细菌生理生化试验—小木虫
微生物生理生化反应就是指用化学反应来测定微生物得代谢产物,生理生化反应常用来鉴别一些在形态与其它方面不易区分得微生物。因此微生物生理生化反应就是微生物分类鉴定中得重要依据之一，微生物鉴定中常用得生理生化反应如下所示:
(一)糖、醇发酵试验
原理:
不同微生物分解利用糖类得能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者,或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖(醇、苷）产酸(符号:＋)、产气(符号:○)，培养基由紫(蓝)变黄(指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄得结果),并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄;有些不分解糖类（符号:－），培养基仍为紫（蓝)色。
培养基配制:
一般细菌常用休与李夫森二氏培养基：
蛋白胨:2ｇ,Ｋ2HPO4 :０、2ｇ,NaCｌ:5g ,糖(醇、糖苷）：１％,水洗琼脂:５～６ｇ，蒸馏水:1000mL,PH:6、8～7、０,溴百里酚蓝：１%水溶液3mL（先用少量得9５%乙醇溶解后,再加水配成１%水溶液)。先调PＨ后再加指示剂。
芽孢杆菌培养基配制:
(NＨ4)２HPO4:1g ,MgSＯ4：0、2g,KCl:0、2g ，酵母膏：0、２g,糖(醇、糖苷):1%水洗琼脂:5～6g ,蒸馏水:1000ｍＬ,溴甲酚紫：0、4％乙醇液2ｍL,PH:６、８～７、0。先调ＰH后再加指示剂。
将以上培养基分装试管,培养基高度约为4~5cm ,1１5℃灭菌20miｎ。
测定得糖(醇、糖苷)类可以包括:葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖(1、5％)、半乳糖(1、5%)、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。
注意：以上亦可用液体培养基。
接种与观察结果:
用1８～24h得幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d,3ｄ,5d后观察,颜色变黄为阳性,不变为阴性;有气泡产生为产气。
结果记录:
产酸:+，产气:○,不产酸长气：- 。
(二) 淀粉水解试验
原理：
某些细菌可以产生分解淀粉得酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。
培养基配制:
牛肉膏5g;NaCｌ:5g;可溶性淀粉5g;琼脂：20g；蒸馏水1００0mＬ。ＰＨ：7、2
121℃灭菌20mｉn。
试验方法：
以18~2４h得纯培养物,点接于淀粉琼脂平板(一个平板可分区接种)或直接移种于淀粉肉汤中,于3６±1℃培养24～4８ｈ，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面,若为液体培养物,则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。
淀粉水解系逐步进行得过程,因而试验结果与菌种产生淀粉酶得能力、培养时间,培养基含有淀粉量与pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH７、2最适。淀
粉琼脂平板不宜保存于冰箱,因而以临用时制备为妥。
结果记录:分解:+，不分解:-。
(三) Ｖ-P试验
原理：
菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下,被空气中得氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中得胍基生成红色化合物，称V－Ｐ(+)反应。
培养基配制方法:
蛋白胨5g；葡萄糖５g;ＮａCl(K2ＰO4)：5ｇ；蒸馏水:1000mL;PH:7、０～7、２,分装试管,毎管装约4～5cm，1１5℃灭菌2０mｉn。
试剂：４0%NａOH(或ＫOH),a-萘酚。
试验方法：
将试验菌接种于上述培养基,于3６±１°C培养4天、培养液2、5mｌ先加入a萘酚(２－na-phthol)纯酒精溶液０、6ml,再加40％氢氧化钾水溶液0、２mｌ，摇动２～5ｍin，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现,静置于室温或36±1°Ｃ恒温箱，如2ｈ内仍不显现红色、可判定为阴性。
结果记录:阳性:+,阴性:-。
(四）甲基红(Methyl Red)试验
原理：
有些细菌能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢得途径不同，可产生乳酸,琥珀酸、醋酸与甲酸等大量酸性产物,可使培养基ＰＨ值下降至pH4、5以下，使甲基红指示剂变红。
培养基配制方法:
与V－P试验培养基一致。
