2.细胞生物学研究方法
生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验得以发现和发展的。方法上的突破，对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用。
2.1显微成像技术
最早的光学显微镜是1590年Z.J a n s s e n和他的侄子H.J a n s s e n共同研制的。其后，R o b e r t H o o k e和A n t o n i e v a n L e e u w e n h o e k对光学显微镜的分辨本领进行了极大的改进，由此发现了细胞。
20世纪30年代发展起来的电子显微镜导致细胞结构和功能研究发生了一次革命，使生物学家得以从亚显微水平上重新认识细胞(图2-1)。
图2-1光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构
2.1.1光学和电子显微镜成像原理
不管是何种显微镜，镜像的形成都需要三个基本要素:①照明系统，②被观察的样品，③聚焦和成像的透镜系统(图2-2)。
图2-2光学和电子显微镜的基本结构
在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。
照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素，因为波长决定能被检测样品的最小极限。波长越长，波幅的跨度就越大，所能观察到的物体极限就越大(图2-3)。
图2-3波的移动、波长和干扰请对图2-3作出说明
●光学和电子显微镜成像的光学原理是相同的，其中最重要的是光子和电子都具有波的行为。当光子和电子穿过透镜到达聚焦点时，由于波的干涉
(i n t e r f e r e n c e)性质而成像。实际上通过透镜观察到的样品的镜像是通过透镜波的干涉累加或消除，即衍射(d i f f r a c t i o n)的结果。
●焦距与角孔径
焦距(f o c a l l e n g t h)是透镜的中心平面到焦点的距离(图2-4)，而角孔径
(a n g u l a r a p e r t u r e)是光从样品进入显微镜的物镜半角α(图2-5)，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜，最好的光学显微镜的角孔径大约是700。
图2-4透镜的焦距
图2-5透镜的角孔径
角孔径是光从样品进入透镜的半角α。(a)小孔径透镜;(b)大角孔径透镜。角孔径越大，透过透镜的信息越多，最好的玻璃透镜的角孔径大约是700
■分辨率(r e s o l u t i o n)
透镜最重要的性质就是它的分辨率，分辨率(R)可用以下公式计算:
R=0.61λ/n S i nα
其中:n=聚光镜和物镜之间介质的折射率.空气为 1.油为 1.5;
α=样品对物镜角孔径的半角，s i nα的最大值为1;
λ=照明光源的波长。
0.61是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度。
上式中n S i nα的量称为物镜的数值孔径(n u m e r i c a p e r t u r e)，缩写为N A，因此显微镜的分辨率的表示公式可改为:R=0.61λ/N A
从上式可知，角孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径越大，这些都可以使分辨率提高。
由于分辨率表示的是能够区别两个点间最近距离的能力，所以R值越小，分辨率越高。从分辨率的表达式来看，N A越大，分辨率越高，或者波长越短，分辨率越高。
■分辨极限(l i m i t r e s o l u t i o n)与放大率(m a g n i f i c a t i o n)
●一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0.2μm，称之为分辨极限(l i m i t r e s o l u t i o n)。
●最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。总放大率=物镜放大率×目镜放大率，放大率同样受分辨极限的限制。一般来说，光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的1000倍。由于透镜的数值孔径的范围是 1.0～
1.4，所以光学显微镜在用空气作介质时最大放大倍数为1000倍，用油镜则为1400倍。
●增大角孔径或缩短波长可提高光学显微镜的分辨率。如果用波长比普通波长短得多的电子波代替光波，分辨率可大大提高，电子显微镜就是在这种需求下被发明的。表2-1是光学显微镜与电子显微镜某些特性的比较。
表2-2电子显微镜与光学显微镜的基本区别
2.1.2常用的光学显微镜
光学显微镜(l i g h t m i c r o s c o p e)是光学显微技术的主要工具，自问世以来已有400多年历史。光学显微镜是利用光线照明，使微小物体形成放大影像的仪器。现今使用的光学显微镜都是由几个透镜组合而成，所以又称为复合显微镜
(c o m p o u n d m i c r o s c o p e)(图2-6)。
图2-6普通光学显微镜的基本结构
