第一章绪论
一．基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
二．重组DNA技术与基因工程的基本用途
1.分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源
2.大规模生产生物活性物质
3.设计、构建生物的新性状甚至新物种
4.DNA扩增，外源基因表达产物，表达调控，改造生物遗传特性等。
三. 基因工程的基本形式
第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程
第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程
第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程
第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程
四．基因工程的应用
1.生物技术制药
2.食品轻工氨基酸有机酸维生素单细胞蛋白食品、香料香精
工程材料 3.农业植物生长激素生物农药农药清除剂生物肥料畜禽疫苗
五.基因的制备：化学合成法（DNA连接酶）物理化学方法（分离、纯化）生物学方法（限制性内切酶）酶促合成法（逆转录酶+连接酶）
六.常见的载体：微生物质粒（一种环状DNA分子）某些噬菌体等病毒
1. 什么叫基因工程？有什么特征？
2. 基因克隆的主要目的是什么？
3. 基因工程的三大要求是什么？
4. Watson与Crick和P. Berg因什么成果（材料和结果）获得诺贝尔奖？
5. 基因工程有哪些主要环节？
6. 生物安全性评价的目的是什么？
7. 生物安全性评价的主要内容是什么？
第二章．基因重组
一. 染色体的本质
1、由DNA、蛋白、RNA组成的线性复合结构
2、是生物遗传信息的载体
3、能够在细胞核染色后看的到的物质
4、与染色质关系：同一物质在不同细胞周期的不同表现形式。分裂过程中以棒状的染色体形式存在。
二、DNA与染色体的关系
1、DNA是染色体的一个主要组成部分
2、从DNA到染色体要经过4级包装，总共压缩了8400倍，形成染色体
三、DNA的组成：戊糖（脱氧核糖）+碱基+磷酸根
四、DNA浓度的测定
方法1：利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值。
方法2：测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。
方法3：用于粗略检测DNA浓度，通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。
五：怎样将混合DNA片段分开呢？
1、电泳分离
2、琼脂糖凝胶分离大片断
3、聚丙烯酰胺分离小片断
第三章、工具酶载体
一、常见的工具酶：限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸内切酶掌握5种工具酶的概念、内涵。
熟悉5-10种常见酶切位点。
了解5种工具酶的应用。
二、限制性内切酶
1、限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
（1）识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链
（2）主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵
（3）细菌的限制与修饰作用
1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III
I类能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。
II类识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。
III类识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。
因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。
2、命名原则
取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。
该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。
如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。
若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。
如，HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶。EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。
3、II 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
4、限制性核酸内切酶
1111对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法
使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解
低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
0.1倍体积的5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇
冰浴5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥
5、影响限制性核酸内切酶活性的因素
（1）DNA样品的纯度：
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等
1.加大酶的用量，1 mg DNA 用10U 酶
2.加大反应总体积
3. 延长反应时间
（2）DNA样品的甲基化程度：
（3）核酸内切酶的缓冲液性质：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象
EcoR I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’
三、DNA连接酶
1、DNA连接酶的基本性质
（1）连接酶特点
1.常见的连接酶是T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase）
2.来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3‘端羟基和5’端磷酸基因，脱水形成3‘-5’磷酸二酯键
3.连接双链DNA上的单链缺口（Nick），因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端。
4.连接RNA模板上的DNA链缺口。
5.连接平头双链DNA速度很慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，因属于分子之间的连接.