试剂:甲基红:0、1g,９5%乙醇:３00mL,蒸馏水:200mL。
试验方法：
挑取新得待试纯培养物少许,接种于通用培养基,培养于3６±１°C或30°C(以３0°C较好）３～5天,从第二天起,每日取培养液1ｍl,加甲基红指示剂１～2滴,阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阳性、即可判定结果。
结果记录:阳性:+,阴性：- 。
（五）菌膜形成试验
有些菌在液体培养基中能形成菌膜，利用这一特征可进行不同细菌得区别。
培养基配制方法:蛋白胨:5g;氯化钠:5g；牛肉膏:１０g;蒸馏水：1000mL;pH :7、2。121℃灭菌15~3０ｍin。
试验方法:接种后于30℃培养2４小时，观察培养物就是否有菌膜形成,有菌膜为阳性。（六) 明胶(Geｌａtin)液化试验
原理:
有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。
培养基配制方法:蛋白胨:5g，明胶:1２0ｇ，蒸馏水:100０mＬ。PＨ:7、2~7、４,分装试管,毎管装约４～５ｃm,11５℃灭菌2０ｍin。
试验方法:
挑取18~2４h待试菌培养物,以较大量穿刺接种于明胶高层约２/3深度。于2０～２2℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于3６±1℃。每天观察结果,若因培养温度高而使明胶本身液化
时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其就是否被细菌液化,如确被液化，即为试验阳性。否则为阴性。
（七) 尿酶(Urease)试验
原理:
有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解、产生2个分子得氨,使培养基变为碱性,酚红呈粉红色。尿素酶不就是诱导酶,因为不论底物尿素就是否存在,细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7、０。
培养基配制方法：
蛋白胨:1 g ；NaCｌ:5 g；KＨ2PO4:２g ;葡萄糖 1 g ;琼脂:15 g;酚红:0、０12g;蒸馏水100０ml。
除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6、８～6、9,然后加入酚红指示剂,使培养基呈橙黄色，分装,115℃灭菌２0miｎ。待培养基冷至５0℃左右,加入预先过滤除菌得20%尿素水溶液,使其终浓度为2％。
试验方法:
挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面,不要到达底部,培养1～4d观察结果,如为阴性应继续培养一下,作最终判定,变为粉红色为阳性。
(八)氧化酶（Oxidaｓe）试验
原理:
氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统得终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化,产生颜色反应。
试剂:
试验方法:在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂１~2滴，阳性者Ｋｏvaｃｓ氏试剂呈粉红色~深紫色,Ewｉng氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。
（九）过氧化氢酶试验(触酶试验）
具有过氧化氢酶得细菌，能催化过氧化氢生成水与新生态氧,继而形成分子氧出现气泡。
方法:直接滴加3%过氧化氢于不含血液得细菌培养物中,立即观察,有大量气泡产生者为阳性,不产生气泡者为阴性。
（十) 精氨酸脱羧基酶试验
培养基:
Ｋ2ＨPO4: 1、0g
NH４Cｌ:１、０g
MgSＯ4: 0、2g
酵母膏: 0、2g
葡萄糖:１、０g
ＤＬ－精氨酸: 1、０g
１、６%溴甲酚紫: 1ｍL
Ｈ2O: 100０ｍL
pH: ６、7-6、８
分装试管,115℃灭菌30min。
接种后置3０℃培养2４h,紫色者为阳性，呈黄色者为阳性。
（十一）卵磷脂酶试验：
培养基:
蛋白胨: 10g
酵母膏: ３g
ＮaCl: 5ｇ
琼脂：2０ｇ
Ｈ2O: 10００mL
pH: ７、0-７、2
分装三角瓶,１２1℃灭菌３0mｉn。
用75%乙醇将新鲜鸡蛋表面消毒，并用经火焰灭菌得镊子将鸡蛋打一个孔,倾去蛋清,然后用5ｍL无菌吸管吸出卵黄,加入到融化后冷却至５0℃左右得培养基中，使卵黄含量为培养基总体积得2-３%，混匀后倒平板,点接菌种，30℃培养２4ｈ后观察,菌落边缘出现浑浊圈者为卵磷脂酶阳性。
（十二) 蛋白质水解试验：(即明胶水解试验)
培养基:
牛肉膏: 5、0g
蛋白胨: 1、0g
明胶：4、0g
葡萄糖: 1、0g
NaＣl:5、0g
K2HPＯ4：0、5ｇ
ＫH2ＰＯ4: 0、5g
琼脂: 20ｇ
Ｈ２Ｏ：1000mL
分装三角瓶,121℃灭菌30miｎ。
