方法
2.3。5 细菌的生理生化鉴定
１、形态学观察
采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏染色进行油镜观察。
① 革兰氏染色
溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95％乙醇，番红复染液等.
试验步骤：（1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。
(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。
（3）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
(4）脱色：在上述涂片上流加95％乙醇溶液（一般20~30s）,当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。
（5）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min,水洗,用吸水纸吸去残水晾干。
(6）镜检：用油镜观察。
②芽孢染色
（1）制片:按常规方法涂片、干燥及固定。
（2）加热染色：向载玻片滴加数滴5％孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min,加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸.
脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色.
(3）复染：用0.5％番红水溶液复染2min。
(4) 水洗:用缓流自来水冲洗至无色。
(5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。
③鞭毛染色(硝酸银染色法）
(1) 载玻片准备:将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸 20min，然后用清水充分洗净,再置于 95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
(2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。
（3) 制片:取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片,使菌悬液流向另一边,用吸水纸吸取多余的菌悬液,自然干燥。
（4）染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色,鞭毛显褐色。
（5）镜检：用油镜镜检观察。
A、B液需现用现配（4h内效果最佳，1d内可用):
A：单宁酸5ｇ,三氯化铁1.5ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15％甲醛2mL.
B：硝酸银粉末2ｇ,水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用,往90mL溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴至出现薄雾。
２、糖类分解试验
配方：蛋白胨 1。0ｇ；NaCl 0。5ｇ；0。2％溴百里香酚兰 1。2mL;葡萄糖 1.0ｇ；蒸馏水 100mL。
基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二氧化碳等)。当发酵产酸是，指示剂可有紫色(pH6。8)转变为黄色（pH5。2).气体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。
试验步骤:用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的编号。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行,可留一个空白，作为对照。在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡.再将将上述已接种的和对照管置37℃温室中培
养2～3d 。观察颜色变化及小试管中有无气泡。
３、V —P 试验
配方：蛋白胨 1.5g ；葡萄糖 1。5g;K 2HPO 4 1。5g ；蒸馏水300mL ；pH ：7。4
基本原理：此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境再被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称V —P 反应。
试验步骤：将被检菌接种于试验培养基中，培养2～7d 后，于培养物中加入1mL 10％ 的NaOH ，混匀，再加入3～4滴2% 氯化铁溶液.数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性.
４、甲基红试验
配方：与V-P 试验的配方相同
基本原理：某些细菌在糖代谢过程中，会分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸还可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH 将至4。5以下，当加入甲基红试剂则呈红色,为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量小，或者产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍会在pH6。2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色,为阴性。 试验步骤:接种细菌于培养基，在37℃培养2~7d 后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0。1ｇ甲基经溶于300mL 95% 乙醇中,加蒸馏水至500 mL),如呈红色,表示阳性.
５、柠檬酸盐利用试验
配方：柠檬酸钠1ｇ;硫酸镁 0.2ｇ;NaCl 5ｇ；NH 4H 2PO 4 1ｇ;K 2HPO 4 1ｇ;琼脂 20ｇ；1%溴麝香草酚蓝酒精溶液 10mL ；蒸馏水 1000mL 。
基本原理：柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐能否被利用。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，是培养基的pH 升高，当加入1％溴麝香草酚蓝指示剂时,培养基就会有绿色转变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH 小于6。0时呈黄色，pH 在6。5～7.0时为绿色，pH 大于7.6时呈蓝色。
试验步骤：将被检菌接种到Simmons 固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2～4d ，能利用柠檬酸
盐的细菌表现为有细菌生长,培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。
６、硝酸盐还原试验
配方：硝酸钾 0。2ｇ；蛋白胨 5ｇ;蒸馏水1000mL；pH:7。4。
甲液：４-苯胺磺酸(对氨基苯磺酸） 0.4ｇ；5mol/L冰醋酸 50mL。
乙液：α—萘胺 0。25ｇ;5mol/L冰醋酸 50mL.
基本原理：某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐,亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的４-苯胺磺酸作用生成重氮基苯磺酸,后者与α-萘胺结合生成N—α萘胺偶苯磺酸。
试验步骤:将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1~2d，每管中先加入甲试剂0.1mL，再加乙试剂数滴,如出现红色，表示阳性。
注：本试验阴性的原因有三:细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
７、淀粉水解试验
配方：牛肉膏 0。5ｇ；蛋白胨 1ｇ;氯化钠 0。5ｇ；可溶性淀粉 0。2ｇ；蒸馏水 100mL;琼脂 2ｇ;pH：7.0～7.2。
基本原理:有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色.
试验步骤:将细菌划线接种于平板上，37℃左右培养1～2d,生长后取出,在菌落处滴加革兰氏碘液少许,能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环，培养基会呈深蓝色。
８、吲哚（靛基质）试验
配方:蛋白胨 1ｇ；NaCl 0.5ｇ；蒸馏水 1000mL；pH:7.6。
吲哚试剂自行配制：对二甲基氨基苯甲醛 0。5g；乙醇(95%） 47。5mL；浓盐酸 10mL.