（2）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键
（3）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键
（4）连接多个平头双链DNA分子：
2、DNA连接酶的反应条件(见PCR实验步骤)
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应1 小时，完全连接1 mg l-DNA （Hind III片段）所需的酶量
3、平头双链DNA片段的连接操作
分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而
平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多
提高平头末端连接效率的方法包括：
1.加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）
2.加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会
3.加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用
4.加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
四、DNA聚合酶
1、大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol I ）
大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质:
1、5‘→3‘的DNA聚合酶活性
2、5‘→3‘的核酸外切酶活性
3、3‘→5‘的核酸外切酶活性
2、大肠杆菌DNA聚合酶I 大片段（Klenow ）
Klenow酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow 酶Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性
3、T4-DNA聚合酶
T4-DNA酶的基本特性
1.5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性
2.在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切
3.在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止
4.在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
五、核酸酶
第三章、基因工程的常用技术
第二节聚合酶链式反应(PCR)
PCR的实现：1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的突破：1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR使PCR自动化成为可能。
PCR的确认：1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。
20世纪80年代末，PCR技术成为遗传和分子分析的重要技术。
二、PCR 的特点及应用：
PCR操作简便、省时；灵敏度高；对原始材料的质和量要求低；特异性强。因此，广泛应用于许多领域。
基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等；
遗传病的产前诊断；
致病病原体的检测；
癌基因的检测和诊断；
DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；
动、植物检疫；
在转基因动植物中检查植入基因的存在
二、PCR 反应系统的组成
PCR反应系统的组成主要包括：
引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
、引物：
要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段。
两引物间距离决定扩增片段的长度。
两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。
引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键。
引物设计十分重要。
1）、引物的设计：
长度最高不超过30个核苷酸，最佳长度为15～25个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。
两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。
(G+C）%含量：引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体，45%-55%为宜。G+C 太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。
引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。
5、Tm 值高于55 C 。Tm允许的范围内选择较高的退火温度可大大减少引物和模板的非特异性结合，提高PCR的特异性。
6、引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。
7、引物扩增跨度以300-500碱基为宜。
8、引物的特定性，引物应与核苷酸序列数据库的其它序列物有明显同源性。
2）、引物的浓度：
引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μM（或10～100pmol）之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。
（3）引物退火温度
决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般实验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式进行粗略计算：
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃
其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成。
（4）、引物延伸温度
取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。
每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。
根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温度。
对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min。
2、寡核苷酸（dNTP）
（1）、dNTP的质量与浓度
dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
（2）、dNTP与PCR反应
在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性。
使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入。
高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。
PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量，或过早终止反应。
3、Taq DNA聚合酶:
Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。
催化一典型的PCR所用酶量为2U。常用范围为1～4U/100μl。
由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。
Taq酶的活性单位定义（Takara 公司）：
用活性化的大马哈鱼DNA作为模板/引物，在740C、30分钟内，摄入10nM的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为一个活性单位。
4、模板(靶基因)核酸
1）、模板的种类：
单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。
若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。
用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。
当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。
2）、模板的用量
虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的DNA。
（3）、模板变性温度
它决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR 也就不会启动。
变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。
样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；
反之，在高温时间应尽量缩短，以保持DNA聚合酶的活力。
加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
4）、模板核酸的量与纯度
它PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；
用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
5、Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。
在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
、PCR缓冲液:
用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris –HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl。在72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。
二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。
首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L
7、PCR循环次数
常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。
三、PCR扩增过程
在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq 聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+ 存在。其循环的温度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。
(1)变性阶段加热使模板DNA在高温下（90℃-95）变性，双链解链；
(2)退火阶段降低溶液温度，使合成引物在低温（35－65℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；
(3)延伸阶段溶液反应温度升至中温(72℃)，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。
原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
四、实验仪器及材料
PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等
TaKaRa Taq (5U/ μl)
10XPCR Buffer (Mg2+ Plus)
dNTP Mixture (each 10mM or 2.5mM)
模板(10ng，实验1自提质粒)
引物（Primer 1 and 2, 10 μM)
五、PCR产物分析
取3-5μl PCR产物，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。
六、PCR污染与对策
（一）、污染原因
1、标本间交叉污染:
?收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;?标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.
2、PCR试剂的污染:
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染.
3、PCR扩增产物污染
（1）、PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.
（2）、气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反
应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
4、实验室中克隆质粒的污染
因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.
二）、防止污染的方法
1、合理分隔实验室:最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.
2、吸样枪:由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染.
3、预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱.
4、防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.
5、设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照.
6、减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止.
