外周血染色体制备及分析
原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：
一、试剂准备
1、0.2%的肝素溶液
2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存）
3、0.075mol/Ll氯化钾溶液
4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）
5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）
二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。置37℃培养箱内培养72小时。每日早晚定时摇匀培养物1次。收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml
秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。摇匀后继续培养 2小时。
三、收获细胞
培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。
1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。
2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。
3、离心以1000转/分钟，离心10分钟
4、固定：吸去上清液，留下沉淀物。沿离心管壁加入新配固定液6-8ml，混匀，室温放置30分钟。
5、离心以1000转/分钟，离心10分钟
6、重复4、5步骤二遍使细胞经过3次固定，除第一次固定至少需30min外，其余两次固定，每次15或30min均可
7、细胞悬液的制备吸去上清液，加适当固定液，制成浓度适合的细胞悬液备用
8、制片、显带和染色
1）制片：用吸管将细胞悬液轻轻混匀后吸取少量，从10cm高处滴至一端倾斜15°经冰水或20%乙醇浸泡过的无脂玻片上,每篇滴2-3滴,然后在酒精灯火焰上来回通过数次,使其干燥；将制备的染色体标本片置鼓风干燥箱内37℃过夜，取出后自然冷却至室温。
2）显带：染色缸中的45ml生理盐水，加2.5ml浓度为0.25%的胰酶溶液（胰酶最终浓度0.013%）用3%Tris3～5滴调整PH值为6.8－7.0，在37℃预热30分钟，将染色体标本片放入胰蛋白酶溶液中消化（恒温）。先将一张标本片分成三段进行预消化，以确定最佳消化时间，一般在30秒～1分钟。
3）染色：将消化过的染色体标本片立即放入10%Giemsa染色液中染色5-10分钟；自来水轻轻冲洗3～5秒钟，晾干。
4）核型分析：
显微镜下常规计数20个分裂相，分析3个G带核型，（异常者分析5个）。如遇到嵌合休加倍计数和分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析 一、实验背景 1、Carnoy固定液： 固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。 2、低渗液（hypotonic solution） 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。 2、肝素 N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。 2、PHA 植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂。 3、青霉素和链霉素 青霉素：青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。 链霉素对许多革兰阴性杆菌有抗菌作用。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。链霉素的作用在PH值为7.8时最强，PH值降至6或6以下时则大大减弱。四环素作用机制为药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。 4、秋水仙素 秋水仙能素破坏纺锤体,阻断细胞有丝分裂,使分裂的细胞全部阻止在中期。实验中要严格控制培养物中秋水仙素的浓度,不仅保证有效的终止细胞第一次分裂,而且使秋水仙素的细胞毒
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征 组别染色体序号形态，大小着丝点位置次缢痕随体
人外周血染色体标本制备 一、培养基的选择与接种 培养基主要的作用是为培养的细胞提供营养，以让其更好的生长。其基本成分有双抗（青霉素和链霉素）、水、PHA、小牛血清、酚红等。小牛血清和植物血凝素偏高或偏低，以及PH值均会影响染色体的分裂。反复冻融的培养基对培养的效果也不好，一因PHA随着不断的解冻其效价也不断降低，二是因为含有细胞DNA生长必须的氨基酸，而此氨基酸会随不断的解冻而消失。培养基颜色改变及浑浊均不能再用。 接种血液时，视不同年龄群的人而异。小孩或者新生儿接种量比成人少，因为小孩和新生儿的白细胞比成人的高很多。血液太少，细胞稀薄并且生长速度减慢；血液太多，会造成培养细胞生长时营养成分不够，影响细胞的生长状态。 二、秋水仙素 其作用是阻断纺锤体拉向两级，使正在分裂的细胞停留在分裂中期，以便获得大量中期的分裂相以分析染色体之用。使用秋水仙素时应注意使用时间、作用时间、浓度、量等。一般而言，在收获细胞前1.5-2h加入。加入过多，染色体太短；反之，染色体瘦长或无中期分裂相。 三、低渗 这是染色体制备中关键的环节，目的是使淋巴细胞吸收水分而膨胀和中期染色体分散铺展。低渗效果与处理的时间、低渗的温度，低渗时吹打混匀细胞的力度有关。一般用 0.075mol/L的KCL。低渗时间不够，染色体分散不好，细胞粘连，呈团状；低渗时间过长，可是细胞破碎，染色体丢失，甚至会因染色体胀大得过分和使其形态结构模糊不清，变得难以消化及染色。一般加入8毫升，于37度水浴箱中低渗20-30min为好。 四、固定 为了维持染色体的固有形态。固定液可使细胞脱水，蛋白变性而使染色体粗大适中。注意：固定液需要现配现用，因为固定液所含的水分与固定效果有关。吹打细胞时，要注意用力，以免细胞丢失过多，因为低渗后的细胞很脆弱。 五、滴片 先制成细胞悬液，浓度适中，随个人喜好。但不因太浓，因其会使染色体分散程度受限。也不宜太淡，以免滴片时细胞分裂相稀少。一定要注意好温度、湿度的关系，这是要点。一般制片两张，然后置于75摄氏度烤箱中烘烤3h。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案 2012级师范2班第3组 组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长） 一、实验目的 掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。 二、实验原理 人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。 