■普通双筒显微镜(b i n o c u l a r m i c r o s c o p e)
比较高级的显微镜上都设有倾斜式的双目镜筒(图2-7)。在物镜转换器上方装有四个棱镜，使经过物镜的光线平分为两路到达目镜，故双筒显微镜的亮度要比单筒者为暗。双筒显微镜的优点为同时用两眼观察，有较强的立体感。
图2-7双筒显微镜
■荧光显微镜(f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e)
荧光显微镜的工作原理是利用紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等)发出强烈的紫外线光源，通过照明设备把显微固定的切片或活染的细胞透视出来，基本成像原理示于图2-8。
图2-8荧光显微镜的光通路
■相差显微镜(p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p e)
相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很大的不同(图2-9)，可用于观察未染色的活细胞(图2-10)。
图2-9相差显微镜的光学部件及光线通路
图2-10相差显微镜观察的活细胞
■暗视野显微镜(d a r k f i e l d m i c r o s c o p e)
暗视野显微镜是利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以观察未经染色的活体或胶体粒子(图2-11)。
图2-11暗视野显微镜的光学
暗视野显微镜主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。
■倒置显微镜
倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样，所不同的只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。前者置于载物台之下，而后者在载物台的上方。集光器与载物台之间的工作距离提高，可以放置培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行照明和观察(图2-12)
图2-12倒置显微镜
2.1.3光学显微镜的样品制备与观察
由于大多数细胞的成分不影响光线的穿透，无法形成反差，所以在一般光学显微镜下，几乎看不清未经处理的细胞。为了看清细胞内含物，就必须对细胞样品进行一些特殊的处理，为此建立和发展了样品的各种制备技术。
■样品的固定(f i x a t i o n)
●目的:生物组织在染色前先进行固定的目的是杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。
●做法:样品固定的最简单做法是将样品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。一般用具有缓冲作用的醛类固定液，用甲醛或戊二醛作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。
■包埋和切片(e m b e d d i n g a n d s e c t i o n i n g)
样品制备的第二步是将固定的组织制备成切片。为此，样品首先要被包埋在介质中，通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，然后将之硬化成固体的包埋块，随后用专门的切片机切割包埋块，制备成薄切片(图2-13)。适用于光学显微镜观察的切片厚度为l～10μm。
图2-13用切片机进行样品切片
■染色(s t a i n i n g)
大多数细胞总重量的70%是水，对可见光几乎是透明的，只有很少的内含物不透光。染色的目的就是给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。19世纪初，发现某些有机染料可染生物组织，并对细胞特殊部位的着色具有选择性。如苏木精(h e m a t o x y l i n)对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红(e o s i n)可使细胞质染色；苏丹染料(S u d a n d y e s)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。但对许多染料的特异性染色机理尚不清楚。
■细胞化学技术(c y t o c h e m i s t r y)
●采用比有机染料更为特异的染色剂及酶细胞化学方法，可以了解细胞和组织中大致的化学组成，及某些活性基团或酶的存在。
●为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类，常利用一些显色剂与所检测物质中特殊基团的特异性结合，通过显色剂在细胞中出现的部位和颜色显示的程度，从而判断被检物质在细胞中的分布和含量。例如，利用F e u l g e n反应(图2-14)可特异性检测细胞中的D N A，P A S反应可用于检测植物中的淀粉、纤维素及动物细胞中的糖原、粘蛋白等。
●将细胞或组织切片与适宜的底物共同温育，切片中的酶会水解底物，再将所释放物质转变成不溶性有色化合物，后者所在部位即是组织细胞中酶的活性部位。