基本原理：有些细菌可以产生色氨酸酶,分解色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰吲哚，因此可根据细菌能否分解色氨酸产生吲哚来鉴定菌种.
试验步骤:将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1～2d.于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3mL,摇匀，静置片刻后,沿管壁加入吲哚试剂2ml,如出现红色沉淀,表示为阳性。
９、接触酶试验
配方:牛肉膏蛋白胨培养基
基本原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
试验步骤：将1ml 3％的H
2O
2
倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡(O
2
）发生者为阳
性。也可于清洁小试管中加少量（30％），再用清洁无菌的细玻棒(或火焰封口的毛细管或镍
铬做成的接种环）醮细菌少许,插入H
2O
2
液面下，有气泡者为阳性.也可在玻片上滴一滴H
2
O
2
蘸取少许培养物，混合，有气泡者为阳性.
2.3.6 确定菌种类型
参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（ Buchanan ＆ Gibbons，1984）和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英,1999) 确定菌种类型。
结果
3.3 菌株的生理生化鉴定
3.3。1 菌落的特征分析
通过显微镜观察菌落形态特征，结果见表3。
表3 拮抗细菌K1、K2与K3的菌落特征
菌株K1K2K3
形状椭圆状圆形杆状革兰氏染色阴性阴性阴性
芽孢无无无
菌落形态椭圆形圆形梅花形
菌落颜色乳白浅黄棕黄
菌落隆起度凸起凸起凸起
K2
菌落边缘形状 光滑 光滑 粗糙 菌落表面状态 光滑 光滑 光滑 菌落光泽 有光泽 有光泽 无光泽 菌落干湿程度 干燥 湿润 干燥 菌落透明程度
不透明
不透明
不透明
3。3.2 菌株的生理生化鉴定
糖类分解试验 V-P 试验 甲基红试验
硝酸盐还原试验 淀粉水解试验
吲哚（靛基质）试验 柠檬酸盐利用试验
接触酶试验 图3 拮抗细菌K1、K2与K3的生理生化特征
表４ 细菌的生理生化鉴定结果
K1K2
K1K1K1K1
K1
K1K1K2K2
K2K2K2K2K2
K3K3K3
K3K3K3K3
菌种K1 K2 K3
糖类分解试验＋－＋
V—P试验＋＋＋
甲基红试验－－－
硝酸盐还原试验＋＋＋
淀粉水解试验＋＋＋吲哚（靛基质）试验＋＋＋
柠檬酸盐利用试验－＋＋
接触酶试验＋＋＋注：“＋”表示阳性，“－"表示阴性，由于糖类分解试验都没有产生气泡，所以这里显示的是能否产酸。
根据细菌的菌落形态及生理生化特征，再参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步推测K1为土壤杆菌属，K2为固氮菌属，K3为动胶菌属.如若准确判断，还需进行16S rDNA序列测定。
细菌的生理生化鉴定原理 细菌的生理生化鉴定原理是通过研究细菌在生理和生化特性上的表现来确定其种属和特征。这种鉴定方法是通过对细菌的形态学、生长特性、代谢能力和化学成分进行综合分析来实现的。 细菌的形态学特征是鉴定的首要依据之一。形态学特征包括细菌的大小、形状、结构和染色性质等方面。比如，革兰氏染色能够将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类，从而提供了重要的区分依据。此外，细菌的胞外结构如菌落形态、胶囊、鞭毛和纤毛等也是鉴定的重要特征。 生长特性也是细菌鉴定的重要方面。不同细菌对于温度、pH值、氧气需求和营养要求等环境条件的适应性不同，这些特征可以用来筛选并确认细菌的种属。比如，某些细菌能够在高温环境下繁殖，而对于大多数细菌来说则无法生长。此外，细菌在不同培养基上的生长特性也可以作为鉴定的参考依据。 代谢能力是细菌鉴定的重要标志之一。不同细菌具有不同的代谢特点，通过研究其对特定底物的利用能力和生成产物的特征可以推断细菌的种属和特征。鉴定方法包括对特定酶活性的检测以及特定代谢产物的分析等。 化学成分也为细菌的鉴定提供了重要线索。细菌的化学成分主要包括细胞壁、细胞膜和核酸等。比如，细菌的细胞壁成分可以通过特定染色方法进行检测，如革兰氏染色可以判断细菌是否具有胞壁，并进一步分析细菌的细胞壁组分。此外，
核酸序列分析技术如16S rRNA测序可以用于细菌鉴定，通过比对细菌的核酸序列与数据库中的已知细菌进行比对，可以确定细菌的种属和基因亲缘关系。 细菌的生理生化鉴定方法是综合分析多个指标和依据，通过不同特征之间的关联和差异来进行细菌的分类鉴定。常用的鉴定方法包括传统的生理生化试验、分子生物学技术以及基于质谱和光谱的分析方法等。这些方法在细菌鉴定研究中发挥了非常重要的作用，为医学、环境科学和生物工程等领域的研究提供了有效的工具和基础。
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告 一、引言 在微生物学中，鉴定细菌的方法有很多种，其中生理生化反应实验是最常用的一种方法之一。生理生化反应实验可以通过观察细菌对不同物质的代谢情况来确定其种类和特性。本报告将介绍细菌鉴定中常用的生理生化反应实验。 二、目的 本报告旨在介绍常用的生理生化反应实验，包括试剂、操作步骤、结果解释等内容，以帮助读者更好地了解和掌握这些实验。 三、材料与方法 1. 大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）培养基； 2. 硝酸盐还原试剂； 3. 糖类试剂：葡萄糖、果糖、半乳糖； 4. 氨基酸试剂：天冬氨酸、赖氨酸； 5. 酶试剂：淀粉酶、蛋白酶； 6. 无水硫酸铜溶液。 四、实验步骤及结果解释
1. 硝酸盐还原试验 步骤： （1）取一支细菌液体培养物，加入硝酸盐还原试剂； （2）观察液体颜色变化。 结果解释： 若液体变为红色，则表示细菌能够还原硝酸盐为亚硝酸盐，是亚硝化菌。若无颜色变化，则表示细菌不能还原硝酸盐。 2. 糖类代谢试验 步骤： （1）取三个试管，分别加入葡萄糖、果糖、半乳糖； （2）加入相同量的细菌液体培养物； （3）观察试管内气泡产生情况。 结果解释： 若在葡萄糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用葡萄糖进行发酵代谢；若在果糖或半乳糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用果糖或半乳糖进行发酵代谢。 3. 氨基酸代谢试验 步骤： （1）取两个试管，分别加入天冬氨酸和赖氨酸； （2）加入相同量的细菌液体培养物； （3）观察试管内气泡产生情况。