核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。 对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100% （2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数） （3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数） 人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。其中22对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY,女XX。根据丹佛（1960），伦敦（1963）和芝加哥（1966）会议提出的标准，即按照染色体长度依次减小和着丝粒位置以及其他特征，把人类体细胞染色体分为七个组群，各自特征简括于表1。 表1 人染色体组型及其特征 组别染色体 序号 形态， 大小 着丝粒位 置 次缢痕随体鉴别程 度 A 1~3 最大M 常见一号无可鉴定 B 4~5 次大Sm 无不易 C 6~12+X 中等Sm 常见九号无难鉴定 D 13~15 中等S他偶见13号有难鉴定 E 16~18 较小16m,17m, 18sm 常见16号无可鉴定 F 19~20 次小M 无不易 G 21~22+Y 最小St 有，Y 无 难鉴定
第四大组实验方案 外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1.了解动物细胞培养的方法。 2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 3.学会对人类染色体的组型分析。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。 核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。正常的核型能代表个体的核型。组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。 染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。 对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个： 1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。 2.臂指数，指长臂同短臂的比率。按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~ 3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体 3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。他决定着丝粒饿相对位置。按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在 37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。 正常人类染色体的数目为46条(23对，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22
人体外周血淋巴细胞培养、染色体制备及染色体核型分析 09级一班 3组 摘要：细胞培养是指在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。处于增殖期的培养淋巴细胞经过秋水仙素处理，可停留在分裂中期或早中期，这一时期的染色体形态为棒状结构，是观察分析染色体的最佳时期 一、实验目的 1．学习人体细胞离体培养的方法； 2．掌握制作人染色体标本的方法； 3．观察人类染色体的形态和染色体数目； 4．熟悉染色体核型分析。 二、实验原理 细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。 外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新获得有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认与观察。 染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 各种生物染色体的数目、形态和结构都是恒定的。染色体核型或组型，指一个个体或物种的特有的染色体构成，包括染色体数目以及每一条染色体所特有的形态特征（染色体的长度、着丝粒的位置、臂比值、随体的有无、次级缢痕（缢痕：中期染色体染色很浅且呈狭细的部位，此处染色质呈非螺旋化。）的数目及位置、异染色质的分布等）。核型是物种最稳定的性状和标志，通常在体细胞有丝分裂中期时进行核型的分析鉴定，也可利用减数分裂期的染色体进行分析鉴定。
人类外周血培养及染色体核型分析 一、实验目的： 1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法； 2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本； 3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。 二、实验原理： 1、植物血凝素的作用 外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。 2、秋水仙素的作用： 秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。 使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。 3、低渗的原理： 徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。 这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。 4、核型和带型： 核型(karyotype)： 是指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、形态特征的总和。 在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、排队、配对, 并进行形态分析的过程叫核型分析。 将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。 带型（banding pattern） 即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。 常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。 三、实验用具及试剂： 1.实验仪器及用具： 恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪； 培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。 2. 实验试剂： 外周血淋巴细胞培养基 2%碘酒 75%酒精 20µg/ml秋水仙素 0.075 mol/L KCl溶液
