1. 5 阿魏酸酯酶活力的测定
取250 μL 粗酶液于2 mL 离心管中, 于50 ℃保温 5 min; 然后,加入250μL 一定浓度的阿魏酸甲酯溶液,反应10 min, 再加入体积比为10%的 500 μL 的冰乙酸终止反应.样品离心后于4℃保存,用高效液相色谱( HPLC)法测定样品中的阿魏酸含量.空白样品中冰乙酸在反应前加入,其他处理同上.
1. 3 阿魏酸酯酶酶活定义及测定
阿魏酸采用高效液相色谱法测定. 取250 μL 离心后的发酵上清液加入到250 μL 阿魏酸甲酯溶液中, 50℃保温15 min, 加入500μL体积分数为10%的冰乙酸.样品于离心机( 10000r/ min) 离心15 min, 于4℃下保存. 空白样品为煮沸失活的发酵上清液, 处理方法同上.阿魏酸酯酶的酶活定义:在50℃, pH 值为 6.0 的条件下,每分钟酯解阿魏酸甲酯,生成1μmol 阿魏酸所需的酶量。
1.4 酶活性测定
酶解底物为除去蛋白质和淀粉后的麦麸、玉米麸皮和蔗渣。蛋白质和淀粉的去除按欧仕益等的方法进行，烘干，粉碎，过80目。
酶活性测定：取酶液 30mL于试管中，于40℃恒温水浴中震荡(将振荡器置于水浴中)保温 5min，加入酶解底物 1g，反应15min，沸水浴终止反应。将酶液离心，取上清液稀释到适当倍数测定空白(酶液)与酶解后的还原糖和阿魏酸含量。计算酶活时
减去酶液中原有的阿魏酸和还原糖。
阿魏酸含量的测定：植物材料中的阿魏酸含量按欧仕益等的方法进行。发酵液和酶解液中的阿魏酸含量采用以下方法测定：在待测液中加入乙醇至终浓度为 80%，摇匀、离心，采用分光光度法在320nm 下测定阿魏酸含量。
还原糖的测定：将反应液稀释到适当倍数，采用DNS法—3,5-二硝基水杨酸比色法在560nm下测定还原糖含量。
1. 3 阿魏酸及阿魏酸酯酶酶活测定
阿魏酸的测定采用HPLC法样品液3470×g离心20min后取上清液500 L，加入1. 0 mL， 50%的甲醇 4338 × g 离心 15 min 色谱条件:Agilent1100 型高效液相色谱仪， ODS- C18 柱，紫外检测器，检测波长为 318 nm;柱温为 30 ℃;流动相为甲醇∶水∶冰乙酸 = 30∶ 69. 5∶ 0. 5 (V /V) ;流速为 0. 9 mL /min;进样量为 20 μL。
阿魏酸酯酶活力测定:取 250 μL 样品，加入250μL， pH6.
0 Na2 HPO4 -柠檬酸缓冲溶液配制的阿魏酸甲酯溶液，在 50 ℃反应 10 min 后加入 500μL 10%冰乙酸( V /V)， 4 ℃， 10000 r /min 离心 20 min后测定阿魏酸含量空白对照为煮沸失活的酶液。
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
实验三. 碱性蛋白酶活力测定 【实验目的】 1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 【实验原理】 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 【实验材料】 1.实验器材 电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计 2.实验试剂 (1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水稀释。 (2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。 (3)pH10缓冲溶液： 甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 乙液：0.2mol/L氢氧化钠溶液 配制pH10硼砂氢氧化钠溶液：吸取甲液50ml，再加入乙液21ml，用蒸馏水定容至200ml。 (4)标准酪氨酸溶液：精确称取酪氨酸50mg，加入1ml 1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容至50ml，即得1mg/ml酪氨酸标准溶液。 (5)0.4mol/L碳酸钠溶液,0.4mol/L三氯醋酸溶液。 【实验操作】 1.制备酪氨酸标准曲线 (1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下页） (2) 在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1ml，于40℃水浴中保温15分钟，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3ml，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。 (3)分别吸取滤液1ml放入另7支试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，充分摇匀，于40℃水浴中保温15分钟，然后于每管中各加入3ml蒸馏水，充分摇匀。 (4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680nm处测定光密度。
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
蛋白酶活性测定方法 一蛋白酶活力单位定义 1g 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。 二测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 三应用范围 本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。 四测定条件 4.1 底物：酪蛋白 4.2 pH： 3.00 4.3 温度： 40℃±0.5℃ 4.4 保温时间： 10min 五仪器 5.1 紫外分光光度计 5.2 超级恒温水浴40±0.2℃ 5.3 秒表 5.4 分析天平：感量0.0001g 六试剂和溶液 6.1.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。 6.1.3 三氯乙酸c(CCI3·COOH)=0.4 mol/L 称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。 6.1.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按GB 601配制。 6.1.5 盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L 按GB 601配制。 6.1.6 缓冲溶液 a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。 b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸(80%～90%)10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取乳酸钠(70%)16 g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶 甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08 g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000 mL, 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。 6.1.7 l0 g/L酪素溶液 称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 注:3 )酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。 6.1.8 l00μg/mL L-酪氨酸4)标准溶液