7、选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出。
七、荧光定量PCR
荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。
（一）、荧光定量PCR技术定义
是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
二、荧光定量PCR原理
1. Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold （域值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。故必须确定Ct值。
2.荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ×SDcycle 6-15
3.Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4.荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
1）TaqMan荧光探针：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2）SYBR荧光染料：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
（三）、荧光定量PCR技术优点
1、全封闭的PCR过程，无需跑胶，无需后处理；
2、有效解决PCR污染问题
3、实时在线控制；
4、特异性更强；
5、增加定量的精确性；
6、线行关系直接；
7、自动化程度高，分析结果快速方便。
（四）、荧光定量PCR技术的应用
基因表达研究
转基因研究
药物疗效考核
病原体检测
肿瘤研究
基因突变及多态性的研究
7 基因诊断Gene Diagnosis
第一节基因诊断的技术方法
一、基因诊断中常用的分子生物学方法
㈠核酸分子杂交
㈡PCR一般与其它技术合用
㈢单链构象多态性（SSCP）检测PCR- SSCP用于检测点突变
㈣限制酶酶谱分析基因突变导致酶切位点的丢失或相对位置发生改变㈤DNA序列测定
㈥DNA芯片技术
二、基因诊断的基本方法
基因变异致病的类型：
内源基因的变异
基因结构的突变
点突变、插入、缺失、重排、异位
基因表达异常
mRNA剪接异常
外源基因的插入
㈠基因突变的诊断
点突变的诊断
①诊断已知的点突变（PCR/ASO）
1.一对探针2突变碱基置探针中央 3.控制杂交条件
结果分析：
1.反向杂交技术
2. 基因芯片技术：可检测出新的突变类型
②诊断未知的突变
PCR/SSCP/测序
DNA芯片技术
少数核苷酸缺失或插入的诊断
大片段丢失或插入的诊断
PCR/多重PCR
基因重排（染色体易位）的诊断
基因扩增的诊断
㈡多态性连锁分析
DNA多态性——在同种生物不同个体的基因组中，常存在一些不影响基因功能的DNA顺序变异，称为DNA多态性（polymorphism）
DNA多态性标记
1、RFLP
限制性片段长度多态性（RFLP）
DNA→酶切→Southern杂交分析
DNA→PCR →酶切→电泳分析
2、短串联重复序列（short tandom repeat, STR）
由串联重复顺序导致的长度多态性
STR含有较高的信息量且容易检测
STR由2~6个核苷酸串联重复组成，微卫星DNA
3、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）㈢基因表达异常的诊断
mRNA的相对定量分析
斑点杂交或狭缝杂交
RT—PCR
mRNA的绝对定量分析
RT—PCR/竞争性PCR
mRNA长度分析
Northern杂交/ RT—PCR产物电泳
㈣外源DNA检测
核酸分子杂交
PCR技术
第二节遗传病的基因诊断
一、遗传性疾病基因
诊断的策略
直接诊点突间接诊断
多态性连锁分析
镰刀型红细胞贫血症：
第六位密码由GAG突变成GTG
第三节感染性疾病的
基因诊断
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
高中生物选修三基因工程知识点 基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果： 经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 （2）与DNA聚合酶作用的异同：
（2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数(2^n)形式扩增 第二步：基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法：
基因工程各章知识点 第一章绪论 1．基因工程的首例操作实验 三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定 三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用 基因工程的诞生： 72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子 73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性 S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌 2．基因工程的基本概念 基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。 供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。 3．基因工程的基本操作过程 a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。 b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。 c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。 d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。 e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 第二章载体 1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定 PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。 如果在pBR322质粒的Tet r基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tet r基因编码序列的连续性，使tet r 失去活性，产生出Amp r Tet s表型的重组pBR322质粒，转化入Amp s Tet s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Amp r菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Amp r基因内位点插入外源DNA片断，则反之。 PUC18作载体的克隆外源基因的原理：
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
基因工程核心知识点 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形 成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 *比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。 （4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA 连接酶的异同点。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。 2.获得目的基因的方法
第一章基因克隆 基因工程的基本技术有哪些？ 答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。 构建基因文库一般使用什么作为载体？ 答：一般使用大肠杆菌作为载体 克隆与亚克隆？ 答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？ 答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。 第二章分子克隆工具酶 限制与修饰系统？ 答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。 使用最广泛的限制酶？ 答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶 限制性内切酶的命名？ 答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。 如：HindIII 限制与修饰系统分类？ 答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。 限制酶识别的序列长度？结构？