将培养基融化后倒平板,并点接菌种,3０℃培养２d,用酸性升汞溶液倾注于平板表面,如果菌落周围出现透明圈，则为阳性。
(十三) 七叶苷试验(七叶灵试验）：
培养基:
牛肉膏:１0g
七叶灵：5ｇ
琼脂: ２0ｇ
Ｈ2O：1０0０mＬ
pH:自然
分装三角瓶,121℃灭菌３0min。
另配5％FｅＣl３水溶液,单独灭菌。培养基融化后,先将每个平板加上FeＣl3溶液二滴,然后倒培养基混匀,凝固后点接菌种,３０℃培养2－3ｄ观察。菌苔周围出现深褐色区者为阳性反应。
(十四)Tween8０试验：
培养基:
蛋白胨：10ｇ
NaCl: 5g
CaCｌ２: ０、1g
琼脂: 9g
Ｈ2O: 1０00mL
分装三角瓶,121℃灭菌20mｉｎ。
冷却至50℃,加入Tweｅn 8０至终浓度体积分数为１%，倒平板,点接测试菌,３5℃培养7d。
有晕圈者为阳性。
(十五）水杨苷试验:
培养基：
K2HPO4:１、0g
NH4Cl: 1、0g
MgＳO4:０、2g
酵母膏:0、２g
１、6%溴甲酚紫：1mL
H2Ｏ：１0００ｍL
ｐH: 7、0-7、2
水杨苷: 5、0g
分装试管,115℃灭菌30ｍiｎ。
接种后置３０℃培养,培养基变黄者为糖发酵阳性。
(十六) 实施几丁质利用实验:
胶体几丁质: １0、0g
蛋白胨: ３、０g
MgＳO4: 0、5g
FeSＯ4: 0、01ｇ
KH2PO4：0、3g
Ｋ２HPO4：0、7g
ZnSO4: 0、0０1g
琼脂: 2０g
ｐH：7、２-7、4
H２Ｏ:1000mL
分装三角瓶，1２1℃灭菌15-30min。
冷却至50℃倒平板,点接菌种,30℃培养适当得时间,能生长并且在菌落周围形成透明圈得为阳性。
胶体几丁质得制备:
称取5g几丁质加2０mＬ丙酮，１００mL浓盐酸，在4℃下电磁搅拌24ｈ,使几丁质充分溶解。然后用玻璃纤维过滤到５０0mL得去离子冰水中,同时搅拌,用离心得方法将其洗至pH 值近中性,最后加适量去离子水高压灭菌后保存。
(十七)精氨酸脱羧基酶试验
培养基:
K2ＨPO4:1、0g
NH4Cl:1、0g
MｇSO4: 0、2g
酵母膏: ０、2g
葡萄糖: １、０g
DL－精氨酸: 1、0ｇ
1、6%溴甲酚紫: 1mL
H２O: １0０0mL
pH：6、７-6、8
分装试管,115℃灭菌３0ｍin。
接种后置３0℃培养24h,紫色者为阳性,呈黄色者为阳性。
(十八) 卵磷脂酶试验：
培养基:
蛋白胨：10g
酵母膏: 3g
NaCl: ５g
琼脂: 20g
H２O：100０ｍL
pH: ７、０-7、２
分装三角瓶，１21℃灭菌3０ｍｉｎ。
用７５%乙醇将新鲜鸡蛋表面消毒,并用经火焰灭菌得镊子将鸡蛋打一个孔,倾去蛋清，然后用5mＬ无菌吸管吸出卵黄,加入到融化后冷却至50℃左右得培养基中,使卵黄含量为培养基总体积得2-3%,混匀后倒平板,点接菌种，30℃培养２4ｈ后观察,菌落边缘出现浑浊圈者为卵磷脂酶阳性。
（十九) 蛋白质水解试验:(即明胶水解试验)
培养基:
牛肉膏：5、0g
蛋白胨:1、０g
明胶: 4、0g
葡萄糖: １、０ｇ
ＮaCl: 5、0ｇ
K2HＰＯ4: 0、5g
KH2PO４:0、5g
琼脂: 20g
H2Ｏ: 1000mL
分装三角瓶,１21℃灭菌30ｍin。
将培养基融化后倒平板，并点接菌种，30℃培养2ｄ,用酸性升汞溶液倾注于平板表面,如果菌落周围出现透明圈，则为阳性。
(二十)七叶苷试验（七叶灵试验)：
培养基：
牛肉膏: 10g
七叶灵:5g
琼脂: 20g
H2Ｏ: 1００0mL
ｐH:自然
分装三角瓶,121℃灭菌30min。
另配5%FeＣl3水溶液,单独灭菌。培养基融化后，先将每个平板加上FeCl3溶液二滴,然后倒培养基混匀,凝固后点接菌种,30℃培养２-3ｄ观察。菌苔周围出现深褐色区者为阳性反应。
实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.
左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．
左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．
各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。 1.碳水化合物的代谢试验 1.1糖（醇、苷）类发酵试验 1.1.1原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。 1.1.2方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。 1.1.3 结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。 1.1.4 应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发
酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。 表 1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类 单糖四碳糖：赤藓糖 ; 五碳糖：核糖、核酮糖、木糖、 阿拉伯糖; 六碳糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖 双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）、乳糖（葡萄糖＋半乳糖）、 麦芽糖（两分子葡萄糖） 三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖菊糖（多分子果糖）、淀粉 醇类侧金盏花醇、卫茅醇、甘露醇、山梨醇 非糖类肌醇 1.2．葡萄糖代谢类型鉴别试验 1.2.1 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。 1.2.2 方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。 1.2.3 结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。
菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑 实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验 一、实验目的： 1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定lopat实验方法 二、实验材料： 猕猴桃溃疡病病原菌（分类地位薄壁菌门Gracilicutes，Proteobacteria纲假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas）、SPA培养基：蔗糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml 对照SPA培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml Thornley培养基配方：蛋白胨1g，精氨酸10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，琼脂6g，蒸馏水1000ml 1%二甲基对苯二胺盐酸盐，3×108 /ml的菌液（病原菌），烟草，马铃薯； 灭菌培养皿及培养基（平板）110套、未灭菌培养皿110套，接种针15个，试管110支，接种针55把，滤纸55张，试剂瓶55个，胶头滴管55支，喷壶55个 三、试验方法： 果聚糖试验（Levan formation）： 用细菌悬浮液，在SPA培养基上，再用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。 在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。 氧化酶试验（oxidase reaction）： 在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。 在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应 氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶 马铃薯软腐试验（potato erroring capacity）： 在马铃薯上做刺伤伤口，将细菌接到伤口上，几天后观察，是否出现软腐。 精氨酸双水解酶检验（argine reaction）： 配制Thornley培养基。每试管装3–4 ml培养基灭菌，冷却，针刺接种细菌至培养基底部，立即用凡士林封管，在27℃条件下培养7 d。 在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。 细菌的精氨酸双水解作用是将精氨酸经过两步水解，生成有机胺和无机氨。鉴定细菌的精氨酸试验，无论发酵菌还是非发酵菌，革兰阳性菌还是革兰阴性菌，测的都是精氨酸双水解酶，使用脱羧酶试验培养基。所以，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶用同一种基础培养基，为Moeller配方或Falkow配方，均须加盖石蜡油。对于发酵菌，细菌生长后，培养基变黄为阴性，变紫为阳性；对非发酵菌，培养基颜色不变为阴性，变黄为阳性。另有一种精氨酸双水解酶专用培养基，其中使用的是酚红指示剂。这种配方目前已不使用。细菌生化反应表中的精氨酸双水解酶的阳性百分率也不是在这种培养基上做的，所以，该配方实际已淘汰。 烟草过敏性反应（tobacoo hypersensitivity）：
细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.
