一、名词解释
1.星号活性：在非标准条件下，有些内切酶可在与其识别序列相似但不完全相同的位点发生切割反应。这
种非特异性的切割即所谓的“星号活性”。
2.质粒的不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳
定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。
3.SD序列：存在于原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处的一种4-7个核苷酸的保守序列，它与
16SrRNA3’端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译。
4.启动子：是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而确保转录精确而有效地起始的DNA序列，通常位于基
因上游。能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。
5.转录终止子：在一个基因的3′端或是一个操纵子的3′端往往还有一特定的核苷酸序列，是为转录提供
终止信号的一段DNA序列，是基因表达的顺式作用负调控元件。
6.多克隆位点：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段，以方便
外源DNA片段的插入。现在几乎所有的载体都含有一个人工合成的密集排列的系列克隆位点，称为多克隆位点。
7.Southern杂交：通过毛细管作用、电转移、真空转膜等方法，使在凝胶电泳中已分离的DNA片段转移
并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段，称为DNA印迹杂交技术。又称为Southern杂交。
8.northern杂交：又称为RNA印迹法，是将RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤
维素滤膜上，用同位素或生物素标记的DNA或RNA特异探针针对固定于膜上的mRNA进行杂交，洗脱除去非特异性杂交信号，对杂交信号进行分析，以确定目的基因的表达组织。
9.western杂交：Western杂交亦称蛋白质免疫印迹，即通过将SDS-PAGE分离后的蛋白质组分转移到固定
化基质上，再以免疫学方法用特异性抗体分析靶蛋白的存在及其含量，是将蛋白质电泳、印记、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
10.转化：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。
11.转化率：是每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数，是衡量转化效率的重要指标。
12.感受态细胞：作为受体细胞的细菌经一定处理(如冰冷的CaCl2溶液）后处于易于接受外源DNA的状态。
13.转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞即通过转化方式而形成的杂种后代称为转化子。
14.重组子：经转化获得外源遗传物质的细胞，即含有重组DNA分子的转化子被称为重组子，是向有功能缺
陷的细胞补充相应功能。
15.OD600：OD600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应
地与样品的透过率T值成反比，在数值上来说，它们之间是对数关系。
16.粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过
互补碱基间的配对而重新环化起来。
17.平末端：限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割形成的片段末端，切口是平整的，所以被称为平
末端。
18.限制性核酸内切酶：简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA
双链结构的内切核酸水解酶。
19.限制修饰系统：大多数限制性内切酶常常伴随有1-2种修饰酶，后者能保护细胞自身的DNA不被限制性
内切酶破坏，修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。甲基化所形成的甲基基团能伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用。
20.同裂酶：又称同切点酶，是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。
21.同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生
相同的粘性末端。
22.DNA连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二
酯键，使两末端连接的一种核酸酶。
23.DNA聚合酶：能在引物和模板存在下，把单个脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3，-OH
末端，催化核苷酸聚合作用的酶。因为它以DNA为模板，所以又被称为依赖于DNA的DNA聚合酶。不同种类的DNA聚合酶可能参与DNA的复制或修复。
24.反转录酶：是依赖于RNA的DNA聚合酶，或称为RNA指导的DNA聚合酶，是分子克隆中重要的核酸酶之
一。产物DNA又称cDNA，即互补DNA。
25.人工染色体：染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染
色体载体，其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体媲美。应用最广的有细菌人工染色体（BACs）和酵母人工染色体（YACs）。
26.PCR：又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术。是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。前提条
件是已知待扩增目的基因的序列，合成反应必需的双引物。
27.引物：指一段较短的单链RNA或DNA，它能与DNA的一条链配对提供游离的3，-羟基末端以作为DNA聚
合酶合成脱氧核苷酸链的起始点。其本质是单链DNA。
28.简并引物：由于一个氨基酸可以对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序
列，称之为简并序列。相应合成这一段序列作PCR扩增体系的引物即为简并引物。
29.引物步移：在待测DNA片段中，如果知道部分核苷酸序列，可以根据该已知序列设计引物来测定其相邻
部位的序列，并依此类推，这种测序策略称为引物步移。
30.基因库：（天然存在的）特定生物体全基因组的集合。
31.基因文库：某种特定的生物所含有的能够包含所有基因的足够数目的克隆的集合。将生物材料的基因组
DNA或cDNA片段化，然后与特定的载体连接导入宿主菌形成包含目的基因在内的DNA片段的克隆群。
32.基因组文库：是将某一生物基因组DNA片段全部克隆后所获得的重组子群体的总称。
33.cDNA文库：是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，