图2-14F e u l g e n反应
■放射自显影(a u t o r a d i o g r a p h y)
放射自显影技术是用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置，基本过程如图2-15所示。
图2-15放射自显影术
2.1.4电子显微镜(e l e c t r o n m i c r o s c o p e)
光源与分辨率的关系同样适于电子束，由于电子束的波长比光的波长短100,000倍，因而用电子束代替光波，可大大提高显微镜的分辨率。
1932年德国学者M a x K n o l l s和E r n s t R u s k a发明了第一台电子显微镜，开拓了超微世界，发现了许多光镜下看不到的结构，如细胞膜、线粒体、细胞核、高尔基体、中心粒等细胞器的细微结构。将在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构(s u b m i c r o s c o p e s t r u c t u r e)，或超微结构(u l t r a s t r u c t u r e)。
电子显微镜与光学显微镜在总体结构的设计上有很大的差别(图2-16)。在种类上，电镜可分为两大类:透射电子显微镜和扫描电子显微镜。
细胞生物学教案 （来自https://www.doczj.com/doc/df6339937.html,）目录 前言 第一章绪论 第二章细胞结构概观 第三章研究方法 第四章细胞膜 第五章物质运输与信号传递 第六章基质与内膜 第七章线粒体与叶绿体 第八章核与染色体 第九章核糖体 第十章细胞骨架 第十一章细胞增殖及调控 第十二章细胞分化 第十三章细胞衰老与凋亡
前言 依照高等师范院校生物学教学计划，我们开设细胞生物学。 一、学科本身的重要性 要最终阐明生命现象，必须在细胞水平上。细胞是生命有机体最基本的结构和功能单位，生命寓于细胞之中，只有把各种生命活动同细胞结构相联系，才能在细胞水平上阐明各种生命现象。世界著名生物学家Wilson（德国人）曾说过：“一切生物学问题的答案最终要到细胞中去寻找”。 二、学科发展特点 细胞生物学涉及知识面广、内容浩繁且更新迅速。它同生物化学、遗传学形成生命科学的鼎立三足，既是当代生命科学发展的前沿，又是生命科学赖以发展的基础。 三、欲达到的目的 通过系统地学习细胞生物学，丰富细胞学知识，以适应当代人类社会知识结构发展的需求，也是为考研做准备。 本课程讲授51学时，实验21学时，共72学时。 参考资料 1 De.Robertis，《细胞生物学》，1965年（第四版）；1980年（第七版）《细胞和分子生物学》 2 Avers，“Molecular Cell Biology”， 1986年 3 Alberts，《细胞的分子生物学》，“Molecular biology of the cell”，1989年 4 Darnell，《分子细胞生物学》，1986年（第一版）；1990年（第二版）“Molecular Cell Biology”5郑国錩，细胞生物学，1980年，高教出版社；1992年，再版 6 郝水，细胞生物学教程，1983年，高教出版社 7 翟中和，细胞生物学基础，1987年，北京大学出版社 8 韩贻仁，分子细胞生物学，1988年，高等教育出版社；2000年由科学出版社再版 9 汪堃仁等，细胞生物学，1990年，北京师范大学出版社 10 翟中和，细胞生物学，1995年，高等教育出版社，2000年再版 11 郑国錩、翟中和主编《细胞生物学进展》， 12翟中和主编《细胞生物学动态》，从1997年起（1—3卷），北师大出版社 13徐承水等，《分子细胞生物学手册》1992，中国农业大学出版社 14徐承水等，《现代细胞生物学技术》1995，中国海洋大学出版社 15徐承水，《细胞超微结构研究》2000，中国国际教育出版社 学术期刊、杂志 国外：Cell、Science、Nature、J.Cell Biol.、J.Mol. Biol. 国内：中国科学、科学通报、实验生物学报、细胞生物学杂志等
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
第二章细胞生物学研究方法 第三节细胞分离技术 一、离心技术 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。 （一）、差速离心（differential centrifugation） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器（图2-22）。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 图2-22 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 （二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2-23）。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分
离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。 图2-23 ?A等速度沉降，B等密度沉降 1、速度沉降 速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降 等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质