结果解释： 若在天冬氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用天冬氨酸进行代谢；若在赖氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用赖氨酸进行代谢。 4. 酶代谢试验 步骤： （1）取两个试管，分别加入淀粉和蛋白质； （2）加入相同量的细菌液体培养物； （3）观察试管内颜色变化情况。 结果解释： 若在淀粉试管内出现了透明带，则表示该细菌能够分泌淀粉酶；若在蛋白质试管内出现了变色，则表示该细菌能够分泌蛋白酶。 5. 硫代硫酸盐还原试验 步骤： （1）取一支细菌液体培养物，加入无水硫酸铜溶液； （2）观察液体颜色变化。 结果解释： 若液体变为黑色，则表示该细菌能够将硫代硫酸盐还原为硫化物。 五、结论 通过以上实验，可以初步鉴定出细菌的种类和特性。在实际应用中，
方法 2.3。5 细菌的生理生化鉴定 １、形态学观察 采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏染色进行油镜观察。 ① 革兰氏染色 溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95％乙醇，番红复染液等. 试验步骤：（1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。 (2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。 （3）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。 (4）脱色：在上述涂片上流加95％乙醇溶液（一般20~30s）,当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。 （5）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min,水洗,用吸水纸吸去残水晾干。 (6）镜检：用油镜观察。 ②芽孢染色 （1）制片:按常规方法涂片、干燥及固定。 （2）加热染色：向载玻片滴加数滴5％孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min,加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸. 脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色. (3）复染：用0.5％番红水溶液复染2min。 (4) 水洗:用缓流自来水冲洗至无色。 (5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。
③鞭毛染色(硝酸银染色法） (1) 载玻片准备:将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸 20min，然后用清水充分洗净,再置于 95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。 (2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。 （3) 制片:取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片,使菌悬液流向另一边,用吸水纸吸取多余的菌悬液,自然干燥。 （4）染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色,鞭毛显褐色。 （5）镜检：用油镜镜检观察。 A、B液需现用现配（4h内效果最佳，1d内可用): A：单宁酸5ｇ,三氯化铁1.5ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15％甲醛2mL. B：硝酸银粉末2ｇ,水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用,往90mL溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴至出现薄雾。 ２、糖类分解试验 配方：蛋白胨 1。0ｇ；NaCl 0。5ｇ；0。2％溴百里香酚兰 1。2mL;葡萄糖 1.0ｇ；蒸馏水 100mL。 基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二氧化碳等)。当发酵产酸是，指示剂可有紫色(pH6。8)转变为黄色（pH5。2).气体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。 试验步骤:用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的编号。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行,可留一个空白，作为对照。在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡.再将将上述已接种的和对照管置37℃温室中培
微生物的鉴定方法 微生物是一类广泛存在于各种环境中的生物，包括细菌、真菌、病毒等。通常情况下，鉴定微生物首先需要通过一系列的实验室技术和方法进行，以便确定其种类和特征。下面将介绍一些常用的微生物鉴定方法。 一、形态学鉴定法： 形态学是鉴定微生物的基础方法之一、通过观察微生物的形态特征， 可以初步判断其种类。细菌通常可以通过对菌落形状、色素、大小、边缘、透明度等进行观察和比较，以确定其菌属；真菌则可以通过判断菌落的形状、颜色、质地等特征，以及孢子形态和产孢器的形式来进行鉴定。 二、生理生化鉴定法： 生理生化鉴定是通过测试微生物在培养基上的生理和生化特征来确定 其种属。这些特征包括生长条件（如温度、pH值）、营养需求（如对碳源、氮源的利用）、代谢产物（如气体产物和酸碱指数）等。通过对微生 物的这些表现进行定性、定量和定位观察，可以推断其种属。 三、分子生物学鉴定法： 随着分子生物学技术的快速发展，分子鉴定已成为现代微生物学中重 要的鉴定方法之一、其中，16SrRNA基因序列分析是最常用的鉴定细菌的 分子生物学方法。通过从微生物中提取总RNA，然后使用聚合酶链反应（PCR）扩增16SrRNA基因，在测序后与数据库进行比对，可以准确地鉴 定细菌的种类。对于真菌的鉴定，通常使用ITS区域（内转录间隔序列） 进行分析。 四、免疫学鉴定法：
