第二章细胞生物学研究方法
(the research method in the cell biology)
教学目的
1、了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用；
2、认识工具和方法与学科发展的相关性。
教学内容
本章从以下5个方面介绍了细胞生物学的研究方法:
1．显微成像技术
2．细胞化学技术
3．细胞分选技术
4．细胞工程技术
5．分离技术
6．分子生物学方法
计划学时及安排
本章计划3学时。
教学重点和难点
生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,方法上的突破,对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用，这是学习本章应确立的基本思想。
1．显微成像包括直接成像和间接成像。显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。在光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具, 透射和扫描电镜的是两类主要的电子显微镜, 对其基本结构、工作原理和样品制备方法则是学习的重点。
2．细胞化学技术介绍了酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术, 其中流式细胞分选技术是细胞生物学和现代生物技术中的重要技术, 应重点掌握。
3．细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内
容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。
4．分离技术是一大类技术的总称，包括细胞组分的分离和生物大分子的分离, 应掌握各种分离技术的原理和用途。
本章对分子生物学方法作了简要介绍, 为今后的学习奠定基础。简言之，本章教学重点是仪器方法的基本原理和基本应用；教学难点是电镜制样及分子杂交技术。
教学方法 讲授、参观 教学过程 2.1显微成像技术
2.1.1、光学和电子显微镜成像原理
共同点：照明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统 不同点：
? 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 ? 电子显微镜：以电子束为光源。
表3-1电镜与光镜的比较
电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造
2.2.2、常用的光学显微镜
⑴ 普通光学显微镜 ◆构成： ? ①照明系统
利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化
利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差
要求真空
不要求真空
要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa
玻璃透镜
玻璃透镜
电磁透镜
可见光（400-700） 紫外光 （约200nm)
电子束
（0.01-0.9）
200nm 100nm
LM FM EM
成像原理
真空 透镜 光源
分辨本领
显微镜
? ②光学放大系统
? ③机械装置
◆原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。
◆分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。
? R=0.61λ/n sin(α/2)或者R=0.61λ/N．A．
其中λ为入射光线波长；N．A．为物镜的数值孔径（numerical aperture)，sinα/2，
n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。
? 思考：如何提高显微镜的分辨能力？
◆显微镜的几个光学特点：
?制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65-1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。
?sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05-0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
?普通光线的波长为400-700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。
⑵荧光显微镜(Fluorescence microscope)
?特点：光源为紫外线，波长较短；
分辨力高于普通显微镜；
有两个特殊的滤光片；
照明方式通常为落射式。
?用于观察能激发出荧光的结构。
用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
⑶激光共聚焦扫描显微境(Laser confocal scanning microscope, LCSM)
?用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。
?能显示细胞样品的立体结构。
?分辨力是普通光学显微镜的3倍。
?用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。
⑷相差显微镜
? 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
①环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。
②相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍
射光的相位推迟1/4λ。
?用途：观察未经染色的玻片标本
⑸倒置显微镜（inverse microscope）
?物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。
2.2.3、光学显微镜的样品制备
⑴样品的固定
⑵包埋和切片
⑶染色
⑷放射自显影
2.2.4、电子显微镜
⑴透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）
◆原理：
? 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。
? 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。
? 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。
? 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。
◆制样技术
①超薄切片
?电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。
?通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。
②负染技术
?用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。
③冰冻蚀刻（freeze-etching）
? 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。
⑵扫描电子显微镜
?20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。
?分辨力为6-10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。
? 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用
来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。
? 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
⑶扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope，STM)
? 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV-2V），针尖与样品之间形成隧道电
流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化
转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。
? 分辨率：横向为0.1-0.2nm，纵向可达0.001nm。
? 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。
2.2 细胞化学技术
2.2.1、酶细胞化学技术
通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。
如：
★金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。
★Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。
★联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。
★脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。
★茚三酮反应：显示蛋白质。
2.2.2、免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）
利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。
? 免疫荧光技术（immunofluorescent technique）
快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限
? 免疫电镜技术，包括：
免疫铁蛋白技术
免疫酶标技术
免疫胶体金技术
应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；
膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等
2.2.3、其他细胞化学技术
显微光谱分析技术
?细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。
?可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。
2.3 细胞分选技术
流式细胞术
? 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。
? 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信
号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细
胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式
细胞计（flow cytometer）。
2.4细胞工程技术
2.4.1、细胞培养
几个概念：
? 原代培养（primary culture）：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养（Passage）
?细胞株（cell strain）：由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cell strain)。即通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。
?细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)。
? 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
⑴动物细胞培养
? 群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；
? 克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。
⑵植物细胞培养
◆外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行
无性繁殖；制取代谢产物。
◆悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。
◆原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：
①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；
③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
◆单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。
2.4. 2、细胞融合与单克隆抗体技术
?通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。
?同核体：相同基因型的细胞融合而成。
?异核体：不同基因型的细胞融合而成。
?自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。
?诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。
?诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。
举例：动物细胞核移植克隆技术（Dolly的诞生）
2.5分离技术
2.5.1、离心分离技术
?是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。
?转速为10-25kr/min的离心机称为高速离心机。
?转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。
?目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。
⑴差速离心(Differential centrifugation)
?特点：
–介质密度均一；
–速度由低向高，逐级离心。
?用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。
?沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。
?可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
⑵密度梯度离心
?用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。
?类型：速度沉降、等密度沉降。
?常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
?分离活细胞的介质要求：
–1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；
–2）PH中性或易调为中性；
–3）浓度大时渗透压不大；
–4）对细胞无毒。
举例：CsCl 密度梯度离心分离DNA
①速度沉降（velocity sedimentation）
?用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。
?特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。
?原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。
②等密度沉降(isopycnic sedimentation)
?用途：分离密度不等的颗粒。
?特点：
–介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。
–所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。
?原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。
2.5.2、层析分离技术
三种方法：
★凝胶过滤层析
★亲和层析
★离子交换层析
2.6分子生物学方法
2.6.1、基因工程技术
基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
2.6.2、基因作图与人类基因组计划
2.6.3、PCR技术
PCR是英文聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) 的简称，是80年代发展起来的一项具有重大意义的分子生物学技术
2.6.4、选择性基因剔除与转基因鼠
基因敲除(gene knockout)：是指一个有功能的基因通过基因工程方法完全被剔除的人工突变技术。人为的将小鼠的某一种有功能的基因完全缺失的技术就称为基因敲除技术。这项技术是Marrio Capecchi于八十年代末在Utah大学发展起来的。实验的动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠(knockout mice)。
2.6.5、乳腺生物反应器技术
乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物。
复习与思考题
1. 与光镜相比，用于电子显微镜的组织固定有什么特殊的要求?
2. 什么是细胞系和细胞株?
3. 动物体细胞克隆有什么意义?
细胞生物学教案 （来自https://www.doczj.com/doc/2917009994.html,）目录 前言 第一章绪论 第二章细胞结构概观 第三章研究方法 第四章细胞膜 第五章物质运输与信号传递 第六章基质与内膜 第七章线粒体与叶绿体 第八章核与染色体 第九章核糖体 第十章细胞骨架 第十一章细胞增殖及调控 第十二章细胞分化 第十三章细胞衰老与凋亡
前言 依照高等师范院校生物学教学计划，我们开设细胞生物学。 一、学科本身的重要性 要最终阐明生命现象，必须在细胞水平上。细胞是生命有机体最基本的结构和功能单位，生命寓于细胞之中，只有把各种生命活动同细胞结构相联系，才能在细胞水平上阐明各种生命现象。世界著名生物学家Wilson（德国人）曾说过：“一切生物学问题的答案最终要到细胞中去寻找”。 二、学科发展特点 细胞生物学涉及知识面广、内容浩繁且更新迅速。它同生物化学、遗传学形成生命科学的鼎立三足，既是当代生命科学发展的前沿，又是生命科学赖以发展的基础。 三、欲达到的目的 通过系统地学习细胞生物学，丰富细胞学知识，以适应当代人类社会知识结构发展的需求，也是为考研做准备。 本课程讲授51学时，实验21学时，共72学时。 参考资料 1 De.Robertis，《细胞生物学》，1965年（第四版）；1980年（第七版）《细胞和分子生物学》 2 Avers，“Molecular Cell Biology”， 1986年 3 Alberts，《细胞的分子生物学》，“Molecular biology of the cell”，1989年 4 Darnell，《分子细胞生物学》，1986年（第一版）；1990年（第二版）“Molecular Cell Biology”5郑国錩，细胞生物学，1980年，高教出版社；1992年，再版 6 郝水，细胞生物学教程，1983年，高教出版社 7 翟中和，细胞生物学基础，1987年，北京大学出版社 8 韩贻仁，分子细胞生物学，1988年，高等教育出版社；2000年由科学出版社再版 9 汪堃仁等，细胞生物学，1990年，北京师范大学出版社 10 翟中和，细胞生物学，1995年，高等教育出版社，2000年再版 11 郑国錩、翟中和主编《细胞生物学进展》， 12翟中和主编《细胞生物学动态》，从1997年起（1—3卷），北师大出版社 13徐承水等，《分子细胞生物学手册》1992，中国农业大学出版社 14徐承水等，《现代细胞生物学技术》1995，中国海洋大学出版社 15徐承水，《细胞超微结构研究》2000，中国国际教育出版社 学术期刊、杂志 国外：Cell、Science、Nature、J.Cell Biol.、J.Mol. Biol. 国内：中国科学、科学通报、实验生物学报、细胞生物学杂志等
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
第二章细胞生物学研究方法 第三节细胞分离技术 一、离心技术 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。 （一）、差速离心（differential centrifugation） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器（图2-22）。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 图2-22 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 （二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2-23）。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分
离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。 图2-23 ?A等速度沉降，B等密度沉降 1、速度沉降 速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降 等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质
一、独立的生命单位 细胞是包含了全部生命信息和体现所有基本特点的独立的生命单位。 细胞包含3个体系： ●遗传信息的复制、维持和表达体系 ●新陈代谢体系 ●构成维持生命结构有序性体系，如细胞骨架系统 真核细胞是如何进化来的？ 共生假说：认为真核细胞是一种复合体,它是若干原核细胞与真核细胞祖先的胞质共生 的结果 渐进式进化：认为原核细胞到真核细胞是一种渐进、直接进化的过程。 根据分子分类研究结果，却认为真核细胞、原核细胞和古细菌细胞同属于由共同祖先平行 进化而来的种类。 二、限制细胞大小的自然规律 ● Relationship Between Cells Volume(细胞体积） 一个生活细胞要维持正常的独立生活功能，最低限度需要容纳下为自身生存和繁殖 所必须的足够的DNA、蛋白质分子以及其他内部结构的空间(最低限度需要500～1000种不 同类型的酶和蛋白质)。 ● Cell Surface Area（表面积） 细胞必须有足够的表面积才能从环境中获得充足的营养和水分。 ◆细胞维持体积的相对恒定 1～10μm之间，而真核细胞的直径平均为3～30μm; ,如人的卵细胞直径只有0.1mm,而鸵鸟的卵细胞的直 径则有5cm; ,不依生物个体的大小而增大或缩小。如人、牛、马、 鼠、象的肾细胞、肝细胞的大小基本相同; ,与细胞的数量成正比,而与细胞的大小无关,把这种 现象为“细胞体积的守恒定律”。 细胞化学成分 水:85% 无机盐:1.5% 蛋白质:10% 脂质:2% 糖类:0.4% DNA: 0.4% RNA : 0.7% 三、原核细胞 主要特点 1.遗传物质仅一个环状DNA 2.无核膜，有细胞壁 3.无细胞器, 无细胞骨架 4.以无丝分裂或出芽繁殖 代表生物：支原体、细菌、蓝藻 四、真核细胞 三大结构体系 生物膜系统质膜、内膜系统（细胞器） 遗传信息表达系统染色质(体)、核糖体、mRNA、tRNA等等 细胞骨架系统胞质骨架、核骨架
第八章细胞核 粗面内质网（rER）相连； 核纤层），决定细 胞核形态； : 内、外膜相互融合形成的环状开口，嵌有核孔复合体 2．核孔复合物 （1）结构 环：胞质环、核质环（核篮）； 辐：柱状亚单位、腔内亚单位、环带亚单位； 中央栓 （2）功能------双向选择性亲水通道 被动运输：孔径10nm，≤60kDa 主动运输：孔径20nm >亲核蛋白的核输入信号：核定位信号(NLS) ；10个氨基酸的短肽，指导亲核蛋白完成核输入后并不切除 （NLS 、NES、信号肽和信号斑) （importinα/β、nucleoporin、Ran—GTP/GDP） >亲核蛋白的入核转运：①亲核蛋白通过NLS识别importin α，与可溶性NLS 受体importinα/β异二聚体结合，形成转运复合物； ②在importinβ的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合； ③转运复合物通过改变构象的核孔复合体从胞质面被转移到核质面； ④转运复合物在核质面与Ran-GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放；
⑤受体的亚基与结合的Ran并与importinβ解离，Ran-GDP返回核内再转换成Ran-GTP状态。 >mRNA 、tRNA和核糖体亚基的核输出：核输出信号nuclear export signal （NES）>请说明Ran在亲核蛋白的核输入过程中所起的作用。 ①在细胞质内, 受体(importin)与cargo protein的NLS结合 ②受体/亲核蛋白复合物和Ran-GDP 穿过核孔进入细胞核 ③在核质内，在GEF作用下Ran-GDP 转变为Ran-GTP，并与受体importin结合 ④构象改变导致受体释放出cargo protein ⑤受体-Ran-GTP complex 被运回细胞质, 在GAP 作用下Ran-GTP被水解为Ran-GDP, Ran与受体importin分离 3.核纤层lamina 是位于细胞核内层核膜下的纤维蛋白片层或纤维网络 （1）结构和组成：由核纤层蛋白laminA、B、C组成 （2）功能 在间期细胞中，核纤层为核膜提供一个支架； 在分裂细胞中，核纤层的可逆性解聚调节核膜的崩解和重建； 核纤层蛋白磷酸化时，核膜崩解；核纤层蛋白去磷酸化时，核膜重建； 在间期细胞中，核纤层为染色质提供核周锚锭部位，维持和稳定间期染色质高度有序的结构； 调节基因表达，调节DNA修复 二．染色质和染色体 1．组蛋白和非组蛋白 与染色质DNA结合的蛋白质负责DNA分子遗传信息的组织、复制 （1）组蛋白·构成真核生物染色体的基本结构蛋白 富含Arg和Lys的碱性蛋白质，等电点在pH10.0以上， 可以和酸性DNA紧密结合，分为H1, H2A, H2B, H3, H4五种。H2A, H2B, H3, H4为核小体组蛋白，在进化上十分保守，没有种属和组织特异性。H1的种族保守性低，有一定的种属和组织特异性。 Histone在维持染色体结构和功能的完整性上起着关键性的作用。 Histone与DNA在细胞周期的S期合成。DNA复制停止，Histone合成也立即停止。 （2）非组蛋白·主要指导与特异DNA序列结合的蛋白质 富含天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸的酸性蛋白质。 占染色体蛋白质的60—70%，在不同组织细胞中的种类和数量都不相同。在整个细胞周期中都有不同类型的非组蛋白合成。 能识别并结合在特异的DNA序列上，识别和结合靠氢键和离子键。 非组蛋白在调节真核生物基因表达，染色体高级结构的形成等方面起着重要的作用。 α螺旋-转角-α螺旋模式 锌指模式 Cys2/His2 锌指单位和Cys2/ Cys2锌指单位