细胞由于体积小，一般需在显微镜下观察，显微镜一般分为光学显微镜与电子显微镜。显微镜的放大倍数由目镜与物镜决定：放大倍数=物镜×目镜。清晰与否由分辨率（指能够分辨出相邻两质点间的最小距离，距离越小，分辨率越高）决定。一般来说，光镜分辨率为0.2微米，电镜分辨率为0.2纳米。分辨率的限制因素为：入射光波长，介质折射率，物镜镜口角。 光学显微镜结构为：光学显微系统，光源，机械支撑系统，有些还有图像采集系统。常见有三种：复式显微镜，相差显微镜以及荧光显微镜。 复式显微镜分为单筒显微镜，双筒显微镜。复式光学显微镜较为简单，照明系统为可见光，光学系统为玻璃透镜（目镜，物镜以及聚光镜），另外还有机械与支架系统。普通复式显微镜的缺点：由于光的干涉，衍射现象，光线通过样品时，两个相邻焦点的图像可能发生重叠，进而无法分辨，导致存在分辨极限。 相差显微镜是指利用光线的干涉，衍射特征，时相位差转变为振幅差，增强样品的明暗对比，从而观察无色透明样品的装置。相差显微镜的特殊构件为相差板，环状光阑。相差显微镜的特点：样品无需染色，可观察活细胞及细胞器动态。 荧光原理：荧光分子吸收入射光能量以后，电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。荧光显微镜原理：利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。荧光显微镜的优点：荧光显微镜主要用于定性，定位研究细胞内特异性蛋白质，可以观察活细胞。缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。 光学显微镜样品的制备：固定，包埋，切片，染色 固定：目的是杀死细胞，稳定细胞成分，以便进一步处理和切片是不受破坏。
第二章细胞生物学研究方法 (the research method in the cell biology) 教学目的 1、了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用； 2、认识工具和方法与学科发展的相关性。 教学内容 本章从以下5个方面介绍了细胞生物学的研究方法: 1．显微成像技术 2．细胞化学技术 3．细胞分选技术 4．细胞工程技术 5．分离技术 6．分子生物学方法 计划学时及安排 本章计划3学时。 教学重点和难点 生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,方法上的突破,对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用，这是学习本章应确立的基本思想。 1．显微成像包括直接成像和间接成像。显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。在光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具, 透射和扫描电镜的是两类主要的电子显微镜, 对其基本结构、工作原理和样品制备方法则是学习的重点。 2．细胞化学技术介绍了酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术, 其中流式细胞分选技术是细胞生物学和现代生物技术中的重要技术, 应重点掌握。 3．细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内
一、章（节、目）授课计划第页
二、课时教学内容第 技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技 术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的 方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有: 核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨率 R=λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 （2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的 比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是 100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决 定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的 d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： M=d′/d 二、显微镜的分类 现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学