外周血染色体制备及分析 原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下： 一、试剂准备 1、0.2%的肝素溶液 2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存） 3、0.075mol/Ll氯化钾溶液 4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制） 5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制） 二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。置37℃培养箱内培养72小时。每日早晚定时摇匀培养物1次。收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml 秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。摇匀后继续培养 2小时。 三、收获细胞 培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。 1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。 2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。 3、离心以1000转/分钟，离心10分钟 4、固定：吸去上清液，留下沉淀物。沿离心管壁加入新配固定液6-8ml，混匀，室温放置30分钟。
人类外周血染色体制备 一、原理 人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素（PHA），这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106～3×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。 二、用品和试剂 1．5ml注射器（7号针尖），培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。 2．超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。 3．试剂： （1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0 克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌。 （2）肝素钠（肝素）：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，15磅20分钟灭菌。 （3）秋水仙碱（秋水仙素〕，生理盐水配制成10μg/ml浓度，15磅20分钟灭菌，分装，置－20℃。 （4）低渗液：0.35％KCl。 （5）固定液（Carnoy固定液）甲醇∶冰乙酸（3∶l），临时配制。 （6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制。 （7）磷酸缓冲液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和。 （8）5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。 三、操作步骤 （一）细胞培养 1．培养基的配制： 在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例： RPMI-1640 84ml 小牛血清15ml PHA 3支 肝素钠1ml 卡那霉素终浓度为100单位/ml 以5% NaHCO3（无菌）或1N HCl调pH至7.2－7.4。 用刻度吸管将培养液分装入培养瓶（10ml/瓶），4℃备用。 2．采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3—0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30—40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。 3．培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。 4．秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中加入秋水仙碱（用 1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml）。 以上步骤均需无菌操作 （二）染色体制备 1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8—10分
外周血培养染色体制备技术 本文来自: https://www.doczj.com/doc/e619063602.html, 基因时代,生物protocol,为生命科学提供源动力！详细出处参考：https://www.doczj.com/doc/e619063602.html,/html/protocol/genetic/2009111/3401.html （1）原理外周血染色体制备是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技术，亦是最基本的实验技术。外周血由于取材容易，培养过程比较简单，在短期内可以得到结果，所以其实用价值还是很高的。 全血中含有红、白细胞二类，它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核无分裂能力；白细胞虽有细胞核存在，但是在外周血中已处于休止期，因此要使白细胞从间期进入分裂期必须加刺激药物。现在最常用的促使分裂的药品是PHA，它能使白细胞中的淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞，这就为染色体的制备创造了条件，因为染色体只有在细胞分裂时才能出现具有一定形态、大小、便于我们识别的物质。此外，染色体的形态在细胞分裂中期时最典型的，所以在培养过程中还需用秋水仙素类药物，这种药物可以破坏细胞分裂过程中纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，由于秋水仙素的作用破坏了纺锤丝的形成，造成了染色体着丝粒不能分开，但染色体的两臂却在S期时已复制了，这就构成了染色体的形态为“X”形或“∧”形，称之为中期染色体图形。为了便于观察和计数，因而在制作过程中还需采用低渗处理，低渗处理的目的在于使细胞膨胀，细胞膜破裂，染色体分散，这样可便于分析。 （2）操作过程 1）采血：用无菌干针筒从静脉中取血2~3毫升左右，用肝素抗凝（每毫升全血内含肝素100单位）。 2）生长培养剂配制：在无菌室内按上述成份配好生长培养液，每培养瓶内含5毫升，调节好pH，置于（-20℃）冻存。 3）标本接种：在无菌条件下，每5毫升上述生长培养液中加入肝素抗凝全血约0.3毫升。4）培养：将接种好的培养瓶置于37℃恒温箱中培养66~68小时。 5）阻止分裂：当培养至66-68小时，加入秋水仙素液（10微克/毫升）0.1毫升，摇匀后置于37℃恒温箱中续培养2-4小时。 6）培养物收获：从恒温箱内小心取出培养好的标本（防止底物震荡、变混）此时可见培养瓶底有一层沉淀培养物，即是所需收获物。打开瓶盖后，小心吸去上清液，留下约1毫升左右底物。 7）低渗处理：低渗液可用0.05M的KCl液或新鲜蒸馏水，使用前，先将低渗液置于 37℃温箱或水浴箱中预温。 在留下的1毫升底物的培养中，加入4-5毫升已预温的低渗液。用吸管打散沉淀物，移 至离心管中，于37℃温箱或水浴箱中低渗处理20-30分钟。然后，加入固定液（3份甲醇：1份冰醋酸）1毫升，用吸管打匀，预固定5分钟。 8）离心:1000转/分,离心10分钟. 9）固定：将已离心好的培养物，取出，吸去上清液，留下底物。加入上述固定液5毫升，用吸管将底物打散，固定20分钟。然后置于1000转/分离心机中，离心10分钟，取出吸去上清液，留下底物。 10）重复上述固定、离心一次。 11）玻片标本制作：最后一次固定、离心后，吸去上清液，留下底物，再加少量新鲜固定液（约0.5毫升左右）打散，制成细胞悬浮液便可进行制片。 制片之前应先将载玻片经清洁洗涤处理后先置于冰箱内制成冰片。取冰片一张滴上1-2滴细
附件一外周血染色体标本的制备法 该法是制备各种染色体标本的基础。 一、操作过程： 1、采血：先在采血者肘部用碘酒棉球及酒精棉球消毒皮肤，再取2毫升干燥灭菌注射器，配上针头（6～7号），并吸取0.2%的肝素液（Heparin）0.2毫升，湿润针筒。再从肘部静脉采血0.7～1毫升，轻轻转动针筒，使之与肝素混匀。 2、培养：拔去抽血用针头，立即插入灭菌试管内，送入无菌操作箱（此时操作者必须用肥皂洗刷双手，并用自来水冲洗干净，然后双手进入无菌操作箱，依次用碘酒及酒精棉球消毒双手，在火焰旁将血液平均滴入2～3个已盛好培养基的小瓶内（培养基的组合：RPMI 1640或Eagle或M 199毫升，小牛血清1毫升，PHA 5毫克，用5%NaHCO3调pH至7.0～7.4），盖上翻口瓶盖，轻轻摇动。如到外地采血培养亦可因地制宜，无需在无菌操作箱内接种，方法是：抽血完毕，转动针筒，将血液与肝素混匀，拔去针头，重新换上灭菌注射针头，将血液直接从翻口橡皮塞（用碘酒及酒精棉班干部消毒）上插入，将血液缓缓滴入培养瓶内，轻轻摇动，置370C温箱中培养66～72小时。 秋水仙素（Colchieine）处理：在终止培养前4～6小时，将事先配制好的0.01%秋水仙素1滴（每毫升50滴约2μg）加入培养瓶内，轻轻摇动，放回温箱中，继续培养4～6小时，这样使细胞分裂停止在中期。 4、离心：用吸管吸取培养物，并移入刻度离心管内，以1000转/分离心8分钟，吸去上清液，留底层离心沉淀物。 5、低渗处理：加5毫升预温（370C）的0.75M KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，仍放回370C温箱中，静止15分钟。这样使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。 6、预固定：在低渗15分钟后，加固定剂（冰醋酸:甲醇，1:3）1毫升，打匀。 7、再离心：为了收集细胞，以1000转/分离心8分钟，然后吸去上层液，保留沉淀物。 8、固定：沿离心管管壁加入新配制固定液（甲醇:冰醋酸，3:1）5毫升，过5分钟后，用吸管将底部沉淀物轻轻打匀，继续固定30分钟。 9、再离心：以1000转/分离心8分钟，弃去上清液。 10、再固定：再加入新配固定液5毫升，打匀，静止30分钟。 11、再离心：以1000转/分离心8分钟，弃去上清液。 12、四次固定：加入新配固定液0.5～1毫升，打匀制成细胞悬液。 13、制片：用滴管吸细胞悬液2～3滴，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，并在酒精灯的火焰下通过几次，促使细胞平铺于载玻片上，并在空气中晾干或用电吹风吹干。 14、染色：用Giemsa染液染色30分钟（取Giemsa原液1份，pH7.4的磷酸9份），然后取出玻片，用蒸馏水轻轻冲洗，并晾干。 15、镜检及摄影：将染色后的玻片先用低倍镜作全面检查，寻到良好的分裂相后，
外周血染色体制备与分析技术规范 原理： 在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。具有用血量少、操作简单等优点。 1、实验材料 2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。 2、培养液配制 无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂： RPMI 1640或199 90% 小牛血清 10% PHA（自制） 0.1ml 3% 肝素 10u/ml 2% 双抗 100u/ml（选择） 分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。
3、植物油凝素的制备 植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。 （A）干品制备法 （1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时； （2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。每8-12小时摇荡一次。（也可一次性加100ml生理盐水）； （3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用； （4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。（B）鲜品制备法： （1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟； （2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口； （3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30 分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。 检查人染色体的数目、结构是否正常。