左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．
左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．
细菌的生物化学试验 ●考点 碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验 各种酶类试验 抑菌试验 复合生化试验 不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。 一、碳水化合物的代谢试验 原理：细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。 1.糖（醇、苷）类发酵试验 原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。 培养基：在培养基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。 方法：接种，培养。结果：产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应。 产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。 不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。 应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。 2.氧化-发酵试验（O/F试验） （1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖而分解蛋白胨的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。 （2）培养基HL：Hugh-Leifson培养基。 （3）方法：将待检菌同时穿刺接种于两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液状石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35℃培养48小时或更长。 （4）结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加液状石蜡的培养基产酸为氧化型。 （5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与不发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。 3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验） （1）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚。 （2）试剂：0.75M ONPG溶液 （3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴20分钟～3小时观察结果。 （4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30分钟内显色。
细菌鉴定中常用的生理生化反应 录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源：中国生命科技论坛 1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 （2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 （4）大分子物质代谢实验． 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。 2、实验仪器，材料和用具 （1）实验仪器 37OC 恒温培养箱、20OC 恒温培养箱（室温代替）。 （2）微生物材料 大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1 支。 （3）试剂
细菌生理生化试验—小木虫 微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示： (一) 糖、醇发酵试验 原理： 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。 培养基配制： 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基： 蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。 芽孢杆菌培养基配制： (NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。 将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm ，115℃灭菌20min。 测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。 注意：以上亦可用液体培养基。 接种和观察结果： 用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。 结果记录： 产酸：+，产气：○，不产酸长气：- 。 (二) 淀粉水解试验 原理： 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 培养基配制： 牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2 121℃灭菌20min。 试验方法： 以18~24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24～48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养
【实验题目】 微生物生理生化实验 【实验目的】 1.了解生理生化的意义。 2.掌握几种常用生理生化的实验方法。 【实验器材】 1、菌种： 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，变形杆菌，产气肠杆菌 2、试剂： 卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等 3、仪器和用具： 酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管等 4、培养基 淀粉培养基、油脂培养基（大分子物质水解实验） 葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内附倒置的德汉氏小管）（糖发酵实验） 蛋白胨水培养基（吲哚实验） 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红培养基） 【实验原理】 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以促进细胞外的化学反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同，反映出他们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。具体实验原理如下： 一、大分子物质的水解实验原理 1、淀粉水解 由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，所以必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内。如淀粉酶将淀粉水解为小分子的糊精,双糖和单糖，能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉。已知淀粉遇到碘会显现蓝色，因此可通过在淀粉培养
