1. 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
2. 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
3.重组DNA技术与基因工程的基本用途
●分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源
●大规模生产生物活性物质
●设计、构建生物的新性状甚至新物种
5.基因工程的理论依据
是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。
理论上的三大发现：
①证实了DNA是遗传物质
②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理
③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定
技术上的三大发明：
①限制核酸内切酶的发现与DNA切割
②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接
③基因工程载体的研究与应用
6.基因工程研究的基本技术路线
●切目的基因的获取
●接基因载体的选择与构建
●转目的基因与载体的拼接
●增重组子导入受体分子
●检外源基因的表达和产物的分离
4.基因工程研究发展史
准备1944 O.T.Avery 等用实验证明DNA是遗传物质
●J．D．Watson 和F．H．C．Crick发现DNA双螺旋结构
◆1972 DNA体外重组技术建立
◆问世：1981 第一只转基因动物(老鼠)诞生
◆1983 第一例转基因植物培育成功
◆1986 第一个转基因作物获批准田间试验
◆1990 人类基因组计划正式启动
1990 第一个转基因动物(鲑鱼)获批准养殖
◆2000 人类基因组工作框架图完成
现状2005.08
美国国家地理协会与美国国际商用机器公司（IBM）日前联手
启动一项为期5年的―基因图工程‖，希望能解开这个人类发展史上的谜团。
1. 用于基因克隆的载体
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；
外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
◆具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性
◆具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
◆具有较高的外源DNA的载装能力
◆具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点
◆具有合适的筛选标记
基因工程中常用的载体：质粒载体噬菌体载体粘粒载体柯斯质粒动物病毒
载体的装载量排列顺序，Cosmid >λ-DNA > Plasmid
2.质粒是独立于染色体以外的能自主复制的双链、共价、闭合、环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中
3.质粒的基本性质
A质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。
B质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成的群体不相容性群。
C质粒的可转移性
接合型质粒能自我转移
非接合型质粒不能自我转移
4.标记基因
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
5.标记基因用途
A选择标记基因：鉴别目的DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。
B筛选标记基因：用于将携带了外源DNA片断的重组子挑选出来。
6质粒载体的种类
克隆载体主要用于扩增或保存DNA片断其上有复制子即可；
表达载体能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；
穿梭载体装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆。
这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
7.目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：
●pSC101 8.8 kb拷贝数5、四环素抗性标记基因Tcr
●ColE1 6.5 kb拷贝数20 – 30、大肠杆菌内毒素标记基因E1
●RSF2124 ColE1衍生质粒、氨苄青霉素抗性标记基因Apr
8.克隆载体
(1)pBR322 它由三部分组成：
◆来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr
◆来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori
◆来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。
特点:
A 具有多个单一的限制性内切酶位点。
B 重组克隆的―插入失活‖筛选方法
pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；
pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长；
而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。
(2)、pUC系列质粒载体
A 特点具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数。具有多克隆位点
B 可通过插入失活法进行筛选
含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。
C 可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因（LacZ′），它编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸，可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，即α—互补，恢复分解乳糖的能力。
X-gal也是β-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β-半乳糖苷酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。当外源基因插入到pUC质粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。
D α-互补：
是指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ，由1024 个氨基酸组成）基因的突变体之间实现互补。
大肠杆菌中的表达载体
9.表达载体应含有：
（1）强启动子
（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。
（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。
11 λ-DNA载体的构建
λ噬菌体的缺陷：
⑴基因组太大（49kb）；
⑵酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。
⑶野生型只能接纳一定长度的DNA。
λ噬菌体的改造
⑴切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；
⑵去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；
⑶增加标记基因；(4) 引入无义突变。
12. 载体类型
插入型载体通过特定的酶切位点允许外源DNA片断插入的载体（0-11kb) 。
置换型载体允许外源DNA片断替换非必需DNA片断的载体(9-23kb)。
13. 噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的l 噬菌体DNA
●l-DNA载体的构建：缩短长度插入型载体
●l-DNA载体的构建：缩短长度置换型载体
●l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点
?l-DNA载体的构建：加装选择标记‘
13. l-DNA载体的主要类型
◆插入灭活型载体
◆取代型载体
◆正选择型载体
16 l-DNA作为载体的优点：
●l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌
●l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量
●重组l-DNA分子的筛选较为方便
●重组l-DNA分子的提取较为简便
●l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达
●外源基因
17考斯质粒
（1）大小 5-7kb
（2）组成λ DNA： pBR322： (质粒的复制子抗药性基因几个限制性酶的单一位点)
特点
①具有λ噬菌体的特性：在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒
②具有质粒载体的特性③方便的选择④高容量的克隆能力
用于核酸操作的工具酶
18限制性核酸内切酶
一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶
限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用，限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力
II 型限制性核酸内切酶的基本特性
●识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列
●大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
?识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构如GAAACTGCAGTTTC EcoR I的识别序列 G A A T T C
C T T A A G
EcoR I的切割位点 G A之间
EcoRI等产生的5‘，3‘粘性末端
PvuII等产生的平头末端
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：
Tris-HCl 50 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM
NaCl 0 - 150 mM
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准DNA所需的酶量
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：根据酶切活性对盐浓度的要求，限制性核酸内切酶可分成 3 大类高中低
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切
对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：
●使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解
●低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
●一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
影响限制性核酸内切酶活性的因素
●DNA样品的纯度：
●DNA样品的甲基化程度：
●核酸内切酶的缓冲液性质：
19DNA连接酶
DNA连接酶负责双链DNA中相邻3`-OH 与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。
DNA连接酶的基本性质
●修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键
●修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键
●连接多个平头双链DNA分子
DNA连接酶的反应条件（需能）连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%
连接反应缓冲体系的ATP 浓度不能高于1mM
连接酶通常应过量2-5 倍
20 平头双链DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接(用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶)，而平头末端的连接则属于分子间的连接（T4 DNA连接酶），因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：
●加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）
●加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会
●加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用
●加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
●加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
21 DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质
●5‘→3‘的DNA聚合酶活性
●5‘→3‘的核酸外切酶活性
●3‘→5‘的核酸外切酶活性
大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途
缺口前移标记法制备32P标记的探针
22 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段
Klenow酶的基本性质
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶 Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性
Klenow酶的基本用途
●补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端
●DNA片段的同位素末端标记
●cDNA第二链的合成
●双脱氧末端终止法测定DNA序列
23 核酸酶
核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA 也能作用于DNA，因此统称为核酸酶（nuclease）。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。
24 核酸修饰酶
碱性磷酸单酯酶
T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）特性
在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷用于探针的末端同位素标记
25 用于基因转移的受体菌或细胞
受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型重组整合缺陷型具有较高的转化效率
具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型
26 大肠杆菌
●遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定
●产结构复杂、种类繁多的内毒素
●适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，
是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌
用于接受质粒：用于接受l-DNA
27 酵母菌
1）具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 2）内源性蛋白产物种类繁多且含量高 3）适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌
4 基因工程的操作过程
切、接、转、增、检
1. DNA的体外重组（切与接）黏性末端连接法，不仅操作方便，而且载体不易环化
2. 重组率的定义
重组率= 含有外源DNA的重组分子数/ 载体分子总数
在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。
3提高重组率的方法
●提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1
●载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：
●加装同聚尾末端：
4.转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细胞的转化
适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
5.Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备：
100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体
用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心
用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体
冰浴放置12 - 24小时，备用收集菌体
6.Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：
取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组
冰浴放置半小时
在42℃保温 2 分钟（热脉冲）
快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟
DNA连接液，混匀
加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增）
涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
7.细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化
8.不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂
9.转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 ml DNA
重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀
细菌原生质体的再生：
原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素
10转化的原理与技术
电穿孔转化
将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA 重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验
12 转化率
转化率的定义
转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA 转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）
转化率的影响因素
载体及DNA重组分子方面：
载体本身的性质：
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同
载体的空间构象：
质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级
插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低
受体细胞方面：
受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转
化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高
转化方法方面：
受体细胞的预处理：影响最大
供受体的比例：Ca2+诱导转化0.1 ml 感受态细胞50 ng DNA
转化方法：Ca2+诱导转化106 - 107 / mg DNA
原生质体转化109 个原生质体50 ng DNA
原生质体转化105 - 106 / mg DNA
l-DNA转染107 - 108 / mg DNA
电穿孔转化106 - 109 / mg DNA
14 转化细胞的扩增目的
增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序
扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定16转化子的筛选和鉴定（检）
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子
载体遗传标记检测
●抗药性筛选法
●营养缺陷型筛选法
●显色筛选法
●限制性酶切图谱法
克隆DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA 同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据
17 外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
淀粉酶目的基因的鉴定：
抗菌素抗性基因的鉴定：
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
1. 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
2.目的基因的克隆鸟枪法
随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离
3.鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断与载体连接转化受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
4.鸟枪法操作的改进
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
5.鸟枪法操作的改进
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接
在连接前将DNA片段进行分级分离
6. 目的基因的克隆cDNA法
cDNA法克隆目的基因的基本战略
mDNA cDNA第一链的合成
引物退火逆转录酶dNTPs
cDNA第二链的合成自身引导法：置换合成法引导合成法
7.cDNA法克隆目的基因的基本战略
双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收
平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组
分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段
加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收
8. 目的基因的克隆PCR法
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物
9. 目的基因的克隆化学合成法
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：
小片段粘接法：补钉延长法：大片段酶促法：
10 化学合成法的基本战略全基因合成探针等寡聚核苷酸合成
11 基因文库的构建
基因库（gene pool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）
基因文库（gene library or gene bank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因）cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）
用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA
用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA
cDNA文库的信息量远小于基因组文库
12 基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中：P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率
f = 克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小
13 基因文库的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：
重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
6 大肠杆菌基因工程
1. 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
●全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
●基因克隆表达系统成熟完善
●繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
●被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
●缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
●缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
●内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白
●细胞周质内含有种类繁多的内毒素
2. 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子启动子最佳距离的探测启动子的筛选启动子的可控性
终止子
3..强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率
4.核糖体结合位点
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；
8. S-D序列：在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine 、Dalgarno 发现，故后来命名为Shine—Dalgarno 序列，简称S-D序列。
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低
6.密码子
生物体对密码子的偏爱性
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性
7.质粒拷贝数
质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降
解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道
8. 大肠杆菌基因工程菌的构建策略
9.包涵体型异源蛋白的表达
包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集
聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子
10 包涵体型异源蛋白的表达
包涵体表达形式的优点：
包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能在一定程度上保持表达产物的结构稳定在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁
包涵体表达形式的缺点：
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%
11 分泌型异源蛋白的表达
分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高
分泌表达形式的缺点：
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍
12 工程菌遗传不稳定性的表现形式
重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：
1）结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失
2）分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）
13.工程菌遗传不稳定性的产生机制
●受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解
●能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞
●外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
●产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序
●重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配
14 改善基因工程菌不稳定性的策略
●改进载体受体系统
●施加选择压力
●控制目的基因的过量表达
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
绪论 1.理论上的三大发现： （1）1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。（2）1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出 DNA Double Helix model。 1958年，Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。（3）1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。 2.技术上的三大发现: （1）限制性核酸内切酶的发现（1962年Arber ） （2）DNA连接酶的发现（1967Gellert） （3）基因工程载体的发现 3.基因工程研究的内容： (1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 (2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。 (3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。 (4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。 (5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。 (6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析； (7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 第二章基因克隆所需的工具酶 一、限制性内切酶 1．限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA 对生物细胞的入侵受到限制 修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。 2．核酸内切限制酶的类型：I型、II型、III型 3．核酸内切限制酶的命名法由H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统 4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性： a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。 一、识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式（回文结构）。 二、切割类型： （1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。 三、产生的末端特征： 1、粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（平末端的DNA片段则不易于重新环化。） 2、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。 3、同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”。 四．影响核酸内切限制酶活性的因素： (1) DNA的纯度。 提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： ①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。 ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 (2) DNA的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 (3) 酶切消化反应的温度：大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。 (4) DNA的分子结构 (5) 核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。pH=7．4时，最佳 1、星号活性：EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。 二．DNA连接酶 1、种类： ①、T4噬菌体DNA连接酶：可连接 1，两个带有互补粘性末端的双链DNA分子 2，两个带有平末端的DNA双链DNA分子 3，一条链带有切口的DNA分子 4，RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连，底物广泛。 ②、大肠杆菌DNA连接酶 1.底物是一条链带有切口的双链DNA分子 2.具有同源互补粘性末端的不同DNA片段 3.几乎不能催化两个平末端的不同DNA片段 4.底物要求严格，假阳性背景底
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
高中生物选修三基因工程知识点 基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果： 经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 （2）与DNA聚合酶作用的异同：
（2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数(2^n)形式扩增 第二步：基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法：
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 （时间：90分钟分数：100分） 一．选择题（本大题包括25题，每题2分，共50分。每题只有一个选项符合题意。） 1．以下说法正确的是（） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B．质粒是基因工程中惟一的运载体 C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不．相符的是（） A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B．植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C．植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3．有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4．能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是（） A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养人的B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6．PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7．以下对DNA的描述，错误的是（） A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（） A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9．细胞工程的发展所依赖的理论基础是（） A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10．下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是：（） A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11．在以下4种细胞工程技术中，培育出的新个体中，体内遗传物质均来自一个亲本的是（） A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12．动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是（） A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13．下列哪一项属于克隆（） A．将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B．将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C．将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外和 ，赋予生物以新的，创造出更符合人们需要的新的和 。基因工程是在上进行设计和施工的，又叫做。 基因工程育种的原理：；优点：、 （一）基因工程的基本工具（工具酶：、） 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种的核苷酸序列，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：末端和末端。（4）限制酶自身DNA，原因是原核生物中或识别序列已经被。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于，只能将双链DNA片段互补的之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合，但连接平末端的之间的效率较。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端， 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②。 ③。 （2）最常用的载体是 ,它是一种裸露的、结构简单的、独立于之外，并具有的 DNA分子。 （3）其它载体：、 . (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：。
2.获取目的基因的方法有、 和。 3.基因文库是指：将含有某种生物的许多DNA片段，导入 中储存，各个受体菌分别含有这种生物的，称为基因文库。包含了一种生物所有的基因，这种基因文库称为；包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库称为，如。 获取目的基因的依据有哪些？如、、 、、。 4.PCR技术扩增目的基因 （1）原理： （2）特点： （3）条件：（）、、（）、（）。 （4）仪器：。 5.人工合成目的基因的方法有：、。第二步： ----也是基因工程的 1.目的：。 2.组成：＋＋＋ （1）启动子含义及作用： 。 （2）终止子含义及作用：。 注意与终止密码子的区别 （3）标记基因的作用：。 常用的标记基因是、。 第三步： 1.转化的概念：是进入受体细胞内，并且在受体细胞内的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是，其次还有和 等。其中单子叶常有的方法是。
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
细菌的限制—修饰作用 核酸限制性内切酶的类型及主要特性
一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。 星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。 同位酶：识别位点相同，但切点不同。 同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端 两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。分子质量为68ku （2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。分子质量为75ku
p35页表2-4 简述DNA连接酶的作用机制及其特点 说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤 基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等 质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子—眼虫、衣藻等）双链DNA 分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。 共价闭合环状DNA（SC构型）开环DNA（oc构型）线形DNA （L构型） 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 理想质粒载体的必备条件： A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数 B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点） C、具有两种以上的选择标记基因 D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变） E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围蓝白班筛选原理 穿梭质粒载体(shuttle vector) ：由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因 黏粒载体也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体 噬菌体载体的优越性p69
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝 松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 优点;①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 ②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 ③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 蓝白斑筛选的机理 由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色 诱导培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。 这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做 -互补 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提 取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用方法：1. 等电点沉淀法2. 盐析法 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析 蛋白筛选（SDS）实验原理是：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD～200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
专题一基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析
本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些（限制酶、DNA连接酶、载体）
一 1.载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 2.基因工程学科建立的理论和技术发明 1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码 2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现 3.质粒的特点 质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。 自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性 4.描述PBR322质粒筛选过程 PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。 若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则 1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落 2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素 上长的转化子即为重组子。 5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程 PUC是在PBR322质粒上改造的 若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则 将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。 6.基因工程操作的基本流程 1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA 2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基 因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子 3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其 整合到受体细胞的基因组中 4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞 5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达 7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要 1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充 2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因 3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索 8.蓝白斑筛选 是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色