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。 4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL 溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 分别取上述溶液各3.00ml，各加碳酸钠溶液（4.3）15.00ml、福林试剂使用溶液（4.2）3.00ml，
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910384386.3 (22)申请日 2019.05.09 (71)申请人 齐鲁工业大学 地址 250353 山东省济南市长清区大学路 3501号 (72)发明人 徐振上 王婷 张夙夙 (74)专利代理机构 济南竹森知识产权代理事务 所(普通合伙) 37270 代理人 朱家富 (51)Int.Cl. C12N 9/18(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12P 7/42(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (54)发明名称 耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的 制备方法及其应用，属于生物技术领域。所述耐 热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：步骤1：以 卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶 基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：将所述重 组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得 到阿魏酸酯酶。本发明制备的阿魏酸酯酶的最适 反应条件为65℃和pH 7.0，具有良好的耐热性和 耐碱性特点，使其在造纸、食品、制药与饲料等领 域中具有应用潜力。权利要求书2页 说明书7页序列表2页 附图3页CN 110184256 A 2019.08.30 C N 110184256 A
权 利 要 求 书1/2页CN 110184256 A 1.一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括： 步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； 步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。 2.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤包括： (1)以卷曲乳杆菌的DNA为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因片段，PCR扩增所使用的上下游引物分别为： 上游引物FaeLcr-F 5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′ 下游引物FaeLcr-R 5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′； (2)将所得阿魏酸酯酶基因片段经NdeI和XhoI双酶切，与相同酶切线性化的表达载体pET-22b(+)连接，构建得到重组表达载体pET-FaeLcr；将重组表达载体pET-FaeLcr转化至宿主菌种大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌。 3.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，卷曲乳杆菌的DNA获得方法为：取过夜活化的卷曲乳杆菌菌液1ml，6000rpm,4℃离心3min收集菌体，重悬于567μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，添加25μL 50mg/ml溶菌酶，混匀，37℃水浴处理1h；加入30μL 10％(质量百分比)SDS、3μL 20mg/ml的蛋白酶K，65℃条件下水浴1h，再加入预冷的氯仿3mL，混匀后离心收集上清；加入等体积预冷的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，颠倒混匀后离心，取上层水相加入等体积的24：1 (氯仿：异戊醇)，再次离心，取上层水相加入0.6倍体积的预冷异丙醇，室温水浴醇沉1h，离心收集沉淀；最后用70％乙醇清洗沉淀2次，吹干，取40μL TE缓冲液溶解沉淀，即得卷曲乳杆菌DNA。 4.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增条件：2×Taq Master Mix 25μL，上下游引物(10μM)各2μL，DNA模板1μL,add ddH2O至50μL； PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。 5.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酶切条件为37℃，3h，酶切体系为：NdeI 5 μL，XhoI 5μL，10×K Buffer 10μL，0.1％BSA 10μL，阿魏酸酯酶DNA/pET-22b(+)质粒DNA 5μg，无菌水补足至100μL；将经过双酶切的阿魏酸酯酶DNA片段和pET-22b(+)载体DNA按照10:1的摩尔比例混合，加入T4 DNA连接酶，16℃过夜连接；将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上孵育30min，42℃水浴热激60s，后加入900μL LB液体培养基37℃孵育1h；150rpm将菌液离心去掉上清液800μL，用剩余的菌液重悬菌体，涂布于加有100μg/mL氨苄霉素的LB平板；转化，得到重组大肠杆菌。 6.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，将重组大肠杆菌接种至LB液体培养基，37℃过夜培养，取菌液，以1％-2％接种量加入到100mL的LB液体培养基中，37℃培养，生长至菌液OD为0.5-0.8时，加入终浓度0.1-1mM的IPTG，继续诱导发酵16-24h；将诱导表达的大肠杆菌培养液，13000rpm离心10min，去除菌 2