在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。
34.DNA体外重组：将外源DNA用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上形成重组DNA。
35.感受态细胞：是指处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。
36.亲和层析：亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别和结合能力建立起来的分离纯化方法，
把带纯化蛋白质的特异配体公共价连接到载体上，将此载体装入层析柱，对蛋白质混合物进行柱层析时，待纯化的蛋白质与配体特异结合，吸附在层析柱上，而其他的杂蛋白必能被吸附，通过洗脱可以除去。
最后用含游离配体的溶液，或用改变了pH或离子强度的溶液将与配体结合的蛋白质洗脱下来。
37. 互补：质粒DNA编码β-半乳糖苷酶的α亚基，在这一编码区中插入有一个多克隆位点，它并不破坏读
框，但可使少数几个氨基酸插入到LacZ酶的氨基端，而不影响功能；宿主细胞可编码LacZ酶C端的β亚基。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α-互补
宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α-互补。
在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有B－半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码序列；在这一编码区中插入有一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到LacZ酶的氨基端，而不影响功能；宿主细胞可编码LacZ酶C端部分序列。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。
由α互补而产生的活性蛋白质在诱导物IPTG的存在下可与生色底物X-gal反应，因此Lac＋细菌在含X-gal和IPTG的培养基上可形成蓝色菌落，易于识别。当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无α互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
二、填空题
1、基因工程的三大基本条件包括目的基因、载体和受体细胞。
2、分子克隆中，把识别序列相同的核酸内切酶称为同裂酶，把识别序列不同但切割后产生相同的末端结构
的酶称为同尾酶。
3、连接酶（ligase）是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸合成酶。
4、就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分：复制子（复制起始位点）、
筛选标记（抗性基因）、克隆位点（MCS便于外源DNA插入）。
5、PCR实验中一般包括高温变性、低温退火和适温延伸三个核心步骤。
6、DNA连接酶是基因克隆的分子黏合剂，而限制性核酸内切酶被誉为分子克隆的剪刀。
7、Ti质粒是自然界存在的植物基因工程的天然载体。
8、按照人们的意愿，改变基因中特定碱基的组成，以达到基因突变的技术称为定点突变。
9、核酸杂交探针可分为两大类：DNA探针和RNA探针。其中DNA探针又分为基因组DNA探针和cDNA探针。
10、根据构建方法和操作对象的不同，基因文库主要包括基因组文库和cDNA文库两类。
11、限制性内切核酸酶通常保存在50%浓度的甘油溶液中。
12、基因工程中有三种主要类型的载体：质粒载体、噬菌体载体、质粒和噬菌体杂合载体，其中天然载体
主要有质粒载体和噬菌体载体两大类。
13、Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端A的双链DNA
分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的T载体。
14、含有多种限制性内切核酸酶识别序列的DNA片段称为多克隆位点MCS。
15、一个完整的DNA克隆过程应包括目的基因的获取、载体的选择与构建、目的基因与载体的拼接、重组
体导入受体细胞、筛选与鉴定出重组子。
三、判断题
1、DNA聚合酶I的Klenow片段是丧失了聚合酶3’→5’的外切酶活性。F
2、密码的偏爱性是指不同种属的生物对简并密码具有不同的使用频率。T
3、若某质粒带有lacZ标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入X-gal。T
4、限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。F
5、DNA分子电泳过程中移动速度的大小只与其分子量相关，与构象无关。F
6、用同一种酶切割载体和外源DNA得到黏性末端后，为防止它们自身环化，要用CIP将它们脱磷酸。F
7、迄今发现的质粒DNA都是环状的。F
8、所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。T
9、大量制备已被克隆基因编码蛋白质产物的常用方法是体外转录和翻译。F
10、由于基因工程菌中重组质粒不稳定，常常加入抗生素等物质维持筛选压力。F
11、迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA，又能作用于单链DNA。F
12、所谓引物就是同DNA互补的一小段RNA或DNA分子。F
13、基因工程中使用的II类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性。F
14、甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，这是导致一些酶的星活性的主要原因之一，防止
的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在5％以下。T
15、Northern印迹和Southern印迹的基本原理是一样的，都是用于检测结构基因的表达。F
16、PCR既能用于扩增任何天然存在的核苷酸序列，又能重新设计任何天然核苷酸序列的两个末端。因此，
任意两个天然存在的DNA序列都能快速有效的扩增，并拼接在一起。T
17、用不同的产生黏性末端的限制性内切核酸酶分别切割载体和外源DNA，得到的黏性末端是不亲和的黏性
末端。F
18、根据某一感兴趣蛋白质的序列、抗原性以及配基结合性质制备探针，可从DNA文库中筛选到相应的基
因。T
四、问答题
1.克隆载体与表达载体有哪些异同点？
答：同：1）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以携带外源基因进入受体细胞；
2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；
3）具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；
4）具有合适的筛选标记。
异：1）表达载体在克隆载体的基础上又增加了基因表达的调控元件：即启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号（区分二者的标志）