免疫学鉴定法是通过检测微生物的免疫特异性反应来进行鉴定。具体方法包括免疫荧光检测、酶联免疫吸附试验（ELISA）、凝集反应和免疫印迹等。这些方法可以检测微生物中的抗原和抗体，并通过与特异性抗体的结合来确认微生物的种属。 五、基因测序鉴定法： 随着测序技术的迅速发展，基因测序已经成为鉴定微生物的重要手段之一、通过对微生物基因组的整个或部分DNA序列进行测序分析，可以确定微生物的种属。目前，全基因组测序、宏基因组测序、特定基因测序等方法已经成为微生物鉴定常用的手段。 综上所述，微生物的鉴定方法包括形态学鉴定法、生理生化鉴定法、分子生物学鉴定法、免疫学鉴定法和基因测序鉴定法等。通过这些方法的综合应用，可以对微生物进行准确、迅速的鉴定，从而为微生物分类学和微生物学研究提供有力的支持。
细菌常见的生化反应试验 （一）什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。 生化试验或称生化反应：细菌的酶不完全相同，对营养物质的分解能力不一致，因此其代谢产物各异。在培养基中加入可与被测终产物反应的指示剂，产生肉眼可见的变化，如颜色的改变等，利用生化方法来鉴定细菌的试验，统称为细菌的生化试验或称生化反应 （二）生化试验的方法： 1在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。 2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
（三）生化试验的注意事项 1.待检菌应是新鲜培养物，培养18~24h。 2.待检菌应是纯种培养物。 3.遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48 小时。 4.应做必要的对照试验。 5.提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进 行试验。 （四）检验细菌的生化试验范围 :1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验 二、糖醇类代谢试验 （一）糖醇类发酵试验 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验 （四）甲基红（Methyl Red）试验MR
（五）七叶苷水解试验（六）甘油品红试验（一）糖醇类发酵试验 1、原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖(醇)，有的只能分解1~2种糖(醇) ，有的分解糖(醇)能产酸产气，有的分解糖(醇)只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。 常用的糖醇 单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇 2试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。 3、结果观察和记录： •产酸产气，阳性，以“⊕”表示
细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程 1、氧化-发酵试验（O-F试验） 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。可以进行无氧降解的，称为发酵型（发酵型细菌在有氧无氧的条件下均能分解葡萄糖）。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 方法：将待检细菌同时穿刺接种两支Hugh-Leifson 培养基，其中一支培养基滴加无菌石蜡（或其它矿物油），高度不少于lcm。35C, 24小时或更长。 结果：培养基变黄表示细菌分解葡萄糖产酸，两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均均产酸为发酵型。若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。 应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵细菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者均为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌问的鉴别。 2、B -半乳糖苷酶（ONPG）试验 原理：细菌产生半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚卩-D- 半乳糖苷（无色）生成邻-硝基酚（黄色）。 结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20-30 分钟内显色 应用：主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
3、七叶苷水解试验原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物。 结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于D 群链球菌与其它链球菌的鉴别。前者为阳性，后者为阴性。也可用于革兰阴性菌与厌氧菌的鉴别。 4．甲基红试验原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH 值降至4.5 以下，加入甲基红呈现红色为阳性。若细菌分解葡萄糖产生的酸少，或产生的酸进一步转化为其他产物，则培养基pH 值仍在6.2 以上，加入甲基红呈现黄色为阴性。 结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性。黄色为阴性。 应用：主要用于鉴别大肠杆菌与产气杆菌，前者阳性，后者阴性。此外肠杆菌科中变形杆菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属和志贺菌属等阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。 5、VP 试验原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，氧化为二乙酰，与精氨酸中的胍基作用生成红色化合物。 结果：在数分钟内出现红色为阳性，如无红色出现且