实验四碱性蛋白酶活力的测定 （赖凌峰李佳佳邓仕彬） 一、原理 以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin 法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。 二、试剂 1、0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10） 2、5%三氯醋酸 3、1%酪蛋白溶液： 称取5g 酪蛋白置于500mL 0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解。 4、0.4mol/L 碳酸钠溶液 5、100μg/mL 酪氨酸溶液 6、Folin 试剂，稀释3 倍使用 如果自己配制，可按下法：于2000mL 磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MO2.2H2O）25g，加水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流10 小时。取下回流冷凝器，加入硫酸锂50g，水50mL 和浓溴水（99%）数滴，再煮沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤，制得的试剂应显金黄色，贮于棕色瓶内。 三、步骤 1、酶液的萃取 称取1g 粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL 酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。 2、酶活力的测定 样品管： 取不同量的酶液（0.2，0.4，0.6mL），用0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL 预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀并开始计时，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三
蛋白酶酶活测定方法 一、实验原理： 一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。 一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。 二、试剂配制： A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0） 试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。 底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。 三、操作步骤： 1. 试样 1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用 2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min 3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止 4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。 2.空白 1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min 2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min 3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
2020年测定蛋白酶活力实验 （课件） 测定蛋白酶活力实验 一、实验目的?１.加深了解酶活力的概念.?2。学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理?酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μｇ酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Fｏlin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比. 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力. 三、仪器和试剂?仪器：?恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。?原料?枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.0２ｍoｌ/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡1５分
钟，使充分溶解，干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释.?试剂?1. Folin－酚试剂：?在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠（Ｎａ2WoＯ4 . 2H2O）1０0g，钼酸钠（Na２WｏＯ４. 2H2O）25g,蒸馏水７00mL，８5％磷酸５0ｍL 以及浓盐酸100ｍL,充分混匀后,微火回流加热1０小时。再加入硫酸锂15０g,蒸馏水5０mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤,溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NａOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度（约为2moｌ/L),然后加水稀释至1mｏｌ／Ｌ，即可使用.?２.0.2mol/L 盐酸溶液3．0.04moｌ/L 氢氧化钠溶液?4．0。5５mol/L 碳 10%三氯乙酸溶液酸钠溶液?5 . 6. ０．0２mol／LpＨ7。5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2ＨPO4 ． 12H2O)7。１6g，用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠（Na2HPＯ4 .１2H2Ｏ）3.1２ｇ,用水定容至１0０mL(B 液)。取 A 液84mL，Ｂ液１6mL 混合后，得到0．2mol/LpH 7.５磷酸缓冲液，可长期 7。标准酪氨酸溶液存放。临用时稀释10倍即可。? （50μg/mL）：称取１２．5ｍg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2ｍoｌ/L 盐酸约３0mＬ溶解后，蒸馏水定容至２50mL。
碱性蛋白酶活力测定 1 定义 1克固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。 2 福林法 2.1 原理 碱性蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。 2.2 试剂和溶液 2.2.1福林酚试剂已配 2.2.2 碳酸钠溶液c(Na 2CO 3 )=0.4mol/L 称取无水碳酸钠(Na 2CO 3 )21.2g，用水溶解并定容至500mL。 2.2.3 三氯乙酸（CCl 3 ·COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。 2.2.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.05mol/L 按GB601配制。 2.2.5 硼酸缓冲溶液（pH10.5） 甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。 乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。 使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。 上述缓冲溶液，需用pH计校正。 2.2.6 10g/L 酪素溶液 称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用硼酸缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内储存，有效期为3天。 2.2.7100μg/mL L-酪氨酸标准溶液 a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100μg/mL L-酪氨酸标准溶液。 2.3 仪器和设备 2.3.1恒温水浴（40±0.2）℃