2）克隆载体在菌体中一般是多拷贝的，而表达载体一般是低拷贝的。
2.什么是限制性内切酶，怎么命名？
答：限制性内切酶是能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA双链的核酸内切酶。
限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号。
⑴基本原则:3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号。
⑵首字母:取属名的第一个字母,且斜体大写;
⑶第二字母:取种名的第一个字母,斜体小写;
⑷第三字母:①取种名的第二个字母,斜体小写;②若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.
⑸第四字母:若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体.
顺序号:若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.
3.简述PCR的反应步骤及原理？
原理：PCR技术是以DNA互补链的聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交，由DNA聚合酶催化引物延伸,最终获得特异DNA片段的体外扩增方法。
PCR反应体系：
①模板：待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也可是单链DNA。
②引物：是DNA复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。
③DNA聚合酶：DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。
④dNTP：DNA合成的底物。
步骤：
①变性：系统加热至92℃-96℃，使dsDNA解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质；
②退火：降温至37℃-72℃，使引物与模板的互补区相结合；
③延伸：在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3‘-OH端，合成DNA；
④这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA 片段。
4.什么是cDNA文库，同基因组文库有何差别？
cDNA文库是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。
差别：
①生物的cDNA文库有其组织和发育时期的特异性。在某一特定发育阶段和特定组织中，并非所有的基因都
能表达，通常得以表达的基因仅占基因总数的少部分。
②在指定cDNA文库时往往要指定其来源的组织和时期。
③cDNA文库是从mRNA出发分离目的基因，大大地缩小了搜寻分离功能基因的范围，同时分离的cDNA克隆
由于不含内含子，其序列可以给出蛋白质序列信息，对于功能基因研究更为方便。
5.什么是western杂交，它与southern杂交有什么不同？
Western杂交：亦称蛋白质免疫印迹，即通过将SDS-PAGE分离后的蛋白质组分转移到固定化基质上，再以免疫学方法用特异性抗体分析靶蛋白的存在及其含量，是将蛋白质电泳、印记、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
Southern杂交：通过毛细管作用、电转移、真空转膜等方法，使在凝胶电泳中已分离的DNA片段转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段，称为DNA 印迹杂交技术
由上述内容可知，Western杂交的总体过程与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是DNA。
6.简述基因工程的主要研究内容。
1)目的基因或含有目的基因的DNA片段的分离
利用限制性核酸内切酶切割获得特定的目的基因。
获得目的基因的方法：PCR、构建基因组文库与基因分离、构建cDNA文库、根据基因差异表达获得、基因的化学合成。
2)体外DNA的重组(载体分子+DNA片段+标记基因)
将外源DNA用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上形成重组DNA，重组DNA包括载体分子、DNA 片段和标记基因这几部分。
3)转化(体外重组DNA对寄主细胞的转化)
将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型，这种通过转化方式而形成的杂种后代称为转化子。
4)重组体克隆的筛选：载体表型选择法、根据插入基因的表型选择法、DNA电泳、PCR、核酸杂交、免疫
化学检测法、DNA序列分析、
5)重组克隆中的目的基因的鉴定：Southern杂交和northern杂交
6)目的基因的功能鉴定：western杂交，以及根据外源基因在受体细胞中的表达来鉴定。
7.质粒载体具有哪些基本特性？
（1）自主复制
质粒DNA上都含有一个复制起始区，控制着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。（2）不相容性
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质粒。
（3）转移性
接合型质粒:能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；
非接合型质粒:不能在自然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。
（4）编码性状
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。载体的基本特性：
①具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)；
②具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；
③具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；
④具有较高的外源DNA的载装能力；
⑤具有合适的筛选标记。
8.什么是蓝白斑筛选法？
当外源DNA插入到载体lacZ标记基因上，导致β—半乳糖苷酶基因失活，可通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-ITPG培养基中的颜色变化来直接观察出来。
β—半乳糖苷酶可把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，由于基因的互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，在含有5-溴-4-氯-3-引哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和IPTG的平板上形成浅蓝色的噬菌斑。
而当外源DNA插入到载体lacZ标记基因内部的多克隆位点上，可阻断该基因的读码结构，使其编码的α肽失去活性，结果产生出白色的噬菌斑。因此，根据这种半乳糖苷酶的显色反应，便可检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。
9.什么是限制与修饰系统，有什么意义？
限制修饰系统：大多数限制性内切酶常常伴随有1-2种修饰酶，后者能保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏，修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。甲基化所形成的甲基基团能伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用。
（1）限制：细菌为防御外来DNA入侵而将其降解的现象。（一般由限制酶来降解外源DNA)修饰：细菌为防止自身DNA被降解而修饰自身DNA。(一般由甲基化酶进行修饰）（2）意义：这种限制系统可排除外来的DNA而自身的DNA由于甲基化，不能被限制酶切割。
10.微生物基因工程的应用有哪些？
微生物基因工程是基因工程的重要内容，也是其应用的重要领域。从内容而言，微生物基因工程主要从两个方面来展开：1.对生物遗传性状的改良，获得性状更优的微生物；2。生产组蛋白、多肽或抗生素等次生代谢物。
（一）在农业领域的应用
1.在生物农药开发上的应用：基因工程微生物杀虫剂；基因工程杀菌剂；生物除草剂。
2.在生物肥料上的开发应用
nifA基因突变会导致固氮酶失活，在根瘤菌中引入多拷贝的该基因，可提高固氮能力，在基因改造中，可设法提高根瘤菌固氮相关固氮酶等基因的表达水平。
3.饲料开发上的应用
植酸酶可提高饲料的利用率，降低成本，构建高效表达植酸酶的重组酵母，并以此生产产品。
（二）工业领域
1.乳酸菌发酵基因工程菌
2.食品添加剂基因工程：氨基酸生产菌得改造，氨基酸可做氧化剂、增鲜剂；合成L-抗坏血酸的重组菌。
3.酶制剂工程菌：对酶基因修饰改造，设计新的酶基因，创造新酶种。
4.酿酒酵母工程菌构建
（三）药物生产上的应用
1.生产蛋白类药物：大肠杆菌高效表达在医用蛋白生产中作用巨大。
2.生产抗生素：提高产量和效率
（四）环境保护上的应用
1.农业残留、有毒物质的降解工程菌
2.石油产品的微生物降解
3.造纸去污、生物降解塑料工程菌
4．清除放射性环境废物的基因工程菌
5．在废弃物资源化和环境保护中的应用
五、论述题
法制备大肠杆菌感受态细胞及其转化外源DNA的原理，说一说影响转化效率的主要影响因素。
1.论述CaCl
2
（一）原理：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌等)，Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。感受态允许DNA分子进入，进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细
胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子
（二）影响因素：
1.载体及DNA重组分子方面：
①载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同；
②载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其
转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级；
③插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。
2.受体细胞方面：
受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。
3.转化方法方面：
①受体细胞的预处理：影响最大
②供受体的比例：Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ng DNA
原生质体转化109个原生质体50ng DNA
③转化方法：Ca2+诱导转化106-107/mg DNA
原生质体转化105-106/mg DNA
λ-DNA转染107-108/mg DNA
电穿孔转化106-109/mg DNA
3.论述Southern杂交的基本原理和实验操作过程，讲一讲其与northern杂交有什么不同。
（1）原理：通过毛细管作用、电转移、真空转膜等方法，使在凝胶电泳中已分离的DNA片段转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段，称为DNA 印迹杂交技术。
（2）实验操作过程：
①DNA的片段化及其电泳分离
②凝胶电泳后的变性处理：在0.4N NaOH碱性条件下变性，使双链DNA分子变成单链。再在1.5M NaCl/1M Tris （pH7.4）条件下中和使DNA仍保持单链状态。
③转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
④杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
杂交：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。
⑤检测与分析
通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。
（3）不同
Northern杂交与Southern杂交原理和方法相似，所不同的是它所用的是总RNA或mRNA作为分析材料，一般无需进行限制性内切核酸酶酶切，直接通过变性（用甲醛、乙二醇，防止RNA形成二级结构）琼脂糖凝胶电泳分离RNA或mRNA，再将分离的RNA或mRNA印迹到硝酸纤维膜和尼龙膜上。
3.假设你有一株含有绿色荧光蛋白基因gfp的细菌菌株，且获得了该gfp基因的序列，现需要在大肠杆菌中表达并纯化绿色荧光蛋白GFP，请论述你的实验过程。
答：实验步骤
（一）提取质粒
1.将菌液倒入1.5ml管中，12000rpm离心1min。
2.去掉上清液，加100μL SolutionI,涡旋使充分悬浮。充分悬浮，不要让菌体结块。
3.加入200μL SolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3℃放置5min(或者冰浴)，切勿剧烈晃动，时间不要过长。
4.加入150μL SolutionIII,混匀（注意动作轻），冰箱3℃放置5min。切勿剧烈晃动.
5.12000rpm，离心5min，将上清移至1个新离心管中，注意所取体积（约500μL）。
6.加入二倍体积无水乙醇（约1000μL），混匀（注意动作轻），放置10min。
7.12000rpm，4℃，离心5min。
8.去上清，沉淀加入500μL70%乙醇洗涤2次。
9.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。
10.每管中加入25μL无菌水1μL RNase，37℃溶解质粒DNA。
11.电泳
（二）一步法制作感受态细胞
1.活化DH5α或BL21菌株，挑取单菌落入LB试管，37度200转过夜。
2.接1毫升入100毫升LB中，37度200转，培养至OD6000.3——0.5,4度6000转5分钟，离心收菌。
3.10毫升TSB重悬菌体。
4.冰上放置10分钟，分装120微升每个PCR管（在冰上操作），零下70度冰箱保存(一年不影响转化效率)。
新鲜没有冻存过的似乎效率更高。
5.转化：酶连产物10微升，5*KCM溶液10微升，dd水30微升，加入1.5毫升离心管中，置冰水混合物中，