细菌生化鉴定检验 细菌在新陈代谢过程中进行着各种生物化学反应，由于细菌所具有的酶系不尽相同，对 底物的分解能力也不一样，因而其代谢产物也不同。用生物化学方法检测这些代谢产物，可 帮助鉴定细菌，这种生化反应测定方法称为细菌的生化试验。在临床细菌检验工作中,除根据 细菌的形态与染色及培养特性对细菌进行初步鉴定外，还往往利用细菌的生化试验进行进一 步的鉴定，细菌的生化试验对绝大多数分离的未知菌属(或种)的鉴定具有重要作用。因此， 掌握细菌生化反应的原理、方法及应用，对于鉴定和鉴别细菌具有重要意义。 细菌的生化试验的基本方法是，将已分离纯化的待检细菌，接种到含有特殊物质和指示 剂的鉴别培养基中，通过观察细菌在培养基内的pH值变化，或是否产生某种特殊的代谢产物，来判断细菌的生化反应结果。 1 糖(醇、苷)类发酵试验 1.1原理：由于各种细菌含有发酵不同糖(醇、苷)类的酶，故对糖的分解能力及分解糖产生的终末产物各不相同，如有的能分解糖类产酸、产气，有的仅产酸，有的不能分解糖。故 可利用此特点以鉴别细菌。 1.2方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到含有指示剂的糖(醇、苷)类发酵培养基中，35℃恒温箱培养18～24 h观察结果。若用微量发酵管，或培养时间较长，应注意保持湿度，以免培养基干燥。 1.3结果：接种的细菌，若能分解培养基中的糖(醇、苷)类，则培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气.则可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，可使固体培养基内有 裂隙等现象。若不分解培养基中的糖(醇、苷)类，则培养基中除有细菌生长外，无其他变化。 1.4应用：发酵试验是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤 为重要。 2 葡萄糖氧化／发酵试验 2.1原理：根据细菌在分解葡萄糖的代谢过程中对氧需求的不同，将细菌分为氧化型、 发酵型和产碱型三类。细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有氧参加的，称为氧化型。氧化型 细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称 为发酵型。发酵型细菌无论是在有氧环境还是在无氧环境都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的 细菌称为产碱型。葡萄糖氧化／发酵试验亦称为O／F试验或Hugh－Leifson(HL)试验，利用 此试验可区分细菌的代谢类型。 2.2方法：取2支Hugh－Leifson(HL)葡萄糖培养基，置沸水中水浴10 min以驱逐培养基 中的氧气，冷却后，将待检菌同时接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石 蜡(或其他矿物油)，使培养基与空气隔绝。另一支不加液体石蜡，培养基暴露于空气中。将 培养基于35℃培养18～24 h。 2.3结果：两支培养基均无变化，为产碱型；两支培养基均产酸(变黄)，为发酵型；加液体石蜡的培养基不产酸，不加液体石蜡的培养基产酸，为氧化型。 2.4应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为 氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌之间的鉴别。 3 伏普试验
菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑 实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验 一、实验目的： 1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定lopat实验方法 二、实验材料： 猕猴桃溃疡病病原菌（分类地位薄壁菌门Gracilicutes，Proteobacteria纲假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas）、SPA培养基：蔗糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml 对照SPA培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml Thornley培养基配方：蛋白胨1g，精氨酸10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，琼脂6g，蒸馏水1000ml 1%二甲基对苯二胺盐酸盐，3×108 /ml的菌液（病原菌），烟草，马铃薯； 灭菌培养皿及培养基（平板）110套、未灭菌培养皿110套，接种针15个，试管110支，接种针55把，滤纸55张，试剂瓶55个，胶头滴管55支，喷壶55个 三、试验方法： 果聚糖试验（Levan formation）： 用细菌悬浮液，在SPA培养基上，再用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。 在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。 氧化酶试验（oxidase reaction）： 在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。 在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应 氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶 马铃薯软腐试验（potato erroring capacity）： 在马铃薯上做刺伤伤口，将细菌接到伤口上，几天后观察，是否出现软腐。 精氨酸双水解酶检验（argine reaction）： 配制Thornley培养基。每试管装3–4 ml培养基灭菌，冷却，针刺接种细菌至培养基底部，立即用凡士林封管，在27℃条件下培养7 d。 在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。 细菌的精氨酸双水解作用是将精氨酸经过两步水解，生成有机胺和无机氨。鉴定细菌的精氨酸试验，无论发酵菌还是非发酵菌，革兰阳性菌还是革兰阴性菌，测的都是精氨酸双水解酶，使用脱羧酶试验培养基。所以，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶用同一种基础培养基，为Moeller配方或Falkow配方，均须加盖石蜡油。对于发酵菌，细菌生长后，培养基变黄为阴性，变紫为阳性；对非发酵菌，培养基颜色不变为阴性，变黄为阳性。另有一种精氨酸双水解酶专用培养基，其中使用的是酚红指示剂。这种配方目前已不使用。细菌生化反应表中的精氨酸双水解酶的阳性百分率也不是在这种培养基上做的，所以，该配方实际已淘汰。 烟草过敏性反应（tobacoo hypersensitivity）：
