 一、基础实验室配置 ⑴消毒间：消毒间主要为了处理实验器材以及实验材料，营造一个无菌的试验环境，一般消毒间会配备超净实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉、酸缸等。 ⑵无菌操作间：一般由缓冲间和操作间两部分组成。缓冲间在外侧，多用于实验之前的准备，例如：更衣，准备实验材料，处理实验数据等，可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等。工作人员进入操作间一定要消毒并更衣。 （3）培养基配制间：主要用于配置细胞培养所用的培养基。主要包括冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、
药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。 （4）培养室：用于培养细胞，放置以接种的培养基等。为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺 设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。 （5）洗涤间：主要用于清洗实验之后的用具。除配置水槽外，还需配置洗液皿、落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等，有需求的还可以配置洗瓶机。 以上基础设施若实验室条件不够，可将消毒间，培养基配制间，洗涤间合并一起，但注意实验室卫生以及仪器摆放，房间要保持清洁，明亮。 二、辅助实验室 细胞学鉴定室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。 生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分
质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝 松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 优点;①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 ②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 ③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 蓝白斑筛选的机理 由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色 诱导培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。 这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做 -互补 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提 取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用方法：1. 等电点沉淀法2. 盐析法 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析 蛋白筛选（SDS）实验原理是：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD～200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。