第三章 细胞生物学研究方法 第一节细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sinα/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1．FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2．不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜 的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微 小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一）电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大有效放大倍 数 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二）主要电镜制样技术介绍
第二章细胞生物学研究方法 一、名词解释 1、resolution 2、显微结构 3、超微结构 4、细胞培养 5、原代培养 6、传代培养 7、细胞融合 8、cell line 二、选择题 【A1型题】 1、在光学显微镜下所观察到的组织或细胞结构一般称为（） A．显微结构B．超微结构C．亚显微结构D．分子结构E．微细结构 2、研究细胞的超微结构一般要利用下列哪种技术（） A．光学显微镜技术B．电子显微镜技术C．X射线衍射技术D．离心技术E．荧光显微镜 3、一般显微镜的分辨力数值约为0.2μm，人眼在25cm处的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最高放大倍率为（） A．2000×B．1000×C．100×D．200 ×E．10000× 4、光学显微镜能够分辨出其详细结构的有（） A．细胞B．线粒体C．核仁D．叶绿体E．包被小泡 5、透射电子显微镜的分辨力约为（） A．0.2μm B．0.2mm C．0.2nm D．0.2?E．0.2cm 6、扫描电子显微镜可用于（） A．获得细胞不同切面的图像B．观察活细胞C．定量分析细胞中的化学成分 D．观察细胞表面的立体形貌E．都不是 7、适于观察无色透明活细胞微细结构的光学显微镜是（） A．相差显微镜B．暗视野显微镜C．荧光显微镜D．偏振光显微镜E．普通显微镜 8、为什么透射电镜的照片没有颜色（） A．细胞内部结构无颜色，都为灰白色的暗影B．彩色显微照片太昂贵了 C．彩色胶片尚未发明D．照相的底片接受的是穿过样品的电子，而不是决定了颜色的各种波长的光E．照片没处理 9、光学显微镜有一个放大倍数为40的物镜和放大倍数为10的目镜，成像的总放大倍数是（）A．40×B．50×C．400×D．450 ×E．1000× 10、适于观察细胞表面及断面超微结构三维图像的仪器是（） A．普通光镜B．荧光显微镜C．相差光镜D．扫描电镜E．透射电镜 11、分离细胞内不同细胞器的主要技术是（） A．光学显微镜B．电镜技术C．离心技术D．电泳技术E．层析技术 12、利用放射性核素标志物质能使照相乳胶感光的原理来探测细胞内某种物质的含量与分布的方法是（）A．放射自显影技术B．免疫荧光显微镜技术C．免疫电镜技术D．液相杂交技术 E．原位杂交技术 13、适于观察细胞内超微结构的显微镜是（） A．透射电镜B．扫描电镜C．荧光显微镜D．倒置显微镜E．相差显微镜 14、直接取材于机体组织的细胞培养称为（）
一、章（节、目）授课计划第页 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
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二、课时教学内容第页 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大 的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern 杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： GAGGAGAGGAFFFFAFAF
一、显 微成像技术 （一）普通光学显微镜 ?1.构成： ?①照明系统 ?②光学放大系统 ?③机械装置 ?2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 ?3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 ?光学显微镜的分辨力R=0.61λ/N．A． ?其中λ为入射光线波长； ?N．A．为镜口率＝ｎs i nα/2； ?n=介质折射率； ?α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 2、常用的光学显微镜 ?（1）普通双筒显微镜有较强的立体感。 ?（2）荧光显微镜：研究细胞内物质的吸收、运输、 及化学物质的分布及定位以紫外为光源。 ?（3）相差显微镜，观察无色、透明、活细胞中的 结构（未经染色的活细胞）产生明暗差异 ?（4）暗视野显微镜：观察未经染色的活体或胶体 粒子适合观察细胞核、线粒体、细菌、霉菌等。 ?（5）倒置显微镜培养细胞观察03年选择题 倒置显微镜i n v e r s e m i c r o s c o p e ?物镜与照明系统颠倒； ?