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化物酶（POD）测定方法 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法 （1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。（2）紫外吸收法： 称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，
2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
Vol．33 高等学校化学学报No．82012年8月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1788 1793结构预测及分子对接方法研究几种水解产物对 新阿魏酸酯酶的抑制作用 程凡升1，张茂秋1，程凡杰2，生吉萍1，3，陈婧雨1，郑鄢燕1，申琳1 （1．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2．四川大学物理科学与技术学院，成都610041； 3．中国人民大学农业与农村发展学院，北京100872） 摘要应用基于生物信息学的蛋白质结构预测方法，探讨了来源于荷斯坦奶牛瘤胃宏基因组文库的一个新 型阿魏酸酯酶（FAE- SH1）的结构及可能的催化机制．同时通过对该酶的预测结构与4种模式底物的对接研究发现，实验所测得酶促反应动力参数V max 与对接的亲和能存在线性关系，底物与酶形成的氢键可能是影 响催化效率的关键因素．同时，本研究发现D -木糖、L -阿拉伯糖、D -葡萄糖及阿魏酸能够对FAE- SH1的水解反应产生抑制作用，并对其进行了验证． 关键词阿魏酸酯酶；结构预测；分子对接；抑制作用 中图分类号 O641文献标识码A DOI ：10．3969/j．issn．0251-0790．2012．08．028收稿日期：2011- 12-05．基金项目：国家公益性行业（农业）科技专项（批准号：200803033）资助． 联系人简介：申琳，男，博士，副教授，主要从事农副产品综合利用和果蔬采后生物技术研究．E- mail ：shen5000@cau．edu．cn 秸秆、麸皮等农业废弃物是农业生产和食品加工中产生的副产物，也是重要的可再生生物资源．这些生物材料主要由纤维素、木质素和半纤维素等成分组成．上述成分的化学性质稳定且相互形成致密的交联结构，难以被微生物降解和利用［1］，因此一直以来没有被环保、高效及高值地加以利用．阿魏酸酯酶（Feruloyl esterase ，EC 3．1．1．73）作为一种能够解离这种交联结构的水解酶，在食品、纺织、 造纸和饲料等工业中具有非常广泛的应用前景 ［2，3］．但目前仅有部分真菌、少数细菌和极少数植物能够产生阿魏酸酯酶，且对该家族酶的分类及底物的利用特性一直存有争议［4］．对新阿魏酸酯酶的发 现、研究和利用一直是目前研究的热点．此外，阿魏酸酯酶能够从植物材料中释放出阿魏酸，阿魏酸是具有抗氧化、抗衰老及抗肿瘤等作用的天然产物，在化妆品、食品等工业中具有广泛的应用前景［1］． 对阿魏酸酯酶的催化特性和酶活抑制因素的研究对工业制取阿魏酸极为重要．目前仅有Xiros 等［5］以 Fusarium oxysporum 发酵产生的含阿魏酸酯酶的粗酶液为材料，研究了从酒糟中释放阿魏酸的影响因素，并发现阿魏酸的存在可抑制阿魏酸酯酶的活力．但阿魏酸酯酶水解过程中产生的其它物质（如糖类等）是否对阿魏酸的释放有抑制作用还有待进一步研究． 在前期的研究［6］中，本实验室利用宏基因组学技术构建了荷斯坦奶牛瘤胃微生物基因文库，筛选 并成功表达了一个新型阿魏酸酯酶（FAE- SH1）．该阿魏酸酯酶蛋白序列与目前已知阿魏酸酯酶相似度仅为57%．根据Crepin 分类法分析表明［7］，该酶属于C 类阿魏酸酯酶；蛋白序列聚类分析表明，该酶 与E 类阿魏酸酯酶相似性最高．根据Gupta Udatha 分类法将其归属于FAE1家族下1B 亚家族，但在该家族中目前还没有发现属于Crepin 分类法中的A ，B ，C 和D 4种家族的阿魏酸酯酶［4］．从蛋白质序列特征、蛋白质结构和底物分子利用角度对该酶进行研究，将拓宽人们对阿魏酸酯酶的认识．本文应用 多序列比对方法探讨了FAE- SH1一级结构保守序列与功能的关系，应用基于生物信息学的结构预测方法研究了其三级结构．将阿魏酸酯酶的4种模式底物与该酶预测结构进行分子对接，并研究对接数 据与实验数据间的关系．此外，本文还预测了几种糖类物质对阿魏酸酯酶FAE- SH1活力的影响，并利用实验进行了验证．
发酵实验总结 生物技术1002 1610100311 刘小波 摘要： 1、实验目的：通过本次实验，学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法，学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术，了解碱性蛋白酶活力测定的原理，掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。 2、实验方法：从玉米黄顶菊混种土壤中筛选蛋白酶，之后经液体发酵扩大培养，挑选出活力较强的菌落，通过碱性蛋白酶活力测定的方法测出蛋白酶活力的大小。 3、实验结果： 实验原理： 1、能够产生胞外蛋白酶的菌株在平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的筛选依据。 2、蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可以利用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，先对分子质量较小的仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算酶的活力。 实验材料： 玉米黄顶菊混种土样、酪蛋白、牛肉膏、磷酸氢二钠、氯化钠、琼脂、蒸馏水、0.02mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.5）、1%酪蛋白溶液、5%三氯醋酸（TCA）溶液、烧杯、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、移液枪、电子秤、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、离心机、水浴锅、紫外线分光光度计等。实验方法： 蛋白酶的筛选： 1、准确称取玉米黄顶菊混种土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，用手震荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8一系列稀释菌液。 2、配酪素培养基（加琼脂），高压灭菌，倒平板，编号1、2、3。另外配不加琼脂的液体培养基，
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。