负70度取出感受态，立即融化，取50微升加入上述体系中，轻轻吹打混匀。
6.置冰水混合物中20分钟。
7.室温放置10分钟。
8.加入500微升LB，150转37度40——50分钟复苏。
9.6000转5分钟离心浓缩，或直接涂布平板，过夜培养。
（三）GFP重组表达菌株构建及摇瓶发酵
1.提取质粒pET29a-gfp，并转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态细胞，涂布含50mg/L卡那霉素LB平板，37℃过夜培养筛选转化子。
2.挑取转化子接种入含100ml液体LB培养基的三角瓶中，加入终浓度为50mg/L的卡那霉素，37℃，200r/min 振荡培养，2--3小时。
3.6000g，5min离心，收集菌体备用。
（四）产品蛋白亲和层析纯化
A.30ml结合缓冲液重悬菌体，在冰水保护下超声波破碎。
B.4℃,12000g，10min离心，转移上清至干净的容器中。
C.3倍镍柱体积的结合缓冲液过镍柱，平衡镍柱。
D.含目标蛋白的澄清溶液过镍柱，目标蛋白和镍柱特异性结合。
E.3倍镍柱体积的洗涤缓冲液过镍柱，洗去非特异性结合的杂蛋白。
F.2倍镍柱体积的洗脱缓冲液过镍柱，洗脱目标蛋白，得到纯化的目标蛋白GFP溶液。
G.镍柱回收：过量的洗脱缓冲液过镍柱，再用结合缓冲液平衡镍柱。
4.转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。
转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。
首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种；
第二，延长食品保存时间或增加营养成分；
第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护；
第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。
人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。
转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。
另一种答法：转基因的安全性问题从两方面论述
1、抗性选择标记基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质，或者编码出的蛋白质所具有的催化功能对宿主的代谢具有潜在毒性作用，并出现滞后效应或长期效应。
2、转基因植物可能会表达出过敏蛋白；有的基因表达出的蛋白质与已知的过敏蛋白质在免疫学上具有同源性；有的基因表达的蛋白质家族中的某些成员是过敏蛋白，它们都有可能是过敏体质的人产生过敏反应。
3、转基因农作物表达出的某些蛋白质，可能会潜移默化的影响人的免疫系统，从而对人体健康造成隐性的损伤。
4、改变农作物品质的基因及其表达产物，可能会改变宿主体内的代谢途径，从而改变转基因食品的营养成分。
5、科学家赋予了转基因生物某些全新的性状，增强了它们与其他生物的生存竞争能力，它可能会使本地区本来生活力就很纤弱的个体或物种加速从地球上消失。即转基因生物可能会成为某一地区新的优势种，成为“入侵生物”。
6、载体介导的外源基因可能发生横向转移，重组出新的菌株或病毒。
7、具有抗虫功能的转基因植物，其体内产生的抗虫蛋白可能使害虫产生抗性，使害虫变得更加难以防治？现在也已发现具有抗病毒功能的转基因植物，可以使相应的病毒出现抗性。
8、转基因植物可能会变成野生种类，或者它侵入新的生态区域，破坏了生态平衡后而成为杂草。
9、改变了生物的多样性和群落结构，生态系统的稳定性可能会遭到破坏。转基因生物是自然界中不存在的“人工制造”的生物，它们所具有的强大的生存竞争将使处于脆弱平衡状态的农田生态系统等遭到破坏。
10、转基因植物中，如含有对人体有害蛋白或过敏蛋白的花粉，有可能通过蜜蜂采集进入蜂蜜中，最后再通过食物链进入人体。
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
第二章Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP（NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端； 2. 平末端； 3. 平末端加尾； 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶 功能：5’至3’单链聚合 作用特点：单链；无模版 作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dA TP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接 ---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 精品文档
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 （时间：90分钟分数：100分） 一．选择题（本大题包括25题，每题2分，共50分。每题只有一个选项符合题意。） 1．以下说法正确的是（） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B．质粒是基因工程中惟一的运载体 C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不．相符的是（） A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B．植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C．植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3．有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4．能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是（） A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养人的B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6．PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7．以下对DNA的描述，错误的是（） A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（） A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9．细胞工程的发展所依赖的理论基础是（） A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10．下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是：（） A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11．在以下4种细胞工程技术中，培育出的新个体中，体内遗传物质均来自一个亲本的是（） A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12．动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是（） A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13．下列哪一项属于克隆（） A．将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B．将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C．将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