用于观察培养的活细 胞，通常具有相差或 D I C物镜，有的还具有 荧光装置。 ?学习重点： ?1.光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括 普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微 镜、倒置显微镜。掌握电子显微镜的原理和样品制备方 法，以及和光学显微镜的差别． ?２.掌握酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技 术的原理 ?３.了解细胞培养和细胞融合、细胞生物反应器、染色体转 移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养 ?4.离心分离技术 ?这一章每年都有真题出现，大部分以填空，选择和判断的 题型出现，总体看来，题目难度在下降，但是实际应用的能力 越来越看重，07、08年就近30分的考题第二章：细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法 细胞生物学研究方法 第一节细胞形态结构的观察方法 第二节细胞及其组分的分析方法 第三节细胞培养与细胞工程 第四节细胞及生物大分子的动态变化 第五节模式生物与功能基因组的研究 第一节细胞形态结构的观察方法 第一节细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜 一、光学显微(light microscope)(P49,30) (一)普通复式光学显微镜 组成：光学放大系统、照明系统、镜架及样品调节系统； 性能参数：放大倍数、分辨率、清晰度、焦点深度、镜像亮度等，其中最重要的是分辨率。 分辨率（分辨本领）：能区分开两个质点间的最小距离。该距离越小，则分辨率越高。 显微镜的分辨率计算公式：D=0.61λ/[Nsin(α/2)] λ光源波长，α物镜镜口角，N介质折射率 光学显微镜的最大分辨率 α最大值140°；λ最小波长450nm；介质折射率N 油浸下1.5（N 空气1.0 ）； 因此普通光镜的分辨力极限为0.2微米，此数值亦为显微水平和亚微水平的分界点。（称为瑞利极限，Rayleigh limit） 普通光镜有效放大倍数（经验值）= 物镜最大镜口率（数值孔径NA numerical aperture）×1000 提高光学显微镜分辨力的手段 a、缩短照明光线波长； b、应用特殊光学效应，增强反差。 光学显微镜样品制备 取材 固定（fixation）：使用固定剂（fixative）杀死细胞，并使细胞结构尽可能接近活细胞； 包埋：石蜡 切片：切片机
脱蜡、染色：多种染料 封片、观察。 显微镜技术和计算机技术结合 倒置显微镜 （二）相差和微分干涉显微镜(P51，31) 1、相差显微镜：（phase-contrast microscope, Ph ） 1935年P. Zernicke(德)发明，1953年获得Nobel物理奖； 它利用光的衍射和干涉原理，将光的相位差（人眼无法感受）→振幅差（人眼可以感受）；无色透明物体中的细节表现为明与暗的对比； 适合观察活细胞和未染色的样品。 两束光波之间的相互干涉 2、微分干涉显微镜(P51，32)（differential－interference microscope ，DIM） DIM获得的反差取决于光线穿过样品折射率变化的速率。样品边缘结构反差增大（相对小的距离内折射率发生明显变化）。 Nomarski microscope 推荐阅读《细胞实验指南》下册，科学出版社，P896 （三）荧光显微镜（fluorescence microscopy） 原理：以紫外光为光源，激发标本中的荧光物质产生荧光，从而对某些物质进行定性和定位分析。 荧光种类： 自发荧光：细胞内某些天然物质被UV激发产生的荧光，如叶绿素产生血红色荧光。 诱发荧光：细胞中加入荧光染料，与特定成分结合，经过UV照射发出荧光。 （四）激光扫描共聚焦显微技术(P53，33)（laser scanning confocal microscope，LSCM） 推荐阅读 《细胞生物学荧光技术原理和应用》 刘爱平等 中国科学技术大学出版社 The Nobel Prize in Chemistry 2008 Green Fluorescent Protein, GFP GFP用途 作为报告基因构建基因工程载体； 目的基因的功能研究；
第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sin α/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm ）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1． FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2． 不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一） 电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二） 主要电镜制样技术介绍 制样要求：①要求样品很薄（数十纳米） ②要求保持精细结构 1．超薄切片技术 ①固定：保持样品形态结构，甚至超微和分子水平上结构。 固定剂：常用饿酸（OsO 4）和戊二醛等，另外有物理方法如高频微波。