答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列 限制酶产生的末端？ 答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端 什么是同裂酶？分类？ 答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他 限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？ 答： 什么是同尾酶？ 答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。 酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？ 答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。 酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。 什么星星活性？抑制其发生的办法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。 影响酶活性的因素有？ 答：可分为内因和外因 外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。 内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋） 原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？ 答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
专题1 基因工程 ※基因工程的概念： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 ﹡原理：基因重组 ﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。 ﹡操作水平：DNA分子水平 【思考】： （1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。 （2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。 （3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。 一、基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。 ①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 （2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 （4）与DNA分子相关的酶
基因工程基础知识梳理（二） 三、基因工程的应用 ．植物基因工程的成果 提高农作物的＿＿＿＿＿能力、改良农作物的品质、利用植物生产＿＿＿＿＿等。 （ ）抗虫转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿导入植物体，使其具有抗虫性。 ②成果：各种抗虫作物，如抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米等。 ③意义：减少＿＿＿＿＿，降低生产成本，减少环境污染。 ④主要杀虫基因：＿＿＿＿＿、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。 （ ）抗病转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿导入植物体中，使其具有抗病特性。 ②成果：多种抗病作物，如抗病的烟草、小麦、甜椒、番茄等。 ③意义：提高作物抗病力，增产。 ④主要抗病基因：抗病毒的＿＿＿＿＿和病毒的复制酶基因；抗真菌的＿＿＿＿＿ 基因和抗毒素合成基因。 （ ）抗逆转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿基因导入植物体，获得抗逆作物。 ②成果：多种抗逆植物，如抗盐碱和干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂大豆和玉米等。 ③意义：提高作物抗逆能力，稳定高产。 ④主要抗逆基因：抗盐碱、抗干旱的＿＿＿＿＿基因、耐寒的＿＿＿＿＿基因、抗除草剂基因。 （ ）利用转基因改良植物的品质 ①方法：将优良性状基因导入植物体，获得＿＿＿＿＿。 ②成果：＿＿＿＿＿含量较高的玉米、耐储存番茄、新花色的矮牵牛。 ③意义：改良植物的某些品种。 ④主要优良性状基因：＿＿＿＿＿的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因。 ．动物基因工程的成果
（ ）提高动物的生长速度 ①生长基因：外源＿＿＿＿＿基因。 ②成果：转基因绵羊、转基因鲤鱼。 （ ）改善畜产品的品质 ①优良基因：肠＿＿＿＿＿基因。 ②成果：转基因牛乳汁中＿＿＿＿＿含量少。 （ ）转基因动物生产药物 ①基因来源：药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的＿＿＿＿＿。 ②成果：乳腺生物反应器。 （ ）转基因动物作器官移植的供体 ①器官供体：抑制或除去＿＿＿＿＿。 ②成果：利用＿＿＿＿＿培育没有免疫排斥反应的猪器官。 ．基因工程药物 （ ）来源：转基因＿＿＿＿＿。 （ ）成果：＿＿＿＿＿、抗体、疫苗、激素等。 （ ）作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、＿＿＿＿＿、类风湿等疾病。 ．基因治疗 （ ）特点：把 ＿＿＿＿＿导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。 （ ）成果：将腺苷酸脱氨酶基因导入患者的＿＿＿＿＿，治疗复合型免疫缺陷症。 （ ）方法：分为体外基因治疗法和＿＿＿＿＿基因治疗法。 四、蛋白质工程 ．蛋白质工程的崛起 （ ）实质：将一种生物的＿＿＿＿＿转移到另一种生物体内，后者产生它本不能产生的蛋白质，从而产生新性状。 （ ）目的：生产符合人们生活需要的、并非自然界已存在的＿＿＿＿＿。 （ ）实例：天冬氨酸激酶和＿＿＿＿＿＿＿＿的活性受细胞内＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的影响，当赖氨酸浓度达到一定量时会抑制这两种酶的活性，改变两种酶的特性后，玉米游离赖氨酸含量提高。 ．蛋白质工程原理
-高考生物基因工程专项知识点 基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力 的手段，下文是为考生准备的生物基因工程专项知识点的内容。 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键断开，因此具有专一性。 (3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶(E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是??质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 (1)原理：DNA双链复制 (2)过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链;第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链;第三步：加热至70～
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外和 ，赋予生物以新的，创造出更符合人们需要的新的和 。基因工程是在上进行设计和施工的，又叫做。 基因工程育种的原理：；优点：、 （一）基因工程的基本工具（工具酶：、） 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种的核苷酸序列，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：末端和末端。（4）限制酶自身DNA，原因是原核生物中或识别序列已经被。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于，只能将双链DNA片段互补的之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合，但连接平末端的之间的效率较。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端， 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②。 ③。 （2）最常用的载体是 ,它是一种裸露的、结构简单的、独立于之外，并具有的 DNA分子。 （3）其它载体：、 . (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：。
2.获取目的基因的方法有、 和。 3.基因文库是指：将含有某种生物的许多DNA片段，导入 中储存，各个受体菌分别含有这种生物的，称为基因文库。包含了一种生物所有的基因，这种基因文库称为；包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库称为，如。 获取目的基因的依据有哪些？如、、 、、。 4.PCR技术扩增目的基因 （1）原理： （2）特点： （3）条件：（）、、（）、（）。 （4）仪器：。 5.人工合成目的基因的方法有：、。第二步： ----也是基因工程的 1.目的：。 2.组成：＋＋＋ （1）启动子含义及作用： 。 （2）终止子含义及作用：。 注意与终止密码子的区别 （3）标记基因的作用：。 常用的标记基因是、。 第三步： 1.转化的概念：是进入受体细胞内，并且在受体细胞内的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是，其次还有和 等。其中单子叶常有的方法是。