基上滴加碘液来判断微生物是否能产生淀粉酶分解淀粉，菌落周围不呈蓝色，出现无色透明圈，则该菌种能够水解淀粉。 2、油脂水解 脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸，而产生的脂肪酸可改变培养基的PH,因此在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后可通过观察菌苔的颜色判断菌种是否能够水解油脂，若出现红色斑点，则说明这种菌可产生分解油脂的酶。 二、糖发酵实验原理 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细 菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 图1：糖发酵实验 三、IMViC 实验 1、吲哚实验 用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的 色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。 2、甲基红实验 某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸、乙酸和乳酸 等多种有机酸，使培养基的PH 值降低，加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色， A 培养前的情况 B 培养后 产酸不产气 C 培养后 产酸产气
细菌的生理生化反应实验 一．目的与意义 一般来说，对一株从自然界或其他样品中分离纯化的未知菌种的鉴定要做以下几个方面工作。①个体形态观察，进行革兰氏染色，分辨是G（+）菌还是G（-）菌。并观察其形状、大小、有无芽孢及其位置等；②菌种形态观察，主要观察其形态、大小、边缘情况、隆起度、透明度、色泽、气味等特征；③做动力试验，看他能否运动及其鞭毛着生类型（端生、周生）；④做生理生化反应及做血清学反应实验。最后根据以上实验项目的结果，通过查阅微生物分类检索表，给未知菌进行命名。 此实验为生理生化反应实验，就是使不同种类的细菌在对营养物质的利用、代谢产物的种类、代谢类型等方面表现出差异，故利用这些差异作为细菌分类作为细菌分类鉴定的重要依据。要求在此实验中了解细菌在不同底物环境中各种代谢途径和产物，加深理解细菌生化反应原理；根据细菌在培养基中生理生化特点，学会鉴定细菌。 生理生化反应的项目很多。本实验结合肠道杆菌科的分类鉴定，选作其中重要的几项实验。 二．材料与用具 1.菌种：大肠杆菌、沙门氏菌。 2.培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）、葡萄糖蛋白胨水培养基、童汉氏蛋白胨水培养基、
柠檬酸盐斜面培养基（添加溴麝香草酚蓝变色范围pH6.8 绿—pH7.6 蓝）、三糖铁琼脂培养基。 3.试剂：甲基红指示剂、40%NaOH、吲哚检验试剂（对二甲基氨基苯甲醛）、双氧水等。 4.用具。酒精灯、接种环、接种针、试管等。 三．实验内容与方法 1.糖（醇）类发酵实验 多数细菌都能利用糖类作为碳源及能源，但各种菌因含有不同发酵糖（醇）类的酶，故表现出有的能分解或不分解某些糖类，有的分解糖产酸，并产气，或只产酸不产气，可根据这些特点鉴别细菌（培养基中指示剂溴甲酚紫pH6.8以上呈紫色，pH5.2以下呈黄色）。 大肠杆菌与沙门氏菌的生理生化鉴定区别 操作：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）中，无菌操作，穿刺接种，37℃培养1天。 记录：阴性—不产酸（紫色）；阳性—产酸（黄色）。 2.甲基红（M·R）实验 某些菌在糖代谢过程中，分解糖类，产生丙酮酸，继而再分解为各种酸，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为阳性反应；若分解糖产酸少，或所产生的酸转换为其他物质，则培养基pH在4.5以上，加入指示剂呈黄色，为阴性。 操作：葡萄糖蛋白胨水培养基中，无菌操作，斜面取菌接种，37℃培养2天。观察时加入甲基橙试剂。
细菌的生理生化反应实验报告 【实验目的】 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。 【实验原理】 通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些第五的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物带血的多样性。某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚， 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应，形成红色的玫瑰吲哚，为吲哚反应阳性。微生物发酵葡萄糖成丙酮酸，2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下与 肌酸类物质反应，生成红色化合物为.反应阳性。有些细菌发酵糖类产生有机酸较多，使发 酵液的pH下降到以下，当加入甲基红试剂后，时发酵液变红色，为甲基红反应阳性。某种 微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。 【实验材料和用具】 1.菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌。 2.培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗 糖）、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂 3.仪器：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液枪、滴管、 杜氏小管。 【实验方法】 （一）V-P反应 1.试管标记取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录去除以上培养物，分别取出2ml培养液加入另外5支相应编号的空试管中，加入与培养液等量的V-P试剂，充分震荡2min。放置37度恒温培养箱中培养30min观察记录结果。 （二）甲基红实验 于V-P实验留下的培养液中，分别加入2-3滴甲基红指示剂，立即观察培养液的颜色变化（三）吲哚实验 1.试管标记取5只装有蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变 形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录在培养基中加入乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙 醚层浮于培养液的上面，此时沿试管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂。观察记录结果 （四）糖发酵试验 1.试管标记取分别装有葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵培养液试管各4支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录 【实验结果与分析】 （一）V-P 大肠产气枯草变形对照 结果—+———