2.细胞生物学研究方法 生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验得以发现和发展的。方法上的突破，对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用。 2.1显微成像技术 最早的光学显微镜是1590年Z.J a n s s en和他的侄子H.J a n s s e n共同研制的。其后，R o b e r t H o o k e和An t o n i e v a n L e e u we n h o e k对光学显微镜的分辨本领进行了极大的改进，由此发现了细胞。 20世纪30年代发展起来的电子显微镜导致细胞结构和功能研究发生了一次革命，使生物学家得以从亚显微水平上重新认识细胞(图2-1)。 图2-1光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构 2.1.1光学和电子显微镜成像原理
不管是何种显微镜，镜像的形成都需要三个基本要素:①照明系统，②被观察的样品，③聚焦和成像的透镜系统(图2-2)。 图2-2光学和电子显微镜的基本结构 在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。 照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素，因为波长决定能被检测样品的最小极限。波长越长，波幅的跨度就越大，所能观察到的物体极限就越大(图2-3)。
图2-3波的移动、波长和干扰
●光学和电子显微镜成像的光学原理是相同的，其中最重要的是光子和电子都具有波的行为。当光子和电子穿过透镜到达聚焦点时，由于波的干涉(i n t e r fe r e n c e)性质而成像。实际上通过透镜观察到的样品的镜像是通过透镜波的干涉累加或消除，即衍射(d i ffr a c t i o n)的结果。 ●焦距与角孔径 焦距(fo c a l l e n g t h)是透镜的中心平面到焦点的距离(图2-4)，而角孔径(a n g u l a r a p e r t u r e)是光从样品进入显微镜的物镜半角α(图2-5)，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜，最好的光学显微镜的角孔径大约是700。 图2-4透镜的焦距
第二章细胞生物学研究方法 姓名：李淼学号：09352044 班级：生科一班日期：10.12 我们知道，细胞层面的概念与发现离不开技术的支持，本章则为我们列举了几类基本的细胞生物学研究方法，它们是显微成像技术、细胞化学技术、细胞分选技术、细胞工程技术、分离技术以及分子生物学方法等。 显微镜的镜像形成需要3个基本因素：照明系统、被观察的样品、聚焦和成像的透镜系统。显微镜主要分为光学显微镜和电子显微镜，但两者的成像原理是相同的。光和电子都有波的行为，当光和电子穿过透镜到达焦距点时，由于波的干涉性质而成像。实际上通过透镜观察到的样品的镜像是衍射的结果。显微镜具有以下性质：分辨率（最重要）、最大分辨率、分辨极限与放大率。 我们需要了解常用的显微镜及其样品制备方法。光学显微镜包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜和倒置显微镜。相差显微镜使相位差变成振幅差，有利于我们管擦无色、透明、活细胞中的结构。暗视野显微镜使被检物体在黑暗的视野中呈现明亮的像，用以观察未经染色的活体或胶体粒子。 光学显微镜的样品粗略可以分为两类：整体和切片。对于切片要经过以下步骤处理才可以在光镜下看清楚：固定（具有缓冲作用的醛类固定液）、包埋（液体石蜡或树脂）和切片、染色、放射自显影。放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，在显影液中成为可见的“像”，从而定位定量检测生物大分子。 电子显微镜的电子束波长比可见光短100000倍，所以大大提高了显微镜的分辨率。将在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构或超微结构。主要的电子显微镜包括透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、扫描透射电子显微镜（STEM）、高压电子显微镜（HVEM）。投射电子显微镜是让电子穿透样品，而扫描电子显微镜是让电子束在样品表面扫描。扫描透射电子显微镜比较复杂，具有两者的功能，但技术要求高，需要非常高的真空度。高压电子显微镜的电压特别高，会大大减少造成染色体畸变的可能，细胞切片可以较厚。 电子显微镜的样品制备也需要固定、包埋、切片、染色等步骤，差别之一在于样品要更薄，需要使用超薄切片机。另一个差别在于样品不是放在玻片上而是载网上。还有几项技术用于电子显微镜的样品制备，包括负染色、喷镀技术、冷冻断裂复型和冷冻蚀刻。负染色由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮。 细胞化学技术包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术和其他细胞化学技术。酶细胞化学技术是在酶的作用下产生反应产物，经捕捉反应来间接证明酶定位的反应，具有特异性。