第一章基因克隆 基因工程的基本技术有哪些？ 答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。 构建基因文库一般使用什么作为载体？ 答：一般使用大肠杆菌作为载体 克隆与亚克隆？ 答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？ 答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。 第二章分子克隆工具酶 限制与修饰系统？ 答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。 使用最广泛的限制酶？ 答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶 限制性内切酶的命名？ 答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。 如：HindIII 限制与修饰系统分类？ 答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。 限制酶识别的序列长度？结构？
答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列 限制酶产生的末端？ 答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端 什么是同裂酶？分类？ 答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他 限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？ 答： 什么是同尾酶？ 答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。 酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？ 答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。 酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。 什么星星活性？抑制其发生的办法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。 影响酶活性的因素有？ 答：可分为内因和外因 外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。 内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋） 原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？ 答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
专题一基因工程单元测试 A卷 一、选择题(共50分) 1．限制性内切酶的特点是( ) A．只能识别GAATTC序列 B．识别特定的核苷酸序列和具有特定的酶切位点 C．识别黏性末端 D．切割质粒DNA的标记基因 2．上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转基因牛，可以想象这头牛( ) A．发生了基因突变 B．发生了染色体变异 C．发生了基因重组 D．没发生可遗传的变异 3．“工程菌”是指( ) A．用物理或化学方法诱发菌类自身某些基因得到高效表达的菌类细胞株系 B．用遗传工程的方法，把相同种类不同株系的菌类通过杂交得到的新细胞株系 C．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 D．从自然界中选择出的能迅速增殖的菌类 4．基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备的四个必要条件是( ) A．目的基因限制性内切酶运载体受体细胞 B．重组DNA RNA聚合酶内切酶连接酶 C．模板DNA信使RNA质粒受体细胞 D．工具酶目的基因运载体受体细胞 5．用DNA限制酶切割DNA时识别的核苷酸序列和切口是( ) A．一种限制酶只识别一种核苷酸序列，有专一性酶切位点 B．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列不同 C．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列相同，但酶切位点不同 D．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列和酶切位点都不同 6．根据mRNA的信息推出并获取目的基因的方法是( ) A．用DNA探针测出目的基因 B．用mRNA探针测出目的基因 C．用mRNA反转录形成目的基因 D．用PCR技术扩增mRNA 7．在人类染色体DNA不表达的碱基对中，有一部分是串联重复的短序列，它们在个体之间具有显著的差异性，这种短序列可用于( ) A．生产基因工程药物 B．侦查罪犯 C．遗传病的产前诊断
质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝 松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 优点;①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 ②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 ③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 蓝白斑筛选的机理 由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色 诱导培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。 这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做 -互补 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提 取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用方法：1. 等电点沉淀法2. 盐析法 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析 蛋白筛选（SDS）实验原理是：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD～200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。