1 目的 1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理 1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法 2 原理 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。 3 材料 3.1 菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌 （Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种 3.2 培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖） 3.3 试剂 40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。 3.4 器具
超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。 4 流程 糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验 5 步骤 (一) 糖类发酵试验 1 目的 了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法． 2 原理 可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌 种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。 3 材料 3.2菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌 （Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种 3.３培养基 葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 ４流程 发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录
生长温度的测定： 根据不同的细菌，配置其生长所需最适宜的液体营养培养基，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的新菌接入到培养基内（实验组），用不接种细菌的培养基做为对照（对照组），将培养基放入不同温度下培养7d，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ=600nm处的吸光值，最后得出新菌可生长温度和最适生长温度范围。测试温度如下：4 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃。 生长pH的测定： 配置新菌生长所需要的最适液体营养培养基，用如下缓冲体系调节培养液的pH，pH 4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸； pH 6.0–8.0，0.1mol/lNaOH和0.1mol/lKH2PO4； pH 9.0–10.0，0.1mol/lNaHCO3和0.1mol/lNa2CO3； pH 11.0，0.1mol/lNaOH和0.05mol/lNa2HPO4[23]。 将细菌接入到培养基内，每个pH做三个重复，用不接种细菌的培养基作为对照，将培养基放入新菌生长最适温度下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在λ=600nm处的吸光值，最后得出新菌可生长pH和最适生长pH范围。测试的pH如下：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。盐浓度耐受： 配置新菌生长所需要的最适液体营养培养基，调节培养基的盐浓度。将活化好的新菌接入到已灭菌的培养基内，每个盐浓度做三个重复，用不接菌的培养基作为对照，将培养基放置在新菌生长最适条件下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的情况时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长 λ=600 nm处的吸光值，最好得到新菌所能耐受的盐浓度范围。测试盐浓度如下：0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%。
细菌的生理生化反应实验方案 一．实验目的 此实验为生理生化反应实验，就是使不同种类的细菌在对营养物质的利用、代谢产物的种类、代谢类型等方面表现出差异，故利用这些差异作为细菌分类作为细菌分类鉴定的重要依据。要求在此实验中了解细菌在不同底物环境中各种代谢途径和产物，加深理解细菌生化反应原理；根据细菌在培养基中生理生化特点，学会鉴定细菌。二．材料与用具 1.菌种：1-5,2-7,4-1,4-2,4-3 2.培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）、葡萄糖蛋白胨水培养基、童汉氏蛋白胨水培养基、 柠檬酸盐斜面培养基（添加溴麝香草酚蓝变色范围pH6.8 绿—pH7.6 蓝）、三糖铁琼脂培养基。 3.试剂：甲基红指示剂、40%NaOH、吲哚检验试剂（对二甲基氨基苯甲醛）、双氧水等。 4.用具。酒精灯、接种环、接种针、试管等。 三．实验内容与方法 1.糖（醇）类发酵实验 多数细菌都能利用糖类作为碳源及能源，但各种菌因含有不同发酵糖（醇）类的酶，故表现出有的能分解或不分解某些糖类，有的分解糖产酸，并产气，或只产酸不产气，可根据这些特点鉴别细菌（培
养基中指示剂溴甲酚紫pH6.8以上呈紫色，pH5.2以下呈黄色）。 操作：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）中，无菌操作，穿刺接种，37℃培养1天。 记录：阴性—不产酸（紫色）；阳性—产酸（黄色）。 2.甲基红（M·R）实验 某些菌在糖代谢过程中，分解糖类，产生丙酮酸，继而再分解为各种酸，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为阳性反应；若分解糖产酸少，或所产生的酸转换为其他物质，则培养基pH在4.5以上，加入指示剂呈黄色，为阴性。 操作：葡萄糖蛋白胨水培养基中，无菌操作，斜面取菌接种，37℃培养2天。观察时加入甲基橙试剂。 3.维培（V—P）二氏实验 某些菌能从葡萄糖—丙酮酸—缩合、脱羧为乙酰甲基甲醇，继而再有些碱存在时氧化成双乙酰，双乙酰与培养基中蛋白胨中的精氨酸胍基起作用，产生粉红色化合物（加入肌酸或肌酐等胍基化合物可加速此反应）。 操作：葡萄糖蛋白胨水培养基中，无菌操作，斜面取菌接种，37℃培养2天。观察时加入与培养基等量的40%KOH溶液。 记录：粉红色—阳性；无反应—阴性。 4.吲哚（靛基质）产生实验 某些细菌具有色氨酸水解酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，后者与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成红色的玫瑰吲哚化合物。