微生物鉴定之生化实验大全 不同的细菌具有各自的独特的酶系统，因而对底物的分解力量各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。把握各种生 化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。生理生化特性的测定主要 依据Shirling Gottlieb《InternationalJournal of Systematic Bacteriology》中鉴定的有关试验。 （一）碳水化合物代谢试验 糖（醇、苷）类发酵试验 （1）原理： 细菌分解糖的力量与该菌是否含有分解某种糖的酶亲密相关，故 分解糖的力量各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不全都，在含 糖培育基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培育 基颜色转变，从而推断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物 （2）基本培育基： 在培育基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇 类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等）。培育基可为液体、 半固体、固体或微量生化管几种类型。 （3）试验方法：
取某一种细菌的24h纯培育物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培育基内，37℃培育24h，观看结果并记录。 （4）结果判定： 假如接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可产酸，使培育基由 紫色变成黄色，假如不发酵，则仍保持紫色。如，发酵的同时又产 生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。 （5）应用： 是鉴定细菌最主要最基本的试验，特殊是对肠杆菌科细菌的鉴定 尤为重要。 氧化型与发酵型(O/F)的测定 （1）原理： 细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参与的，称为氧化型， 细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。 发酵型细菌无论在有氧或者无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解 葡萄糖的细菌称为产碱型。这在区分微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科 成员中尤其有意义。 （2）培育基： 培育基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼 脂3g，1％溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼 脂和水混合，加热溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，
常见细菌系统鉴定手册（完整版） 引言 细菌是一类微生物，其广泛存在于自然界中的各种环境中，包括土壤、水体、空气和生物体内等。它们的存在对于生态系统的平衡和人类的健康具有重要影响。准确鉴定细菌的种类和特性对于科学研究、临床诊断和环境保护具有重要意义。本文档为常见细菌系统鉴定手册，旨在帮助用户了解并进行常见细菌的鉴定工作。 目录 1.细菌的形态特征 2.细菌的生理特性 3.细菌的遗传特性 4.常见细菌的鉴定方法 –接种和培养方法 –生物化学试验
–分子生物学方法 –其他鉴定方法 5.常见细菌的鉴定实例 6.细菌鉴定的注意事项 7.总结 细菌的形态特征 在鉴定细菌时，首先需要观察和描述细菌的形态特征。细菌的形态特征包括形状、大小、颜色、表面特征等。常见的细菌形状有球菌、杆菌、弧菌、螺旋菌等。细菌的大小通常以直径或长度来描述，颜色可以是透明、白色、黄色、红色等。表面特征是指细菌菌落的形状、质地和触感等。 细菌的生理特性 细菌的生理特性是指其在生长和代谢方面的特点。需要关注的生理特性有气体需求、温度和pH值的适宜范围、营养要求等。例如，一些细菌需要氧气进行呼吸，被称为好氧菌；一些细菌则无需氧气，甚至不能在氧气存在下生长，被称为厌氧菌。
细菌的遗传特性 细菌的遗传特性对鉴定和分类细菌起着重要作用。细菌的遗传物质主要是DNA，其通过突变和基因重组等方式进行遗传。常见的细菌分类方法包括16S rRNA基因序列比对、DNA 指纹图谱分析等。 常见细菌的鉴定方法 接种和培养方法 接种和培养是最常用的细菌鉴定方法之一。主要步骤包括样品的采集、接种培养基、温度和时间的控制等。常用的培养基有肉汤、琼脂和MacConkey琼脂等。接种后，细菌会在培养基上生长形成菌落，通过观察菌落形态和特性可以初步判断细菌的类型。 生物化学试验 生物化学试验是通过检测细菌在特定条件下的代谢产物来鉴定细菌。常见的生物化学试验包括氧化-发酵试验、酸碱反应试验和酶活性检测等。通过观察试验结果，可以确定细菌的代谢方式和特性。