实验五人类染色体标本制备 【目的要求】 1．熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。 2．初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。 3．了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。 【实验原理】 人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。 在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。人外周血的有形 成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞(主要是小淋巴细胞)具有潜在的细胞分 裂能力。 培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素(PHA)可使处于G0期、具有潜在分裂能力的淋 巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体抑制剂 秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075 mol/L KCl对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等 过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。 制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分 析的过程称为染色体非显带核型分析。 【实验用品】 (一) 材料：人外周静脉血。 (二) 器材：吸管、刻度离心管、量筒、5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、 冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒 精棉球、显微镜、废液缸。 (三)试剂 1. RPMI1640培养液 (1) RPMI1640：RPMI1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。 (2) RPMI1640培养液：每100 ml RPMI1640培养液中含RPMI 1640 80 ml、灭活的小牛血 清20 ml、PHA 50 mg、青霉素(终浓度100 U/ml)、链霉素10000 μg (终浓度100 μg /ml)， 15磅、20min高压灭菌的NaHCO3调pH至7.2～7.4，分装20小瓶，每瓶5 ml。 (3) 配制方法 配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2 d，取出后用自来水冲洗15次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20 min高压灭菌。 新瓶塞等橡胶类制品用水洗刷后，用0.5mol/L NaOH煮沸20min，自来水冲洗；用0.5mol/L HCl煮沸20 min，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，在双蒸水中浸泡24h；浸泡后取出晾干，包装后高
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
实验六人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 实验目的 1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。 2、初步掌握人外周血淋巴染色体的制备技术。 实验用品 1、器材：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（附照相装置）、隔水式恒温培养箱、干燥箱、水平式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸气消毒锅、真空泵（或电动吸引器）、10ml刻度离心管、10ml培养瓶（可用环磷酰胺药瓶代）、2ml注射器、吸管、滴管、试管架、三角烧瓶、染色缸、酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷盘、铝制饭盒、消毒用酒精棉球与碘酒棉球等。 2、材料：人外周血 3、试剂：RPMI l640培养液（含10~20％小牛血清）、碳酸氢钠（AR）、PHA、青霉素、链霉素、肝素、5％NaHCO 3 溶液、1mol／L HCl、三蒸水或双蒸水、0.075 mol／L KCl、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液，pH6.8的磷酸缓冲液。 实验原理 据测定，健康成年人体内的淋巴细胞总数约有500×109，其中约有2％在外周血中循环。在外周血的淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主（每毫升血中的含量可 达1~3×106个）。在通常情况下，它们都处于间期的G 0或G 1 期，所以很难见到 正在分裂的淋巴细胞。但是，Nowell（1960）发现，从芸豆（phaseolus vulgaris）中提取的能使红细胞凝集的物质一植物血球凝集素（phytohemagglutinin，PHA）可以刺激淋巴细胞进行有丝分裂。在PHA的作用下，处在G 期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂，当体外培养至72小时左右时，大多数淋巴细胞已处于第二增殖周期内，此时用有丝分裂的阻断剂秋水仙素（colchicine）处理细胞可使正在分裂的细胞都停止在中期，再经低渗、固定等处理，便可得到较多可供分析的中期染色体。 以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方便，用血量少（0.3～1.0ml即可），培养简单等优点，故该方法在临床上已得到广泛的应用。 内容与方法
人外周血染色体制备 1. 实验原理人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期（或G0期），但在体外给予一定的条件，进行培养，经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。在培养液中加入植物血凝素（PHA），淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，使细胞分裂停止在中期，同时它可改变细胞质的黏度，引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1ml外周血中一般含有约（1～3）106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。本节介绍人外周血淋巴细胞的悬浮培养法，以及染色体标本的制备。 2. 试剂与器材 （1）2ml注射器、培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20min。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。 （2）超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。 （3）试剂： ①培养基的配制： RPMI 1640培养基4ml 小牛血清1ml 青霉素和链霉素各100IU/ml PHA 0.2ml 肝素1小滴 以5% NaHCO3调pH至7.2～7.4, 4℃备用。 ②肝素：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，灭菌。 ③秋水仙素：生理盐水配制成20μg/ml浓度，灭菌，分装，置－20℃。 ④低渗液：0.075mol/L KCl。 ⑤固定液：甲醇∶冰乙酸（3∶1），临时配制。 ⑥Giemsa工作液：1份原液和９份磷酸缓冲液，临时配制。 ⑦磷酸缓冲液：1/15mol/L Na2HPO4、1/15mol/L KH2PO4等体积混合。 ⑧5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。 3. 实验步骤 （1）接种，培养。 ①在无菌条件下，用灭菌注射器吸取0.2%肝素液（生理盐水配制，灭菌）0.2ml，湿润针筒后，采静脉血1～2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。 ②无菌条件下，将肝素化血液滴入至外周血培养基内，每5ml培养液内滴入血滴28～30滴（7号针头）轻轻混匀。 ③置37℃恒温箱内，静止培养68～72h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象，可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。 ④终止培养前2～3h，加入浓度为20μg/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3～4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2～3h，以积累较多停止在中期的分裂象。 （2）制片。 ①收获细胞：由恒温箱取出培养瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/min，离心10min，去上清液。 ②低渗处理：加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml，反复吹打（约一百次）后，置37℃水
人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究 近年来，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术受到了研究者们的 极大关注，为研究人类基因组的结构、组成、表达、功能以及毒性性 质等提供了重要的理论支持。 一、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术 1、技术基础：染色体制备技术基于染色体延伸链分析技术，可以在特 定细胞类型中获得更多有关人外周血淋巴细胞的信息。 2、实验方法：首先，经过放免定向损伤，用VP-16/Adr真核表达载体PCR形成染色体重组，生成环状染色体；然后，用PCR用LUC7+2分 离染色体，形成环染色体；最后，用IMD技术将染色体细化为单个的LUC7+2染色单体，并用Cross-Linking（CL）技术衍生细胞凋亡程序，即可获得高分辨率的染色体。 二、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术的应用 1、研究基因表达和表达调节：通过对人外周血淋巴细胞的染色体制备，可以研究基因表达和表达调节机制、调控水平及其功能，有助于研究 人体健康和病理状态的机制。
2、研究药物作用：人外周血淋巴细胞的染色体制备技术可以很好的帮 助研究中药的作用机制及其药效，为临床治疗使用提供理论依据。 三、未来发展 1、对不同类型细胞的染色体制备技术的研究：进一步研究不同细胞的 染色体制备技术，提供更多的信息，以更好地研究基因结构和功能。 2、研究不同材料的染色体制备技术：进一步完善不同类型材料染色体（如核酸、细胞类型或体液类型）染色体制备技术，为研究更多的生 物信息提供参考。 综上所述，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术日益受到研究者 们的重视，他们可以利用这项技术研究人体健康状态及病理状态机制、研究药物作用机制和提供理论依据来指导临床治疗，为健康科学发展 提供重要理论支撑。未来，研究将持续着眼不同类型细胞和不同材料 染色体制备技术，更加完善技术，帮助研究者更好地了解人体基因组 结构、表达、功能和毒性性质的信息。
实验七、人类外周血染色体标本制备、G带观察及核型分析 姓名：学号：班级： 同组同学：带教教师实验日期： 一、实验原理（Principle） 在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。 在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa染色。胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。通过胰酶处理使G带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。由此可见在G带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。 二、操作步骤（Operational procedure） （1）人类外周血染色体标本制备 1、采血 2、培养:RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。 3、秋水仙素(colchicine)处理:在终止培养前2-3小时，加入秋水仙素。 4、离心:以1000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀并用吸管打匀。 5、低渗处理:加8毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution），用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。 6、预固定:低渗后，加新配的固定剂（甲醇：冰醋酸，3:1 ）１毫升，打匀。 7、离心:以1000 rpm离心10分钟，弃上清。 8、固定:加入5ml新配置的固定液，悬浮细胞，室温固定10-15分钟。 9、离心:1000rpm离心10分钟，弃上清。 10、再固定：加入5ml固定液（甲醇：冰醋酸=1：3），室温固定10-15分钟。 11、再离心:1000转/分离心10分钟，弃去上清液。 12、再固定:加入固定液（甲醇：冰醋酸1：1）打匀，固定10－15分钟。 13、制片:固定后，1000转/分离心留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在酒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥。