动物药有效成分的提取
一、溶剂提取法
原理：根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到中药原料（需适当粉碎）中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。
二、结晶法
结晶的意义:鉴定中草药化学成分，研究其化学结构，必须首先将中药成分制备成单体纯品。一般来说，中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。一旦获得结晶，就能有效地进一步精制成为单体纯品。纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征，有利于鉴定 .
方法：放置过程中，最好先塞紧瓶塞，避免液面先出现结晶，而致结晶纯度较低。
2放置一段时间后没有结晶析出，可以加入极微量的种晶，即同种化合物结晶的微小颗粒。加种晶是诱导晶核形成常用而有效的手段。3没有种晶时，可用玻璃棒蘸过饱和溶液一滴，在空气中任溶剂挥散，
再用以磨擦容器内壁溶液边缘处，以诱导结晶的形成。
4如仍无结晶析出，可打开瓶塞任溶液逐步挥散，慢慢析晶。
5或另选适当溶剂处理，或再精制一次，尽可能除尽杂质后进行结晶操作。
三、层析法
层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析），和离子交换，分子的大小（排阻层析）而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为气相层析，流动相为液体的称为液相层析。
四、超临界CO2流体萃取技术
利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的.超临界CO2流体萃取过程是由萃取和分离过程组合而成的。超临界流体萃取是70年代末发展起来的一种新型物质分离、精制技术。维生素，主要是维生素E的萃取
天然产物化学习题 第一章绪论 （一）选择题[1-7] 1．有效成分是指 C A. 含量高的成分 B. 需要提纯的成分 C. 具有生物活性的成分 D. 一种单体化合物 E. 无副作用的成分 （三）填空题[1-3] 1. 天然药物化学研究的内容有：天然药物中各类型化学成分的结构特征、理化性质、及提取分离方法和结构测定，生物合成途径等。 3. 天然药物中含有的一些化学成分如生物碱、挥发油、强心苷、香豆素、黄酮等，具有一定生物活性，称为有效成分，是防病治病的物质基础。 第二章天然药物化学成分提取、分离和鉴定的方法与技术（一）选择题[1-210] A 型题[1-90] 4．下列溶剂与水不能完全混溶的是B A. 甲醇 B. 正丁醇 C. 丙醇 D. 丙酮 E. 乙醇5．溶剂极性由小到大的是 A A. 石油醚、乙醚、醋酸乙酯 B. 石油醚、丙酮、醋酸乙醋 C. 石油醚、醋酸乙酯、氯仿 D. 氯仿、醋酸乙酯、乙醚 E. 乙醚、醋酸乙酯、氯仿 6．比水重的亲脂性有机溶剂是B A. 石油醚 B. 氯仿 C. 苯 D. 乙醚 E. 乙酸乙酯
7．下列溶剂亲脂性最强的是 C A. Et2 O B. CHCl3 C. C6 H6 D. EtOAc E. EtOH 8．下列溶剂中极性最强的是 D A. Et2 O B. EtOAc C. CHCl3 D. EtOH E. BuOH 9．下列溶剂中溶解化学成分范围最广的溶剂是 B A. 水 B. 乙醇 C. 乙醚 D. 苯 E. 氯仿 10．下述哪项，全部为亲水性溶剂 A A. MeOH、Me2 CO、EtOH B. n-BuOH、Et2 O、EtOH C. n-BuOH、MeOH、Me2 CO、EtOH D. EtOAc、EtOH、Et2 O E. CHCl3 、Et2 O、EtOAc 12．从药材中依次提取不同极性的成分，应采取的溶剂顺序是 D A. 乙醇、醋酸乙酯、乙醚、水 B. 乙醇、醋酸乙酯、乙醚、石油醚 C. 乙醇、石油醚、乙醚、醋酸乙酯 D. 石油醚、乙醚、醋酸乙酯、乙醇 E. 石油醚、醋酸乙酯、乙醚、乙醇 17．提取挥发油时宜用 C A. 煎煮法 B. 分馏法 C. 水蒸气蒸馏法 D. 盐析法 E. 冷冻法 18．用水提取含挥发性成分的药材时，宜采用的方法是 C A. 回流提取法 B. 煎煮法 C.
实验七动物组织中核酸的提取和鉴定 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。 此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。 H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O H3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O5 2、嘌呤碱：能与苦 味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸 (盐酸与硫酸)共热生成 糠醛，后者可与3;5二羟 甲基苯缩合成绿色化合 物。 (2)脱氧核糖：在强 酸中加热，可生成ω—羟 基γ—酮基戊醛，后者再 与二苯胺作用生成一蓝 色化合物。 上述二反应如下 【操作】
(一)核酸提取 l、用酚提取法： （1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。 （2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。 （3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。 （4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。 2、用三氯醋酸提取法 （1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。 （2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 （3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心， （4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。 (二)核酸的水解： 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。 (三)鉴定： l、嘌呤碱的鉴定： 取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。 2、脱氧核糖的鉴定：
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 天然药物有效成分的提取方法 天然药物有效成分的提取方法介绍天然药物化学成分的提取方法，主要介绍溶剂提取法。 重点：溶剂提取法的原理，化学成分的极性、常用溶剂、极性大小顺序及提取溶剂的选择；常见的提取方法及应用范围。 常用三种方法，溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法。 另外新方法还有超临界提取法。 提取的概念：指用选择的溶剂或适当的方法，将所要的成分溶解出来并同天然药物组织脱离的过程。 一溶剂提取法（一）提取原理：根据天然药物化学成分与溶剂间“极性相似相溶”的原理，依据各类成分溶解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据“浓度差”原理，将所提成分从药材中溶解出来的方法。 （二）化学成分的极性：被提取成分的极性是选择提取溶剂最重要的依据。 1 影响化合物极性的因素： (1) 化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。 (2) 取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。 常见基团极性大小顺序如下；酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷。 1/ 8
天然药物化学成分不但数量繁多，而且结构千差万别。 所以极性问题很复杂。 但依据以上两点，一般可以判定。 需要大家判断的大多数是母核相同或相近的化合物，此时主要依据取代基极性大小。 2 常见天然药物化学成分类型的极性：极性较大的：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、亲水性色素。 极性小的：游离生物碱、苷元、挥发油、树脂、脂肪、大分子有机酸、亲脂性色素。 以上不是绝对的，具体成分要具体分析。 比如，有的苷类化合物极性很小，有的苷元极性很大。 （三）提取溶剂及溶剂的选择： 1. 常用提取溶剂的分类与极性：1）分类：通常分三类：水类；亲水性有机溶剂；亲脂性有机溶剂。 2）极性大小：水(H2O)＞甲醇(MeOH)＞乙醇(EtOH)＞丙酮（Me2CO）＞正丁醇(n-BuOH)＞乙酸乙酯(EtOAc)＞乙醚(Et2O)＞氯仿(CHCl3 ) ＞苯（C6H6)＞四氯化碳(CCl4)＞正己烷≈ 石油醚(Pet.et)。 水类还包括酸水、碱水；亲水性有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮；亲脂性有机溶剂为正丁醇后所有的。 这三类溶剂间互溶情况：水和亲水性有机溶剂可互溶，水和亲脂性有机溶剂间不互溶，有机溶剂间除甲醇和石油醚不互溶外，其它均互溶。 3）溶剂极性大小的实质：介电常数不同，介电常数大的溶剂极性
1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。 2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。 3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。 1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。 2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。 3、10,000×g 离心15分钟。 4、收集上清，进行下一步的实验。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 ①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer 中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。④4℃摇床，温和振摇15分钟。⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。 细胞提取步骤 1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。 2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。 3. 4℃摇床，温和振摇30min。 4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物 5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
第一节实验动物的抓取固定方法 一、小鼠抓取固定方法 小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤（见图2-1之一），将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（图2-1之二）。有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指和食指、中指捏住其耳后颈背部皮肤亦可。这种在手中固定方式，能进行实验动物的灌胃、皮下、肌肉和腹腔注射以及其他实验操作。如进行解剖、手术、心脏采血和尾静脉注射时，则需将小鼠作一定形式的固定，解剖手术和心脏采血等均可使动物先取背卧位（必要时先行麻醉），再用大头针将鼠前后肢依次固定在腊板上。尾静脉注射时，可用小鼠尾静脉注射架固定（图2-2），先根据动物大小选择好合适的固定架，并打开鼠筒盖，手提鼠尾巴，让动物头对准鼠筒口并送入筒内，调节鼠筒长短合适后，露出尾巴，固定筒盖即可进行尾静脉注射或尾静脉采血等操作。 图2-1 小鼠的抓取固定方法 图2-2 小鼠尾静脉注射方法 二、大鼠的抓取固定方法 大鼠的抓取方法基本同小鼠，只不过大鼠比小鼠牙尖性猛，不易用袭击方式抓取，否则会被咬伤手指。抓取时为避免咬伤，可带上帆布手套。如果进行腹腔、肌肉皮下等注射和灌胃时，同样可采用左手固定法，只是用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手即可进行各种实验操作。也可伸开左手之虎口，敏捷地从后一把抓住。若做手术或解剖等，则需事先麻醉或处死，然后用细棉线绳活结缚腿，背卧位绑在大鼠固定
板上；尾静脉注射时的固定同小鼠（只需将固定架改为大鼠固定盒）。 三、蛙类的抓取固定方法 蛙类抓取方法宜用左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左、右前肢、右手进行操作（见图2-3）。 图2-3 蛙、蟾蜍抓取固定方法 在抓取蟾蜍时，注意勿挤压其两则耳部突起之毒腺，以免毒液射进眼中。 实验如需长时间观察，可破坏其脑脊髓（观察神经系统反应时不应破坏脑脊髓）或麻醉后用大头针固定在蛙板上。依实验需要采取俯卧位或仰卧位固定。 四、兔的抓取固定方法 （一）抓取实验家兔多数饲养在笼内，所以抓取较为方便。一般以右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托其臀部或腹部，让其体重重量的大部分集中在左手上（图2-4），这样就避免了抓取过程中的动物损伤。不能采用抓双耳或抓提背部。 （二）固定一般将家兔的固定分为盒式、台式和马蹄形三种。盒式固定，适用于兔耳采血、耳血管注射等情况；若做血压测量、呼吸等实验和手术时，则需将兔固定在兔台上，四肢用粗棉绳活结绑住，拉直四肢，将绳绑在兔台四周的固定木块上，头以固定夹固定或用一根粗棉绳挑过兔门齿绑在兔台铁柱上；马蹄形固定多用于腰背部，尤其是颅脑部位的实验，固定时先剪去两侧眼眶下部的毛皮，暴露颧骨突起，调节固定器两端钉形金属棒。使其正好嵌在突起下方的凹处，然后在适当的高度固定金属榛。用马蹄形固定器可使兔取用背卧位和腹卧位，所以是研究中常采用的固定方法。 图2-4 家兔抓取方法
1*天然药物化学研究的内容有哪些？ 答：天然药物中各类化学成分的结构特点、理化性质、提取分离与鉴定方法，操作技术及实际应用。 2*如何理解有效成分和无效成分？ 答：有效成分是指天然药物中经药效实验筛选具有生物活性并能代表临床疗效的单体化合物，能用结构式表示，具有一定的物理常数。天然药物中不代表其治疗作用的成分为无效成分。一般认为天然药物中的蛋白质、多糖、淀粉、树脂、叶绿素、纤维素等成分是无效成分或杂质。 3*天然药物有效成分提取方法有几种？采用这些方法提取的依据是什么？ 答：①溶剂提取法：利用溶剂把天然药物中所需要的成分溶解出来，而对其它成分不溶解或少溶解。②水蒸气蒸馏法：利用某些化学成分具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的性质。③升华法：利用某些化合物具有升华的性。 4*常用溶剂的亲水性或亲脂性的强弱顺序如何排列？哪些与水混溶？哪些与水不混溶？ 答：石油醚>苯>氯仿>乙醚>乙酸乙酯>正丁醇（与水互不相容）>丙酮>乙醇>甲醇>水（与水相混溶） 5*两相溶剂萃取法是根据什么原理进行？在实际工作中如何选择溶剂？ 答：利用混合物中各成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的目的。实际工作中，在水提取液中有效成分是亲脂的多选用亲脂性有机溶剂如苯、氯仿、乙醚等进行液‐液萃取；若有效成分是偏于亲水性的则改用弱亲脂性溶剂如乙酸乙酯、正丁醇等，也可采用氯仿或乙醚加适量乙醇或甲醇的混合剂。 6*色谱法的基本原理是什么？ 答：利用混合物中各成分在不同的两相中吸附、分配及其亲和力的差异而达到相互分离的方法。 7*聚酰胺吸附力与哪些因素有关？ 答：①与溶剂有关：一般在水中吸附能力最强，有机溶剂中较弱，碱性溶剂中最弱；②与形成氢键的基团多少有关：分子结构中含酚羟基、羧基、醌或羰基越多，吸附越牢；③与形成氢键的基团位置有关：一般间位＞对位＞邻位；④芳香核、共轭双键越多，吸附越牢；⑤对形成分子内氢键的化合物吸附力减弱。 8*简述苷的分类。 答：据苷键的构型不同分为α-苷、β-苷；依据在植物体内的存在状态不同，可分为原生苷和次生苷；依据苷的结构中单糖数目的不同，可分为单糖苷、双糖苷、三糖苷；依据苷元结构不同，可分为黄酮苷、蒽醌苷、香豆素苷；依据糖链的数目不同，分为单糖链苷、双糖链苷；依据苷的生物活性，分为强心苷、皂苷等。 9*简述苷键酸水解的影响因素。 答：①苷原子不同，水解难以顺序：N-苷>O苷>S苷>C苷②呋喃糖苷较吡喃糖易水解③酮糖苷较醛糖苷易水解④吡喃糖苷中C5取代基越大越难水解。⑤吸点子基的诱导效应，尤其是C2上取代基的吸点子基对质子的竞争吸引，使苷键原子的电子云密度降低，质子化能力下降，水解速度下降⑥芳香族苷因苷元部分有供电子基，水解比脂肪族苷容易。 10*如何用化学方法鉴别：葡萄糖、丹皮苷、丹皮酚。 答：三种样品分别做α-萘酚-浓硫酸反应，不产生紫色环的是丹皮酚。产生紫色环的，再分别做斐林反应，产生砖红色沉淀的是葡萄糖，不反应的是丹皮苷。 11*为何《中华人民共和国药典》规定新采集的大黄必须储存两年以上才可药用？
目录 1.目的 (2) 2.范围 (2) 3.引言、定义和缩略语 (2) 4.程序 (2) 4.1大鼠的捉持 (2) 4.2小鼠的捉持 (3) 4.3豚鼠的捉持 (3) 4.4兔的捉持 (3) 4.5犬的捉持 (4) 5.登记和归档 (5) 5.1登记 (5) 5.2归档 (5) 6.职责 (5) 7.培训 (5)
1. 目的 本条SOP的目的是建立并规范实验动物的捉持及固定方法，使操作程序标准化。 2. 范围 本条SOP适用于所有参加动物试验的操作人员。 3. 引言、定义和缩略语 实验动物的捉持分为：大鼠的捉持、小鼠的捉持、豚鼠的捉持、兔的捉持、犬的捉持。 4. 程序 4.1大鼠的捉持 1)包身法：操作者一只手提鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙表面上，向后 方轻拉鼠尾，使大鼠前肢固定在粗糙表面上，另一只手用拇指和另外4指从动物背部分别绕到动物的两侧腋下，将大鼠抓起（熟练者可不提鼠尾，直接将其抓住）。 2)提尾法：操作者用单手拇指和食指抓住动物尾根部提起。（图1） 图1 提尾法图2 固头法 3)固头法：操作者用单手拇指和食指抓住大鼠颈背部皮毛，使其头部固 定。（图2） 4)注意事项：不宜快速或突然抓取动物。对于有症状的大鼠，抓取时注
意避开其伤痛部位，避免增加动物痛苦。 4.2小鼠的捉持 1)双手法：操作者一只手提鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙表面上，向后 方轻拉鼠尾，使小鼠前肢固定在粗糙表面上（图4）。迅速用另一只手的拇指和食指捏其双耳间颈背部皮肤，无名指、小指及掌心夹其背部皮肤和尾部，便可将小鼠牢固捉持（图3）（图5）。 图3小鼠双手捉持法图4小鼠单手捉持法图5 小鼠单手捉持法 2)单手法：小鼠置于笼盖上，先用食指和拇指抓住鼠尾后，手掌尺侧和 小指夹住鼠尾，然后拇指与食指捏住颈部皮肤（图5） 3)提尾法：用单手拇指和食指捉持尾根部。此法适用于从小群体中或单 一个体中操作小鼠。 4)固头法：操作者一只手拇指和食指抓住动物尾部，另一只手拇指和食 指抓住动物颈背部皮毛，使动物头部被固定。 4.3豚鼠的捉持 豚鼠性情温和，不易咬人，用手轻轻握住身体即可抓起（图6）。 图6 豚鼠的捉持 4.4兔的捉持 操作者一只手抓住兔颈背部皮肤，将兔轻轻提起，另一只手托住臀部，
1. 提取蛋白裂解液配方： 25 mM HEPEs PH:7.4 5 mM EDTA 5 mM EGTA 50 mM NaCl 1 mM Na3VO3(矾酸钠) 1 mM sodium phosphophate 0.05% SDS 0.05% sodium deoxycholate (脱氧胆酸盐) 1% Triton-X 100 5 mM NaF 0.1% 2-mercaptoethanol 1 mM PMSF (1ul 100mmol/L+纯水99ul) 1uM Microcysin-LR 40ug/ml pepstatin A 40ug/ml aprotinin 40ug/ml leupeptin 2..组织蛋白提取及定量： 称量组织重量置小烧杯 用PBS清洗1-2次 加入组织裂解液【悬浮buffer储存液500ml+苯甲基磺酰氟（PMSF，有毒物）30+leapeptin （蛋白抑制酶）0.5ul于EP管混合，倒入盛组织的烧杯】 置冰上5min 用眼科剪剪碎 倒入5ml匀浆器（反复抽吸匀浆组织） 倒入或吸入EP管 离心（4°C 1000g 10min）取上清 用于蛋白定量或储存于-80°C 蛋白定量 取5ul蛋白样本+15ul去离子水（DW）+200ulBCA（A:B为50:1即196:4），分别混合样本与DW和BCA的A液与B液置于干净的96孔板上37°C，30min
酶联免疫测OD值（570nm，ELX-800型酶标仪） 由OD值计算蛋白浓度（用excel表或用下列公式计算） （OD值×987.7108－198.342）×103ng/ul；OD=样本OD值－空白对照OD值）
天然药物化学习题 第一章绪论 （一）选择题 1．有效成分是指 C A. 含量高的成分 B. 需要提纯的成分 C. 具有生物活性的成分 D. 一种单体化合物 E. 无副作用的成分 2．下列溶剂与水不能完全混溶的是B A. 甲醇 B. 正丁醇 C. 丙醇 D. 丙酮 E. 乙醇 3．溶剂极性由小到大的是A A. 石油醚、乙醚、醋酸乙酯 B. 石油醚、丙酮、醋酸乙醋 C. 石油醚、醋酸乙酯、氯仿 D. 氯仿、醋酸乙酯、乙醚 E. 乙醚、醋酸乙酯、氯仿 4．比水重的亲脂性有机溶剂是B A. 石油醚 B. 氯仿 C. 苯 D. 乙醚 E. 乙酸乙酯 5．下列溶剂中极性最强的是 A. Et2 O B. EtOAc C. CHCl3 D. EtOH E. BuOH 6．下列溶剂中溶解化学成分范围最广的溶剂是 B A. 水 B. 乙醇 C. 乙醚 D. 苯 E. 氯仿 7．从药材中依次提取不同极性的成分，应采取的溶剂顺序是D A. 乙醇、醋酸乙酯、乙醚、水 B. 乙醇、醋酸乙酯、乙醚、石油醚 C. 乙醇、石油醚、乙醚、醋酸乙酯 D. 石油醚、乙醚、醋酸乙酯、乙醇 E. 石油醚、醋酸乙酯、乙醚、乙醇 8．提取挥发油时宜用 C A. 煎煮法 B. 分馏法 C. 水蒸气蒸馏法 D. 盐析法 E. 冷冻法 9．用水提取含挥发性成分的药材时，宜采用的方法是 C A. 回流提取法 B. 煎煮法 C. 浸渍法 D. 水蒸气蒸馏后再渗漉法 E. 水蒸气蒸馏后再煎煮法10．连续回流提取法所用的仪器名称叫 D A．水蒸气蒸馏器B．薄膜蒸发器C．液滴逆流分配器D．索氏提取器E．水蒸气发生器
11．两相溶剂萃取法的原理是利用混合物中各成分在两相溶剂中的B A．比重不同B．分配系数不同C．分离系数不同D．萃取常数不同E．介电常数不同12．可将天然药物水提液中的亲水性成分萃取出来的溶剂是D A. 乙醚 B. 醋酸乙酯 C. 丙酮 D. 正丁醇 E. 乙醇 13．从天然药物的水提取液中萃取强亲脂性成分，宜选用 E A. 乙醇 B. 甲醇 C. 正丁醇 D. 醋酸乙醋 E. 苯 14．从天然药物水煎液中萃取有效成分不能使用的溶剂为 A A. Me2 CO (丙酮) B. Et2 O C. CHCl3 D. n-BuOH E. EtOAc 15．有效成分为黄酮类化合物的天然药物水提取液，欲除去其中的淀粉、多糖和蛋白质等杂质，宜用B A. 铅盐沉淀法 B. 乙醇沉淀法 C. 酸碱沉淀法 D. 离子交换树脂法 E. 盐析法 16．影响硅胶吸附能力的因素有 A A．硅胶的含水量B．洗脱剂的极性大小C．洗脱剂的酸碱性大小 D．被分离成分的极性大小E．被分离成分的酸碱性大小 17．化合物进行硅胶吸附柱色谱时的结果是 B A．极性大的先流出B．极性小的先流出C．熔点低的先流出 D．熔点高的先流出E．易挥发的先流出 18．氧化铝，硅胶为极性吸附剂，若进行吸附色谱时，其色谱结果和被分离成分的 什么有关A A．极性B．溶解度C．吸附剂活度D．熔点E．饱和度 19．下列基团极性最大的是 D A．醛基B．酮基C．酯基 D．酚羟基E．甲氧基 20．下列基团极性最小的是C A．醛基B．酮基C．酯基D．酚羟基E．醇羟基 21．具下列基团的化合物在聚酰胺薄层色谱中Rf值最大的是 C A. 四个酚羟基化合物B．二个对位酚羟基化合物 C．二个邻位酚羟基化合物 D. 二个间位酚羟基化合物E．三个酚羟基化合物 22．对聚酰胺色谱叙述不正确项 E
天然药物有效成分提取分离技术 中草药以植物药为主,而植物都就是由复杂的化学成分所组成。其中主要有纤维素、叶绿素、单糖、低聚糖与淀粉、蛋白质与酶、油脂与蜡、树脂、树胶、鞣质及无机盐等。其中,许多物质对植物机体生命活动来说不可缺少,称为一次代谢产物。一般认为它们在药用上就是无效成分或杂质。而另外一些化学成分如:生物碱、黄酮、蒽醌、香豆素、木脂素、有机酸、氨基酸、萜类、苷类等对维持植物生命活动来说不起重要作用,称为二次代谢产物,这些物质在植物体内虽含量很少,多则百之几,少则百万分之几,甚至更少。但它们往往具有较强的生理活性,其中有些已应用于临床,我们称之为有效成分。当然有效成分与无效成分的划分就是相对的,如天花粉的引产有效成分就是蛋白质,香茹中的多糖对实验动物肿瘤有显著的抑制作用。 在进行中草药成分提取前,应注意对所用材料的原植物品种的鉴定并留样备查。同时要系统查阅文献,以充分了解,利用前人的经验。 中草药有效成分的提取分离一般有下面两种情况:第一、从植物中提取已知的有效成分或已知的化学结构类型者。如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄素;三棵针中提取黄连素等(提取有效成分)。或从植物中提取某类成分如总生物碱、总酸性成分。如从银杏叶中提取总黄酮;从大黄中提取总蒽醌(提取有效部位)。工作程序比较简单。一般先查阅有关资料,特别就是工业生产的方法,搜集比较该种或该类成分的各种提取方法,再根据具体条件加以选用。(注意先重复该方法,得到产品后,再结合生产实际,不断改进工艺,达到大生产要求)。
第二、从中草药中寻找未知有效成分或有效部位时,情况比较复杂。只能根据预先确定的目标,在临床或药理试验配合下,经不同溶剂提取,以确定有效部位。然后再逐步划分,追踪有效成分最集中的部位,最后分得有效成分。 一、中草药有效成分的提取 对中草药化学成分的提取,通常就是利用适当的溶剂或适当的方法将植物中的化学成分从植物中抽提出来。常用的方法有溶剂法、水蒸汽蒸馏法与升华法等。其中后两种方法的应用范围十分有限。现分别介绍如下: (一)溶剂提取法 1、溶剂提取法的原理:溶剂提取法就是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质,选用对活性成分溶解度大,对不需要溶出的成分溶解度小的溶剂,而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。根据“相似者相溶”的经验规律,中药化学成分可通过结构去估计它们的性质,亲脂性的中药成分易溶于亲脂性溶剂,难溶于亲水性溶剂。反之,亲水性成分则易溶于亲水性溶剂。据此,可选择适当溶剂从中药中提取所需成分。常见溶剂的亲水性或亲脂性的强弱顺序表示如下: 石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇 １、水提取法 水就是一种强杉性溶剂。中草药中亲水性成分如无机盐、糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐与苷类等都能被水溶出。游离生物碱可与酸生成盐而溶于水,因而可用酸水提取。有机酸、黄
WT LOST 动物固体组织蛋白提取 Protocol 1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。 2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。置入 4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行）： a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。 b 、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块， 一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎， 也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～5 次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部分酶活力会受影响。 c 、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心 15min 。 d 、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的 EP 管中。可-80℃保存。4、蛋白浓度测定。 a 、配工作液：溶液 A ：溶液 B=50：1（200ul ：4ul ）。 需测试复孔。标本 X ，则需 A 量=2* ；B=2*（X+1+1）*4。 c 、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH 2O ，混匀。即 10 倍稀释。 d 、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后，37℃ incubat e 30min 。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换 tip ，再加入工作液即起反应，应缩短时间。 e 、酶标仪检测 562nm 吸光度。Program f 、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y ：蛋白浓度；X ：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y （ug/ul 、mg/ml ） g 、蛋白样本放-80℃冻存。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化， 这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。 Commassie 法（Bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。 BCA 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）
天然药物化学试题及答案 第一章（一） 一、名词解释 1、高速逆流色谱技术 2、超临界流体萃取技术 3、超声波提取技术 4、二次代谢过程 答案 1、它是依靠高速行星式旋转产生的离心力使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管中，并使流动相单向、低速地通过固定相，由于不同的物质在两相中具有不同的分配系数，其在柱中的移动速度也不一样，从而实现样品的一种分离方法。 2、是指在临界温度和临界压力以上，以接近临界点状态下的流体作为萃取溶剂，利用其在超临界状态下兼有液体和气体的双重性质选择性地溶解其他物质，先将某一组分溶解，然后通过控制温度和压力，使临界流体变成普通气体，被溶物会析出，从而从混合物中得以分离地技术。 3、是指以超声波辐射压强产生的骚动效应、空化效应和热效应，引起机械搅拌、加速扩散溶解的一种新型的利用外场介入的溶剂强化提取方法。 4、植物体在特定的条件下，以一些重要的一次代谢产物如乙酰辅酶A 、丙二酸单酰辅酶A、莽草酸及一些氨基酸等为原料和前体，经历不同的代谢途径，生成生物碱、萜类等化合物的过程称为二次代谢过程。 二、以下每一道考题下面有A、B、C、D、四个备选答案。请从中选择一个最佳答案。 1、D； 2、C； 3、A； 4、A； 5、B 1、纸层析属于分配层析, 固定相为：（） A. 纤维素 B. 展开剂中极性较小的溶液 C. 展开剂中极性较大的溶液 D. 水 2、硅胶色谱一般不适合于分离（） Ａ、香豆素类化合物Ｂ、生物碱类化合物
Ｃ、酸性化合物Ｄ、酯类化合物 3、比水重的亲脂性有机溶剂有： A. CHCl3 B. 苯 C. Et2 O D. 石油醚 4、利用溶剂较少提取有效成分较完全的方法是： Ａ、连续回流法Ｂ、加热回流法 Ｃ、渗漉法Ｄ、浸渍法 5、由甲戊二羟酸演变而成的化合物类型是 A. 糖类 B. 萜类 C. 黄酮类 D. 木脂素类 6、C； 7、A； 8、B； 9、C 6、调节溶液的pH改变分子的存在状态影响溶解度而实现分离的方法有 A．醇提水沉法B．铅盐沉淀法C．碱提酸沉法D．醇提丙酮沉法 7、与水不分层的有机溶剂有： A. CHCl3 B. 丙酮 C. Et2 O D. 正丁醇 8、聚酰胺层析原理是 A物理吸附B氢键吸附C分子筛效应D、化学吸附 9、葡聚糖凝胶层析法属于排阻层析，在化合物分离过程中，先被洗脱下来的为： A. 杂质 B. 小分子化合物 C. 大分子化合物 D. 两者同时下来 三、判断对错 1、× 2、√ 3、√ 4、√ 5、× 6、√ 7、√； 8、×；9×；10√； 1、某结晶物质经硅胶薄层层析，用一种展开剂展开，呈单一斑点，所以该晶体为一单体。(×) 2、糖、蛋白质、脂质、核酸等为植物机体生命活动不可缺少的物质，因此称之为一次代谢产物。（√） 3、二氧化碳超临界流体萃取方法提取挥发油，具有防止氧化、热解及提高品质的突出优点。（√） 4、色谱法是分离中药成分单体最有效的方法（√） 5、铅盐沉淀法常用于中药生产中除去杂质。（×）
全蛋白提取试剂盒 Tissue or Cell Total Protein Extraction Kit 产品编号：C510003 包装规格：50 Assays 产品简介 本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白，用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer 匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效,可以提取出培养细胞或动物组织中的决大多数蛋白质。获得的全蛋白可 用于Western Blot 、免疫共沉淀，酶活性分析，Pull down 和EMSA 等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀 的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂，可以每次从107 个培养细胞或200 mg 动物组织提取蛋白质，本试剂盒可以 使用50次。 产品特点 1. 提取的蛋白质包括膜,核,核基质和胞质蛋白,而且最大限度保持蛋白质活性 2. 整个操作过程只需要30分钟左右 3. 即可以用于培养细胞（50x107 个），有可以用于动物组织（50x200 mg ）蛋白质的提取 4. 避免蛋白酶和磷酸酶对蛋白质的降解，保持蛋白质的完整性和天然活性 5. 不需要超速度离心，可以同时处理多个样品 运输和保存条件 常温运输，收到后请将磷酸酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和PMSF 于 -20℃保存，其余2-8℃保存，保质期一年。 试剂盒组成 成分 C510003 Lysis buffer 50 mL 蛋白酶抑制剂 50 μL 磷酸酶抑制剂 250 μL PMSF 500 μL 操作步骤 A. 实体组织蛋白的提取 1. 在每1 mL 预冷的Lysis Buffer 加入5 μL 磷酸酶抑制剂,1 μL 蛋白酶抑制剂和10 μL PMSF 混匀。冰上保存数分钟待用。 2. 将100-200 mg 固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3 mm ×3 mm 左右的小块，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，用PBS 洗涤两次，离心取沉淀后加入0.5～1 mL 上述配制好的预冷的Lysis Buffer ，4℃玻璃匀浆器上下手动匀浆15-30次。或超声破碎细胞，每次30s ， 3～4次，每次间隔1 min ，置于冰上冷却。均质匀浆或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％，同时没有明显的组织小块。 3. 取组织匀浆液转移到1.5 mL 预冷的离心管，冰上放置10 min 左右, 期间取出剧烈震荡2-3次； 4. 15000 g （13000 rpm)，4℃离心10 min ，取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，进行蛋白定量和其他蛋白质相关实验。 5. 分装保存于-70℃，避免反复冻融。 s a n g o n b i o t e c h
动物组织细胞基因组DNA提取 一、实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。 二、仪器及试剂 1. 仪器： 恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌） 2. 试剂： （1）细胞裂解缓冲液： Tris (pH8.0) 100 mmol/L EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L NaCL 20 mmol/L SDS 10%
胰RNA酶20ug/ml （2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。 （3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。 （4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、 （5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。 三、操作步骤 1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行） 3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。 6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。 8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。 10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
固体组织蛋白提取 2017-07-18 固体组织蛋白提取 1. 每100mg固体组织剪碎后加入0.5 ml裂解液，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。注意：初始组织的量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。 2. 取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，加2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。室温或4℃静置10分钟，偶尔晃动。注意：(1)组织量<10mg且静置时间短30min，在下一步离心时所形成的蛋白膜易碎，此时可静置30min。(2)提取脂肪组织时应4℃静置40min以上以充分去除油脂。 3. 10,000g 4℃离心10分钟，溶液分为两相，中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。(2)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入0.5-0.8ml纯乙醇混匀，10,000g 4℃离心5分钟。弃所有液体，蛋白沉淀在管底。 4. 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。 5. 每100mg组织所得到的蛋白加 200ml用户自备的缓冲液， 95℃煮10分钟。室温放置20分钟溶解沉淀。注意：(1)可4℃过夜溶解沉淀，偶有少量不溶性组织纤维碎片可离心去除。(2)有时染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来，溶解时则形成粘稠物。延长95℃热变性时间、不时振荡、用注射针头反复抽吸，有助于彻底打断DNA。 3．样本组织RNA提取：取液氮保存的肺组织，研碎后加入RNAisoTMPlus，将研碎的样品完全覆盖，室温静置至样品完全融化，在研磨至裂解液呈透明状。移至离心管后加入l／5l埘AisoTMPlus体积量的氯仿，用力振荡后移至离心管中，室温静置 5min。12，000rpm／min 4 0C离心15min，取出离心管吸取上清夜，移入新的.离心管。向上清中加等体积的异丙醇，混匀后室温静置 10min。12，000rpm／min 4"C离心10min。弃取上清，加入75％的乙醇lml，洗涤管壁后12，000 rpm／min4。C离心5min，弃去乙醇。室温干燥沉淀5min 后加入适量RNase．free水溶解沉淀，完全溶解后置于--80℃ 保存。 4．按照试剂盒说明在微管中配制反应混合溶液，将提取的RNA),II入微管后70℃ 反应5min，离心收集。依试剂盒说明依次加入5×reaction buffer，Ribolock Ribonuclease inhibitor和10 mM Dntp mix，混匀后离心收集。置