专题一基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析
本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些（限制酶、DNA连接酶、载体）
一 1.载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 2.基因工程学科建立的理论和技术发明 1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码 2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现 3.质粒的特点 质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。 自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性 4.描述PBR322质粒筛选过程 PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。 若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则 1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落 2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素 上长的转化子即为重组子。 5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程 PUC是在PBR322质粒上改造的 若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则 将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。 6.基因工程操作的基本流程 1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA 2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基 因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子 3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其 整合到受体细胞的基因组中 4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞 5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达 7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要 1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充 2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因 3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索 8.蓝白斑筛选 是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色
基因工程制药 姓名：惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班
基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. T aqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶
（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶 3. 核酸酶（Nuclease） 4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA 分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。 二．基因工程制药中常用的克隆载体 载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。 （一）质粒 1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。 2 常用的几种质粒载体 （1）pBR322及其衍生载体 pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。BamH I
考试题型 一、填空（共10题 10分） 二、单项选择题（共20题 20分） 三、英文名词解释（共8题 32分） 四、简答题（共6题 30分） 五、综合题（共1题 8分） 幻灯片2 第一章 1、名词解释： Gene Engineering HGP（Human Genome Project） Gene Therapy 基因诊断 2、简述重组DNA操作一般步骤。 3、了解基因工程发展史上的重大事件。 4、了解基因工程研究内容。 5、简述基因工程的主要操作内容。 6、请举两个基因工程应用的具体例子并加以说明。 幻灯片3 第二章第三章第四章 1、名词解释： 载体（Vector）、质粒（Plasmid）、穿梭载体（shuttle vector）、质粒的不相容性、多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）、a-互补、粘性末端、 cos位点、考斯质粒（Cosmid）、穿梭载体（Shuttle vector）、pBR322、pSC101、噬菌粒（phagemid or phasmid）、人造染色体载体、细菌人造染色体（BAC）、酵母人造染色体（YAC）、工具酶、限制修饰系统（R-M System）、同位酶、同尾酶、同裂酶、星星活性(Star activity)、 Klenow酶、T-载体 幻灯片4 2、载体的功能及其应具备的条件。 3、质粒的基本特征是什么？质粒的不相容性的分子机制是什么？ 4、在构建质粒载体时，对天然质粒进行修饰改造？ 5、正选择标记lacZ′的显色原理（ a-互补的原理）是什么，有何应用？ 6、λ噬菌体的包装限制是什么？ 7、核酸限制性内切酶类型及主要特性是什么？ 8、限制性内切酶如何命名？命名原则是什么? 9、限制性内切酶基本特征是什么？ 10、简述影响限制性核酸内切酶酶切的反应条件的因素。 幻灯片5 11、引起星星活性的因素是什么？如何抑制？ 12、 DNA连接酶的基本功能是什么？ 13、大肠杆菌DNA聚合酶I的基本功能是什么？ 14、大肠杆菌DNA聚合酶I 大片段的基本功能是什么？ 15、S1核酸酶的基本功能是什么？ 16、碱性磷酸酶的的基本功能是什么？根据来源不同可分为几种？它们之间有何区别？ 17、质粒提取原理、试剂、过程。