细胞由于体积小，一般需在显微镜下观察，显微镜一般分为光学显微镜与电子显微镜。显微镜的放大倍数由目镜与物镜决定：放大倍数=物镜×目镜。清晰与否由分辨率（指能够分辨出相邻两质点间的最小距离，距离越小，分辨率越高）决定。一般来说，光镜分辨率为0.2微米，电镜分辨率为0.2纳米。分辨率的限制因素为：入射光波长，介质折射率，物镜镜口角。 光学显微镜结构为：光学显微系统，光源，机械支撑系统，有些还有图像采集系统。常见有三种：复式显微镜，相差显微镜以及荧光显微镜。 复式显微镜分为单筒显微镜，双筒显微镜。复式光学显微镜较为简单，照明系统为可见光，光学系统为玻璃透镜（目镜，物镜以及聚光镜），另外还有机械与支架系统。普通复式显微镜的缺点：由于光的干涉，衍射现象，光线通过样品时，两个相邻焦点的图像可能发生重叠，进而无法分辨，导致存在分辨极限。 相差显微镜是指利用光线的干涉，衍射特征，时相位差转变为振幅差，增强样品的明暗对比，从而观察无色透明样品的装置。相差显微镜的特殊构件为相差板，环状光阑。相差显微镜的特点：样品无需染色，可观察活细胞及细胞器动态。 荧光原理：荧光分子吸收入射光能量以后，电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。荧光显微镜原理：利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。荧光显微镜的优点：荧光显微镜主要用于定性，定位研究细胞内特异性蛋白质，可以观察活细胞。缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。 光学显微镜样品的制备：固定，包埋，切片，染色 固定：目的是杀死细胞，稳定细胞成分，以便进一步处理和切片是不受破坏。
第二章细胞生物学研究方法 (the research method in the cell biology) 教学目的 1、了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用； 2、认识工具和方法与学科发展的相关性。 教学内容 本章从以下5个方面介绍了细胞生物学的研究方法: 1．显微成像技术 2．细胞化学技术 3．细胞分选技术 4．细胞工程技术 5．分离技术 6．分子生物学方法 计划学时及安排 本章计划3学时。 教学重点和难点 生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,方法上的突破,对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用，这是学习本章应确立的基本思想。 1．显微成像包括直接成像和间接成像。显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。在光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具, 透射和扫描电镜的是两类主要的电子显微镜, 对其基本结构、工作原理和样品制备方法则是学习的重点。 2．细胞化学技术介绍了酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术, 其中流式细胞分选技术是细胞生物学和现代生物技术中的重要技术, 应重点掌握。 3．细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内
一、章（节、目）授课计划第页
二、课时教学内容第 技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技 术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的 方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有: 核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨率 R=λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 （2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的 比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是 100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决 定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的 d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： M=d′/d 二、显微镜的分类 现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学
第五章物质的跨膜运输 1 物质跨膜运输有哪三种途径ATP驱动泵可分哪些类型 答：物质跨膜运输有简单扩散、被动运输和主动运输三种途径。ATP驱动泵可分P型泵、V型质子泵和F型质子泵以及ABC 超家族，其中P型泵包括Na+—K+泵、Ca+泵和P 型H+泵。 各种ATP驱动泵的比较： 2.简述钠钾泵的结构特点及其转运机制。 答：Na+—K+泵位于动物细胞的质膜上，由2个α和2个β亚基组成四聚体。Na+—K+泵的转运机制总结如下：在细胞内侧α亚基与Na+相结合促进ATP水解，α亚基上的一个天冬氨酸残基磷酸化引起α亚基构象发生变化，将Na+泵出细胞，同时细胞外的K+与α亚基的另一位点结合，使其失去磷酸化，α亚基的构象再次发生变化，将K+泵入细胞，完
成整个循环。 3、简述葡萄糖载体蛋白的结构特点及其转运机制。 答：葡萄糖载体蛋白，简称为GLUT，是一个蛋白质家族，包括十多种葡糖糖转运蛋白，他们具有高度同源的氨基酸序列，都含有12次跨膜的α螺旋。GLUT中多肽跨膜部分主要由疏水性氨基酸残基组成，但有些α螺旋带有Ser、Thr、Asp和Glu残基，他们的侧链可以同葡萄糖羟基形成氢键。葡萄糖载体蛋白的转运机制为：氨基酸残基为形成载体蛋白内部朝内和朝外的葡萄糖结合位点，从而通过构象改变完成葡萄糖的协助扩散。转运方向取决于葡萄糖的浓度梯度，从高浓度向低浓度顺梯度转运。 4、举例说明协同运输的机制。 答：协同运输是一类靠间接提供能量完成的主动运输方式。物质跨膜运动所需要的能量来自膜两侧离子的电化学浓度梯度，而维持这种电化学势的是钠钾泵或质子泵。根据物质运输方向与离子沿浓度梯度的转移方向，协同运输又可分为：同向协同与反向协同。 ①同向协同指物质运输方向与离子转移方向相同。如人体及动物体小肠细胞对葡萄糖的吸收就是伴随着Na+的进入，细胞内的Na+离子又被钠钾泵泵出细胞外，细胞内始终保持较低的钠离子浓度，形成电化学梯度。 ②反向协同物质跨膜运动的方向与离子转移的方向相反，如动物细胞常通过Na+/H+反向协同运输的方式来转运H+以调节细胞内的PH值，即Na+的进入胞内伴随者H+的排出。选做：5、举例说明受体介导的内吞作用。 答：受体介导内吞作用大致分为四个基本过程∶①配体与膜受体结合形成一个小窝；②小窝逐渐向内凹陷，然后同质膜脱离形成一个被膜小泡；③被膜小泡的外被很快解聚，形成无被小泡，即初级内体；④初级内体与溶酶体融合，吞噬的物质被溶酶体的酶水解。具有两个特点，即：①配体与受体的结合是特异的，具有选择性；②要形成特殊包被的内吞泡。 例如LDL受体蛋白是一个单链的糖蛋白，为单次跨膜蛋白。LDL受体蛋白合成后被运输到细胞质膜，即使没有相应配体的存在， LDL受体蛋白也会在细胞质膜集中浓缩并形成被膜小窝，当血液中有LDL颗粒，可立即与LDL的apoB-100结合形成LDL-受体复合物。一旦LDL与受体结合，就会形成被膜小泡被细胞吞入，接着是网格蛋白解聚，受体回到质膜再利用，而LDL被传送给溶酶体，在溶酶体中蛋白质被降解，胆固醇被释放出来用于质膜的装配，或进入其他代谢途径。 名词：