微生物鉴定的生理生化反应 各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同 细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。 一、碳水化合物的代谢试验 1．糖（醇、苷）类发酵试验 （1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷） 类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检 查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。 (2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或 低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求 培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。 (3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变 为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不 分解糖则无变化。 (4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不 同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃 希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此 试验鉴别细菌。 表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类 单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖 双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖） 三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖菊糖（多分子果糖）淀粉 醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇 非糖类肌醇 2．葡萄糖代谢类型鉴别试验 (1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降 解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分 解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。 (2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。。 (3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加 液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。
实验六细菌鉴定中常用的生理生化反应 一、实验目的 1、了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法。 2、通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的 多样性。 3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 4、学习各种接种技术。 二、实验原理 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。 1、糖（醇）类发酵实验 不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫【pH 5.2（黄色）~ pH 6.8（紫色）】，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。 2、甲基红实验（M.R.实验） 甲基红【pH 4.4（红色）～pH 6.2（黄色）】实验，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4.2 以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH 升至大约6。 3、Voges-Proskauer 实验（伏-普实验，V.P. 实验） 伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为 V.P. 反应阳性。 4、靛基质（吲哚）实验 某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 5、硫化氢实验 某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。 6、明胶液化试验
姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白 胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测 1 / 8
酵母菌生理生化试验
一、酵母菌糖发酵试验 （一）实验目的 了解鉴别酵母菌的实验方法。 （二）实验原理 酵母菌在厌氧条件下能分解糖类，产生各种有机酸、气体和其它产物。酵母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异。因此，这是鉴别酵母菌种类的一项重要依据。 酸的产生可根据培养基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫变黄）或溴麝香草酚蓝（PH7.6-6.0由蓝变黄）指标剂颜色的改变来确定。产气可由发酵管气泡的产生 予以证实。 （三）材料 糖发酵基础液（见附录I）, 1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚蓝溶液（见附 III），葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖，啤酒酵母斜面菌种。 （四）实验内容 1、糖发酵基础液配制好后，按培养液容量的1%加入糖，分装于杜氏发酵管中 （培养液的高度约为4-5厘米），再在试管内加入倒置的小玻管（约0.4X 2.0-2.5厘米）一支。每种糖设三个重复管，121C高压灭菌15分钟。 2、将啤酒酵母分别接入上述各发酵管中，置30C下培养48-72小时，另以不接种者作
对照。 3、如产酸则培养液pH值下降而变黄色；如产气，贝U必先产酸，并在杜氏小管顶端出现气泡。 4、结果记录。以“”表示产酸，“ 0”表示产气，“ + ”表示产酸产气，“一”表示无变化，“碱”表示产碱。 二、酵母菌碳源同化试验 （一）实验目的 了解酵母菌对各种碳源的利用情况。 （二）实验原理 碳是酵母菌细胞的重要组成成分，约占酵母菌体重量的50%，为酵母菌生命活 动提供所需的能量和组成其结构的物质。酵母菌对各种碳源的利用，因种类不同而异。这是酵母菌分类鉴定的一个重要依据。 （三）材料 无碳基础培养基（见附录I），啤酒酵母斜面菌种，0.5%的葡萄糖、蔗糖、孚L 糖、半乳糖、麦芽糖溶液。 （四）实验内容