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
基因工程细胞工程知识点汇总 一、基因工程 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，
供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
基因工程的基本工具 一、基因工程的概念： 二、基因工程的原理和优点： 三、基因工程的基本工具 1.分子手术刀： （1）来源： （2）作用： （3）不同类限制酶的区别： （4）与DNA连接酶的异同点： 相同点： 不同点： 2.分子缝合针： （1）分类： （2）作用： （3）区别： （4）与DNA聚合酶的异同点： 区别： 相同点： 3.分子运输车： （1）作用： （2）种类： （3）质粒是什么？ （4）质粒的特点及每一个特点的作用： <1>.特点： 作用： <2>.特点： 作用：
<3>.特点： 作用： 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取 1.目的基因指什么： 2.获取目的基因的来源： 3.获取目的基因的方法 1.条件： 2.基因文库的分类： 基因组文库： 部分基因文库（cDNA文库）： 3.基因文库的构建流程 4.两种基因文库的区别： 1.条件： 2.中文名称： 3.原理： 4.原料：
5.过程及每一步的作用： 第一步： 第二步： 第三步： 1.条件： 二、基因表达载体的构建（核心步骤） 1.基因表达载体的结构元件 1①目的基因 2启动子： 3终止子： 4标记基因： 5复制原点 2.构建基因表达载体的目的： 3.构建的方法：[理解单酶切和双酶切的区别] 三、将目的基因导入受体细胞（转化） 1.植物细胞（充当受体细胞）的转化 1农杆菌： 2Ti质粒： 3总体思路： 4农杆菌侵染植物时的机理： ⑤适用范围：
注意事项： 注意事项： 2.动物细胞（充当受体细胞）的转化 1技术： 2具体谁来充当受体细胞： 3.微生物细胞（充当受体细胞）的转化 Ca2+转化法： 四、目的基因的检测与鉴定 1.分子水平的检测 目的： 方法： 结果： 目的： 方法： 结果： 目的： 方法： 结果： 2.个体水平的检测
高中生物基因工程核心知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
第一章基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内， 使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大 要素。 1.分离目的基因 2.限制酶切目的基因与载体 3.目的基因和载体DNA在体外连接 4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 5.选择、筛选含目的基因的克隆 6.培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ ?具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 ?具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 ?具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 ?具有合适的筛选标记。 ?分子量小，拷贝数多。 ?具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有 1.克隆质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.探针质粒 6.表达质粒3. 质粒的构建 （1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源 DNA 片段的装载量。一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因， 提高质粒的拷贝数 （3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受 体细胞。 （4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一 化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起， 即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。 6.入-噬菌体载体及构建 -DNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 ?1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点 ?引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 ?灭活某些与裂解周期有关基因。 ?使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染
一、绪论 1、简述基因工程的概念。 答：基因工程是指按照人们的设计，用生物技术直接操作生物的基因组。通过分离和拷贝目的基因或人工合成外源基因，在体外将外源基因插入到载体分子中，成为重组DNA，再导入宿主细胞内，进行扩增和表达。此过程所涉及的方法学称为重组DNA技术，也称分子克隆或基因操作。 2、列举基因工程中常用的一些技术。 答：（1）基因敲入：以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利用靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。 （2）基因敲除：将一个特地设计的DNA片段导入生物体中，通过同源重组使靶基因被置换出而失活的实验技术。 （3）基因敲落：是用反义技术，RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。 （4）基因打靶：是用同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。 （5）基因组编辑：用基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶（ZFN）、归巢核酸内切酶、转录激活子样效应物（TALE）和成簇间隔短回文重复（CRISPR）进行剪切。 二、基因工程的分子遗传学基础 （一）名词解释 1、基因表达：指DNA分子经转录产生互补的RNA分子。 2、半保留复制：亲代DNA双链分离后的两条单链均可作为新链合成的模板，复制完成后的子代DNA分子的核苷酸序列均与亲代DNA分子相同，但子代DNA分子的双链一条来自亲代，另一条为新合成的链，故称为半保留复制。 3、半不连续复制：是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。半不连续模型是DNA复制的基本过程。 4、DNA的变性：指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变：溶液粘度降低、溶液旋光性发生改变、增色效应。 5、DNA的复性：指变性DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。 6、增色效应：指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相
基因工程知识点全 第一章基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人 们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。 1.分离目的基因 2.限制酶切目的基因与载体 3.目的基因和载体DNA在体外连接 4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 5.选择、筛选含目的基因的克隆 6.培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1.基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。 具有安全性。
2.质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有 1.克隆质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.探针质粒 6.表达质粒 3.质粒的构建 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记， 便于检测含有重组质粒的受体细胞。 （4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切 割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达