免疫细胞化学技术是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。免疫细胞化学技术就是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。 细胞分选技术主要借助流式细胞仪实现细胞和染色体的分选。，包括测量细胞的大小、形状、细胞DNA、RNA含量和细胞总蛋白。细胞分选中所用的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白结合的抗体。染色体分选中使用的探针是同目标染色体互补的寡聚核苷酸，能够形成稳定的杂交体。 细胞工程技术包括细胞培养、细胞融合、单克隆抗体技术、细胞核移植克隆技术等。细胞培养要注意动植物的区别。动物细胞经过体外培养由原代细胞形成细胞系，最终形成具有特殊性质的细胞株。植物组织是利用细胞全能型去分化形成愈伤组织然后再分化形成新的植
第二章细胞生物学研究方法 【教学大纲】 1.掌握普通光学显微镜基本原理和使用方法 2.掌握细胞组分的分离分析方法 3.掌握常用的细胞化学分析法的原理和操作技术 4.了解细胞生物学现代技术 【复习纲要】 细胞生物学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,细胞生物学研究方法是使细胞生物学不断发展的前提与推动力量。现代细胞生物学研究方法主要分四大类：显微技术、细胞组分分析与原位检测技术、细胞培养与细胞工程技术和分子生物学技术。 1．显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。光学显微技术中常用的普通光学显微镜是利用光线照明，将微小物体放大影像的光学仪器，是普遍使用的重要工具。荧光显微镜是利用一定波长紫外线作为激发光源照射标本，使标本中的荧光物质受激发后产生荧光经放大成像。相差显微镜是利用相差装置将透过细胞标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，从而使细胞内的各种结构之间呈现出清晰可见的明暗可比的特殊光学显微镜。暗视野显微镜适于观察活细胞或微粒的存在及运动状态。共焦激光扫描显微镜可用于观察活体组织如胚胎、大脑皮层内微循环及细胞内复杂网络如内质网膜系统、细胞骨架系统的三维结构等。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具。电镜和光学显微镜的成像原理不同，它是以电子束代替了光源，电磁透镜代替光学显微镜的聚光镜、物镜和目镜。电子束在不同的电压下有不同的短波长，其波长比可见光短得多，所以电镜的分辨率要比光镜的分辨率大1000倍。现在电镜的类型很多，有透射电镜、扫描电镜、超高压电镜、分析电镜、扫描隧道电镜等。 2. 细胞组分分析与原位检测技术是研究细胞组分的性质、结构和功能的重要手段。它包括细胞组分分级分离技术、放射自显影技术、细胞化学技术与原位杂交技术等。细胞组分分级分离（cell fractionation）技术是研究细胞内细胞器和其它各种细胞组分的化学性质和功能的一种主要方法。细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理，常用不
第三章细胞生物学的研究方法 一、填空题 1．透射电子显微镜由、、、三部分所组成。 2.在酵母人工染色体制备过程中，要用酶脱去酵母的细胞壁，使之成为、并且用进行观察和计数。 4.观察贴壁生长的培养动物细胞可用，而观察脱去细胞壁的植物细胞，则要用。 5. 物质在紫外光照射下发出的荧光可分为和两种，其中需要将被照射的物质进行染色。 6．用紫外光为光源照射物体比用可见光的分辨率要高，这是因为。 7．通过或形成的细胞叫细胞株。 9.灭活的仙台病毒之所以能够诱导细胞融合，是因为。 10. 相差显微镜与普通显微镜的不同是用替代可变光阑，用代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。 11．倒置显微镜与普通显微镜的不同在于其。 12．若用紫外光为光源，光学显微镜的最大分辨率为，透射电子显微镜的最大分辨率为，扫描电镜的分辨率为。 13. 显微镜的分辨本领是指能够能力，用来表示。 14．高压电镜的电压在120kV以上，优点是：、。 16. 细胞培养的突出特点是：可在。 18.贴壁生长的细胞有三个特点：①；②；③。 19. 用细胞培养法来研究生命活动规律的局限性是。 20．超薄切片染色常采用、染色。 21．免疫细胞化学技术是用来定位细胞中的物质。 22．电子显微镜使用的是透镜，而光学显微镜使用的是透镜。 23.电子染色是用来增强电子的散射能力。 24．在光学显微镜下见到的结构称为，在电子显微镜下见到的结构称为。25．细菌质膜的多功能性主要表现在：具有的呼吸作用，具有的分泌作用，具有的信号传导作用。 27.在同位素追踪技术中，用于研究DNA的同位素标记的前体物是。 28．单克隆抗体技术是将与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。 29. 可用技术来研究质膜结构的不对称性。 31.动物细胞培养所用的合成培养基中除含多种、和外，一般还需加入。 32．用荧光显微镜观察细胞时，经吖啶橙染色的细胞中的DNA发荧光，而RNA发荧光。33．适于观察活细胞的光学显微有、和等。