第二章细胞生物学研究方法 姓名：李淼学号：09352044 班级：生科一班日期：10.12 我们知道，细胞层面的概念与发现离不开技术的支持，本章则为我们列举了几类基本的细胞生物学研究方法，它们是显微成像技术、细胞化学技术、细胞分选技术、细胞工程技术、分离技术以及分子生物学方法等。 显微镜的镜像形成需要3个基本因素：照明系统、被观察的样品、聚焦和成像的透镜系统。显微镜主要分为光学显微镜和电子显微镜，但两者的成像原理是相同的。光和电子都有波的行为，当光和电子穿过透镜到达焦距点时，由于波的干涉性质而成像。实际上通过透镜观察到的样品的镜像是衍射的结果。显微镜具有以下性质：分辨率（最重要）、最大分辨率、分辨极限与放大率。 我们需要了解常用的显微镜及其样品制备方法。光学显微镜包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜和倒置显微镜。相差显微镜使相位差变成振幅差，有利于我们管擦无色、透明、活细胞中的结构。暗视野显微镜使被检物体在黑暗的视野中呈现明亮的像，用以观察未经染色的活体或胶体粒子。 光学显微镜的样品粗略可以分为两类：整体和切片。对于切片要经过以下步骤处理才可以在光镜下看清楚：固定（具有缓冲作用的醛类固定液）、包埋（液体石蜡或树脂）和切片、染色、放射自显影。放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，在显影液中成为可见的“像”，从而定位定量检测生物大分子。 电子显微镜的电子束波长比可见光短100000倍，所以大大提高了显微镜的分辨率。将在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构或超微结构。主要的电子显微镜包括透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、扫描透射电子显微镜（STEM）、高压电子显微镜（HVEM）。投射电子显微镜是让电子穿透样品，而扫描电子显微镜是让电子束在样品表面扫描。扫描透射电子显微镜比较复杂，具有两者的功能，但技术要求高，需要非常高的真空度。高压电子显微镜的电压特别高，会大大减少造成染色体畸变的可能，细胞切片可以较厚。 电子显微镜的样品制备也需要固定、包埋、切片、染色等步骤，差别之一在于样品要更薄，需要使用超薄切片机。另一个差别在于样品不是放在玻片上而是载网上。还有几项技术用于电子显微镜的样品制备，包括负染色、喷镀技术、冷冻断裂复型和冷冻蚀刻。负染色由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮。 细胞化学技术包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术和其他细胞化学技术。酶细胞化学技术是在酶的作用下产生反应产物，经捕捉反应来间接证明酶定位的反应，具有特异性。免疫细胞化学技术是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。免疫细胞化学技术就是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。 细胞分选技术主要借助流式细胞仪实现细胞和染色体的分选。，包括测量细胞的大小、形状、细胞DNA、RNA含量和细胞总蛋白。细胞分选中所用的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白结合的抗体。染色体分选中使用的探针是同目标染色体互补的寡聚核苷酸，能够形成稳定的杂交体。 细胞工程技术包括细胞培养、细胞融合、单克隆抗体技术、细胞核移植克隆技术等。细胞培养要注意动植物的区别。动物细胞经过体外培养由原代细胞形成细胞系，最终形成具有特殊性质的细胞株。植物组织是利用细胞全能型去分化形成愈伤组织然后再分化形成新的植
第三章 细胞生物学研究方法 第一节细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sinα/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1．FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2．不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜 的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微 小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一）电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大有效放大倍 数 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二）主要电镜制样技术介绍
第二章细胞生物学研究方法 一、名词解释 1、resolution：分辨力是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小距离的能力。能够区分的两点间的距离越小，表示分辨力越高。 2、显微结构：通过光学显微镜所观察到的样品的各种结构，如细胞的大小、外部形态以及细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体等内部构成都属于显微结构。 3、超微结构：也称亚显微结构。指在电子显微镜下所观察到的细胞结构，如细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体、核糖体、微管、微丝等细胞器的微细结构。 4、细胞培养：指活细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞、模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养皿中继续生存、生长和繁殖的方法。 5、原代培养：指从机体组织中取材后接种到培养基中所进行的细胞培养，即直接取材于机体的细胞培养。所形成的细胞称原代细胞，它是在体外培养任何一种体细胞所必须经历的阶段和传代培养的基础。 6、传代培养：指当原代培养的细胞在培养瓶中生长、增殖到一定密度后，一分为二或以其他比例分装或转移到2个以上的培养瓶中所进行的再培养。 