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告 背景 细菌鉴定是微生物学中的一项重要任务，通过对细菌的形态、生理特征和生化反应进行分析，可以确定细菌的种属和特性。生理生化反应实验是其中的关键步骤，通过观察细菌对不同物质的代谢情况，可以获取有关其代谢能力、营养需求和产物生成等信息。本报告旨在介绍常用的细菌生理生化反应实验方法，并分析实验结果以提供准确的鉴定和分类建议。 分析 1. 嗜热/嗜冷性 嗜热/嗜冷性是指细菌对温度的适应能力。常用实验方法包括在不同温度条件下进 行培养观察，并记录生长情况。根据结果可将细菌分为嗜热菌（适宜高温）、嗜冷菌（适宜低温）或中温菌（适宜中等温度）。 2. 好氧/厌氧性 好氧/厌氧性是指细菌对氧气需求的差异。常用实验方法包括在含氧和不含氧的培 养条件下观察细菌生长情况。根据结果可将细菌分为好氧菌（需氧）、厌氧菌（不需氧）或兼性厌氧菌（能在有或无氧的条件下生长）。 3. 革兰氏染色 革兰氏染色是观察细菌壁结构的常用方法。该实验通过处理细菌样品，并使用革兰染色剂将其染色，然后观察其颜色变化。根据结果可将细菌分为革兰阳性（蓝紫色）或革兰阴性（红粉色）。 4. 淀粉酶活性 淀粉酶活性实验用于检测细菌对淀粉的降解能力。该实验将待测细菌培养于含淀粉的琼脂平板上，经过一段时间后，用碘液滴定并观察是否出现透明圈。透明圈表示淀粉被降解且产生了淀粉酶。 5. 水解酪蛋白活性 水解酪蛋白活性实验用于检测细菌对酪蛋白的降解能力。该实验将待测细菌培养于含酪蛋白的琼脂平板上，经过一段时间后，用盖有硫酸铜的试管放置在平板上，观察是否出现由蓝色转变为紫色的反应。颜色变化表示细菌产生了水解酪蛋白酶。
微生物实验室的菌种鉴定 微生物检验过程中检出的微生物应该进行微生物鉴定，虽然药典里明确了鉴定到什么水平的标准和一些基础内容操作方法。但是因为实验室能力有限，很多实验室要么消极抵抗要么稀里糊涂的要么完全委外。 其实我们一般微生物实验室自己还是可以做一些工作，特别是细菌的鉴定。再就是菌种鉴定时，不是直接拿来就鉴定，需要一些预先做一些处理或判断。现将一些基础知识进行总结如下： 一、相关定义 1、生理生化鉴定：根据微生物对各种生理条件（温度、pH、氧气、渗透压）、生化指标（唯一碳氮源、抗生素、酶、盐碱性）代谢反应进行分析，并将结果转化成软件可以识别的数据，进行聚类分析，与已知的参比菌株数据库进行比较，最终对未知菌进行鉴定的一种技术。 2、革兰氏染色：系细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。 3、平板划线法：系指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。 4、氧化酶试验：氧化酶不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜
色反应而进行的试验，用于区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性）和肠道菌（氧化酶阴性）。 5、触酶试验：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌属阴性，故常用此试验来鉴定，用于区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性）和链球菌(过氧化氢酶阴性）。 6、凝固酶试验：用于区分凝固酶阴性葡萄球菌（可推测为非致病性）和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病性）。 二、工作程序 1、微生物鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时一般先将待检菌进行初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需要达到的鉴定水平选择鉴定方法。目前实验室室进行表型微生物鉴定后可以用API试剂条进行或其他等效的试剂条进行菌种鉴定，如API试剂条鉴定不能满足要求时采取委外鉴定。 注：为了控制成本，可以自己进行鉴定，不具备能力时再委外。API 鉴定用的试剂条的效期有限，需要注意效期或跟供应商做好沟通备货。 1.1待检菌的分离与纯化 微生物鉴定的第一步是待检培养物的分离纯化，最常用的分离纯化方法是挑去待检菌的纯培养物（单个菌落），必要时可进一步进行纯培
大肠杆菌的鉴定方法 大肠杆菌是常见的肠道细菌，广泛存在于自然环境中，包括土壤、水 体和动植物体内。它是引起人类肠道感染和食源性疾病的重要致病菌之一、准确鉴定大肠杆菌的方法对于食品安全和公共卫生至关重要。下面将介绍 常见的大肠杆菌鉴定方法。 1.外观和生理鉴定 大肠杆菌形态特征为革兰阴性，为短杆状细菌，常产生单一或双子。 在艾柯培养基上，大肠杆菌形成典型的金黄色、大且圆形的菌落，使用其 可以初步鉴定大肠杆菌。 大肠杆菌是革兰阴性细菌，可以通过革兰氏染色进行鉴定。大肠杆菌 的细胞壁含有脂多糖，染色后呈现红色。 2.纯培养和典型菌落的选择 将样品接种于含有葡萄糖和肉汤的液体营养培养基中，经过16-24小 时的培养后，利用墨汁培养基将菌液分带于增菌板表面，进行分离纯化。 然后选择培养在巴斯德固体琼脂培养基上呈金黄色，并有金属光泽的典型 菌落。 3.酶活性测试 大肠杆菌具有多种酶活性，常用的酶活性测试有氧化/发酵测试、甲 基红松解试验和呈色反应等。 （1）氧化/发酵测试：大肠杆菌通常以无氧产酸为代谢途径进行葡萄 糖发酵。将菌液接种于以葡萄糖为唯一碳源的气泡管中，通过产酸后的颜
色变化来鉴定大肠杆菌。气泡管中产生黄色的酸性底部，说明转化为酸性，即为大肠杆菌。 （2）甲基红松解试验：大肠杆菌代谢糖酸，产生酸性代谢产物，导 致菌落周围的甲基红转为黄色。通过添加甲基红指示剂，观察溶解指示剂 颜色的变化，由红色转为黄色可以初步鉴定大肠杆菌。 （3）呈色反应：大肠杆菌产生酶活性，能够将一些酶底物转化为有 颜色的产物。例如，大肠杆菌在聚糖中生成酶胆红素琼脂糖，呈现金黄色。这种特征可以用于大肠杆菌的鉴定。 4.生化和生理特性鉴定 （1）靛酚蓝糖蛋白胱氨酸琼脂糖（Ipv）试验：肠道杆菌能产生硫化氢，将外源底物半胱氨酸转化为硫化氢，使琼脂糖中的靛酚蓝变为铁蓝色，可以通过这个试验鉴定大肠杆菌。 （2）铁蛋白试验：大肠杆菌可以利用铁蛋白作为唯一的铁源进行生长，将铁蛋白分解为铁和胆红素，使培养基呈现深绿色，可通过这个试验 鉴定大肠杆菌。 （3）羧甲基红松解试验：羧甲基红和酱油酸钠与菌液混合反应后， 在酸性条件下，产生红色，可通过检测产物的颜色来鉴定大肠杆菌。 上述的鉴定方法是大肠杆菌的常见方法之一，但仍需要结合其他鉴定 手段进行综合判断，以确保准确鉴定。例如，分子生物学方法如PCR和测 序可以用于检测大肠杆菌的DNA序列，并与已知的大肠杆菌序列进行比对。这些方法对于大肠杆菌的准确鉴定至关重要，尤其是在食品安全和公共卫 生领域。