7、细胞融合：又称为细胞杂交，指细胞彼此接触时，2个或2个以上的细胞合并成为一个细胞的现象。 8、cell line ：原代培养首次传代成功后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力，能持续生存的细胞系，则称为连续细胞系或无限细胞系。 二、选择题 【A1型题】 1、A； 2、B； 3、B； 4、A； 5、C； 6、D； 7、A； 8、D； 9、C；10、D；11、C；12、A；13、A；14、B； 15、C；16、A；17、E；18、A；19、C；20、D；21、C；22、E；23、A；24、D；25、B；26、E 【A2型题】 1、E； 2、D； 3、C； 4、D； 5、A； 6、B； 7、C； 8、D； 9、D；10、A 【X型题】 1、ACE； 2、CDE； 3、AE； 4、CE； 5、ABCD； 6、ABC； 7、ABCED； 8、ACD； 9、ABCD 三、填空题 1、普通显微镜相差显微镜暗视野显微镜荧光显微镜 2、照明系统光学放大系统机械装置系统 3、电子照明系统电磁透镜成像系统真空系统记录系统电源系统 4、物镜和照明系统的位置颠倒 5、扫描电子显微镜透射电子显微镜 6、0.1μm 0.1mm 3nm 7、差速离心法密度梯度离心法 8、0.2μm R=0.61λ／N.A. N.A.=n·sinα／2 9、细胞化学法荧光细胞化学和免疫荧光镜检术放射自显影技术细胞显微分光光度测定技术流式细胞计量术细胞组分的分级分离法 10、冰冻蚀刻 11、原代培养传代培养 12、单层生长形态变成多态性具有接触抑制现象 13、体外环境不能与体内的条件完全等同 四、判断题 1、√； 2、×； 3、√； 4、×； 5、√； 6、×； 7、√； 8、√； 9、√；10、×；11、√；12、×；13、×；14、×
细胞生物学目录 第一章绪论 第二章细胞生物的研究方法和技术 第三章质膜的跨膜运输 第四章细胞与环境的相互作用 第五章细胞通讯 第六章核糖体和核酶 第七章线粒体和过氧化物酶体 第八章叶绿体和光合作用 第九章内质网，蛋白质分选，膜运输 第十章细胞骨架，细胞运动 第十一章细胞核和染色体 第十二章细胞周期和细胞分裂 第十三章胚胎发育和细胞分化 第十四章细胞衰老和死亡
第一章绪论 1.原生质体：被质膜包裹在细胞内的所有的生活物质，包括细胞核和细胞质 细胞质：细胞内除核以外的原生质，即细胞中细胞核以外和细胞膜以内的原生质部分 原生质体：除去细胞壁的细胞 2.结构域：生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域 3.装配模型：模板组装，酶效应组装，自组装 4.五级装配： 第一级,小分子有机物的形成 第二级，小分子有机物组装成生物大分子 第三级,由生物大分子进一步组装成细胞的高级结构 第四级,由生物大分子组装成具有空间结构和生物功能的细胞器 第五级，由各种细胞器组装成完整细胞 6.支原体：目前已知的最小的细胞 第二章细胞生物的研究方法和技术 1.显微镜技术：光镜标本制备技术、 2.光镜标本制备技术步骤：样品固定、包埋与切片、染色 3.电子显微镜种类：透射电子显微镜，扫描电镜，金属投影，冷冻断裂和冷冻石刻电镜，复染技术，扫描隧道显微镜 4.细胞化学技术：酶细胞化学技术，免疫细胞化学技术，放射自显影 5.细胞分选技术：流式细胞术 6.分离技术：离心技术，层析技术，电泳技术 第三章质膜的跨膜运输 1.细胞功能：外界与通透性障碍，组织和功能定位，运输作用，细胞间通讯，信号检测 2.膜化学组成：膜脂，膜糖，膜蛋白 3.膜脂的三个种类：磷脂，糖脂，胆固醇 4.脂质体用途：用作生物膜的研究模型，作为生物大分子与药物的运载体 5.膜糖功能：细胞与环境的相互作用，接触抑制，信号转导，蛋白质分选，保护作用。 6.膜蛋白类型：整合蛋白，外周蛋白，脂锚定蛋白 7.膜蛋白功能：运输蛋白，酶，连接蛋白，受体（信号接受和传递） 8.不对称性的研究方法：冰冻断裂复型，冰冻蚀刻 9.膜流动性研究方法：质膜融合，淋巴细胞的成斑成帽效应，荧光漂白恢复技术 10.膜流动性的重要性：酶活性，信号转导，物质运输，能量转换，细胞周期 11.影响膜脂流动性的因素：脂肪酸链，胆固醇，卵磷脂/鞘磷脂比值 12.影响膜蛋白流动的因素：整合蛋白，膜骨架，细胞外基因，相邻细胞，细胞外配体、抗体、药物大分子 13.膜骨架的主要蛋白：血影蛋白，肌动蛋白和原肌球蛋白，带4.1蛋白，锚定蛋白 14.转运蛋白质包括：载体蛋白，通道蛋白 15.协同运输的方向：同向协同，反向协同
一、章（节、目）授课计划第页 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
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二、课时教学内容第页 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大 的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern 杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： GAGGAGAGGAFFFFAFAF
一、显 微成像技术 （一）普通光学显微镜 ?1.构成： ?①照明系统 ?②光学放大系统 ?③机械装置 ?2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 ?3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 ?光学显微镜的分辨力R=0.61λ/N．A． ?其中λ为入射光线波长； ?N．A．为镜口率＝ｎs i nα/2； ?n=介质折射率； ?α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 2、常用的光学显微镜 ?（1）普通双筒显微镜有较强的立体感。 ?（2）荧光显微镜：研究细胞内物质的吸收、运输、 及化学物质的分布及定位以紫外为光源。 ?（3）相差显微镜，观察无色、透明、活细胞中的 结构（未经染色的活细胞）产生明暗差异 ?（4）暗视野显微镜：观察未经染色的活体或胶体 粒子适合观察细胞核、线粒体、细菌、霉菌等。 ?（5）倒置显微镜培养细胞观察03年选择题 倒置显微镜i n v e r s e m i c r o s c o p e ?物镜与照明系统颠倒； ?用于观察培养的活细 胞，通常具有相差或 D I C物镜，有的还具有 荧光装置。 ?学习重点： ?1.光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括 普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微 镜、倒置显微镜。掌握电子显微镜的原理和样品制备方 法，以及和光学显微镜的差别． ?２.掌握酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技 术的原理 ?３.了解细胞培养和细胞融合、细胞生物反应器、染色体转 移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养 ?4.离心分离技术 ?这一章每年都有真题出现，大部分以填空，选择和判断的 题型出现，总体看来，题目难度在下降，但是实际应用的能力 越来越看重，07、08年就近30分的考题第二章：细胞生物学研究方法
第二章细胞的统一性和多样性 1、如何理解“细胞是生命活动的基本单位”这一概念？ 1）一切有机体都有细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位 2）细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位 3）细胞是有机体生长与发育的基础 4）细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性 5）没有细胞就没有完整的生命 6）细胞是多层次非线性的复杂结构体系 7）细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体 8）细胞是高度有序的，具有自装配与自组织能力的体系 2、为什么说支原体可能是最小最简单的细胞存在形式？ 1）支原体能在培养基上生长 2）具有典型的细胞膜 3）一个环状双螺旋DNA是遗传信息量的载体 4）mRNA与核糖体结合为多聚核糖体，指导合成蛋白质 5）以一分为二的方式分裂繁殖 6）体积仅有细菌的十分之一，能寄生在细胞内繁殖 3、怎样理解“病毒是非细胞邢台的生命体”？试比较病毒与细胞的区别并讨论其相互的关 系。 病毒是由一个核酸分子（DNA或RNA）芯和蛋白质外壳构成的，是非细胞形态的生命体，是最小、最简单的有机体。仅由一个有感染性的RNA构成的病毒，称为类病毒；仅由感染性的蛋白质构成的病毒称为朊病毒。病毒具备了复制与遗传生命活动的最基本的特征，但不具备细胞的形态结构，是不完全的生命体；病毒的主要生命活动必须在细胞内才能表现，在宿主细胞内复制增殖；病毒自身没有独立的代谢与能量转化系统，必须利用宿主细胞结构、原料、能量与酶系统进行增殖，是彻底的寄生物。因此病毒不是细胞，只是具有部分生命特征的感染物。 病毒与细胞的区别： （1）病毒很小，结构极其简单； （2）遗传载体的多样性 （3）彻底的寄生性 （4）病毒以复制和装配的方式增殖 4、试从进化的角度比较原核细胞。古核细胞及真核细胞的异同。
第八章细胞核 核质比：用于表示细胞核的相对大小，即细胞核与细胞质的体积比。 核膜：又称核被膜，是细胞核与细胞质之间的界膜，主要化学成分是蛋白质和脂类，将细胞分为核与质两大结构与功能区域：DNA复制、RNA转录与加工在核内，蛋白质翻译在胞质。细胞核：细胞核是遗传信息储存、复制和传递以及核糖体大小亚基组装的场所，在维持细胞遗传信息稳定性及细胞增殖、生长、分化、衰老和死亡等生命活动中起指挥控制中心的作用。外核膜：核膜中面向胞质的一层膜，与糙面内质网相连接。外表面有核糖体附着，可进行蛋白质的合成。外核膜与细胞质相邻的表面可见中间纤维、微管形成的细胞骨架网络，这些结构的存在起固定细胞核并维持细胞核形态的作用。 内核膜：与外核膜平行排列，表面光滑，无核糖体附着，核质面附着一层结构致密的纤维蛋白网络，称为核纤层，对核膜起支持作用。 核纤层：是位于内核膜内侧与染色质之间的一层由高电子密度纤维蛋白质组成的网络片层结构。在细胞分裂中对核膜的破裂和重建起调节作用。 核周隙：内、外层核膜在核孔的位置互相融合，两层核膜之间的腔隙即核周隙，与糙面内质网相通，内含有多种蛋白质和酶类。 核孔：在内外核膜的融合之处形成的环状开口。 核孔复合体：是镶嵌在内外核膜上的篮状复合体结构，包括胞质环，核质环，辐和中央栓四个部分，是核质交换的双向选择性亲水通道，是一种特殊的跨膜运输的蛋白质复合体，具有双功能和双向性，双功能表现在两种运输方式：被动扩散与主动运输，双向性表现在既介导亲核蛋白的核输入，又介导RNA、核糖体亚基等的核输出。 胞质环：位于核孔复合体结构边缘胞质面一侧的环状结构，与柱状亚单位相连，环上对称分布8条短纤维，并伸向细胞质。 核质环：位于核孔复合体结构边缘核质面一侧的孔环状结构，与柱状亚单位相连，在环上也对称分布8条纤维伸向核内。 核篮：核质环上纤维末端形成一个由8个颗粒组成的直径约60nm的小环，构成捕鱼笼似的结构称核篮。 辐：是由核孔边缘伸向中心的结构，呈辐射状八重对称分布，把胞质环、核质环和中央栓连在一起。辐可分为三个结构域，柱状亚单位、腔内亚单位和环状亚单位。
细胞生物学》习题及解答 第一章绪论 本章要点：本章重点阐述细胞生物学的形成、发展及目前的现状和前景展望。要求重点掌握细胞生物学研究的主要内容和当前的研究热点或重点研究领域，重点掌握细胞生物学形成与发展过程中的主要重大事件及代表人物，了解细胞生物学发展过程的不同阶段及其特点。 二、填空题 1、细胞生物学是研究细胞基本规律的科学，是在、和三个不同层次上，以研究细胞的、、、和等为主要内容的一门科学。1、生命活动，显微水平，亚显微水平，分子水平，细胞结构与功能，细胞增殖、分化、衰老与凋亡，细胞信号传递，真核细胞基因表达与调控，细胞起源与进化。 2、年英国学者第一次观察到细胞并命名为cell ；后来第一次真正观察到活细胞有机体的科学家是。2、1665，Robert Hooke ，Leeuwen Hoek。 3、1838—1839 年，和共同提出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的。 3、Schleiden、Schwann 基本单位。 4、19 世纪自然科学的三大发现是、和。4、细胞学说，能量转化与守恒定律，达尔文的进化论。 5、1858年德国病理学家魏尔肖提出的观点，通常被认为是对细胞学说的一个重要补充。 5、细胞来自细胞。 6、人们通常将1838—1839年和确立的；1859年确立的；1866年确立的，称为现代生物学的三大基石。 6、Schleiden、Schwann细胞学说，达尔文，进化论，孟德尔，遗传学 7、细胞生物学的发展历史大致可分为、、、和分子细胞生物学几个时期。7、细胞的
发现，细胞学说的建立，细胞学经典时期，实验细胞学时期。 三、选择题 1、第一个观察到活细胞有机体的是（）。 a、Robert Hooke b、Leeuwen Hoek c、Grew d、Virchow 2、细胞学说是由（）提出来的。 a、Robert Hooke 和Leeuwen Hoek b、Crick 和Wats on 3、细胞学的经典时期是指（）。 a、1665年以后的25年 b、1838—1858细胞学说的建立 c、19世纪的最后25年 d、20世纪50年代电子显微镜的发明 4、（）技术为细胞生物学学科早期的形成奠定了良好的基础。 a、组织培养 b、高速离心 c、光学显微镜 d、电子显微镜 四、判断题 1、细胞生物学是研究细胞基本结构的科学。（x） 2、细胞的亚显微结构是指在光学显微镜下观察到的结构。（x） 3、细胞是生命体的结构和生命活动的基本单位。（y ） 4、英国学者Robert Hooke第一次观察到活细胞有机体。（x） 5、细胞学说、进化论、遗传学的基本定律被列为19 世纪自然科学的“三大发现” （x ）