1、氧化酶巴氏杆菌 1、原理： 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。 2、试剂 盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。 3、方法 在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔，涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计，按阴性处理。 4、注意事项： a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。 b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。 c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。 2、苯丙氨酸脱氨酶变形杆菌 1、原理： 某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。 2、培养基 酵母膏3g NaCl 5g Na2HPO4 1g DL-苯丙氨酸2g (或L-苯丙氨酸) 1g 蒸馏水1000 ml pH为7.0，分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面。
3、试剂 10%(W/V)的FeCl3溶液 4、方法 适当浓度接种，37℃培养4h或8~24h测定。将试剂4~5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明己形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。 3、H2S(TSI) 变形杆菌鸡白痢沙门氏 1、原理： 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 2、培养基： 牛肉膏7.5g 蛋白胨10g NaCl 5g 明胶100~120g(或琼脂15g) 10%FeCl2 (培养基灭菌后无菌加入) 5 ml 蒸馏水1000 ml pH 7.0，112℃灭菌20min 在明胶培养基尚未凝固时，加入新制备的过滤灭菌的FeCl2，用无菌试管分装，培养基高度约为4~5 cm，立即置冷水冷却凝固。 3、方法 用穿刺法接种，30℃培养，1、3、7天，观察，变黑者为阳性，不变为阴性。 4、注意事项 ①此方法适用于肠杆菌科细菌鉴定 ②在实验过程中可用硫酸亚铁代替氯化亚铁 ③可同时测定明胶液化，20℃培养 4、DNA酶金黄色葡萄球菌 1、培养基 酪朊水解物15g 大豆蛋白胨5g NaCl 5g DNA 2g 甲苯胺蓝0.1g 琼脂15g 蒸馏水1000 ml
实验五细菌鉴定中常见的生理生化反应 一、实验目的。 1)了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。 2)了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。 3)了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 二、实验原理。 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。 1.糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫，pH5.2黄色—pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。 2.甲基红试验（M.R试验） 甲基红试验，pH4.4红色～pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。 3.Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P. 试验） 伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P.反应阳性。 4.靛基质试验 某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。 5.硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。 6.明胶液化实验 明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4 度仍能保持液化状态。 7.柠檬酸盐利用试验 有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂 pH6.0(黄)～7.6(蓝)，由绿色变为深蓝色。 8.淀粉水解实验 细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 三、实验仪器、材料和用具
实验九细菌的生化鉴定 一、实验目的 1、了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反 应的测定方法； 2、掌握糖发酵试验、淀粉实验、呻噪实验、M.R.及V.P的原理、方 法及相应培养基的制备方法。 3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意 义； 4、掌握以上实验的用途。 二、实验原理 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物特性，这种差异就表现得更加明显。不同细菌具有不同的酶系统，故不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，它们对物质的代谢谱和分解产物也就不同，细菌的这种代谢特点可供鉴别细菌之用。 用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应，其在菌株的分类鉴定中具有主要意义。 1、糖发酵实验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的
产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定在配制培养基时预先加 入溟甲酚紫［PHS.2（黄色）一6.8（紫色）］,当发酵产酸时, 可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。发酵后产生的有机酸：乳酸、醋酸、丙酸等（澳甲酚紫变色范围pH5.2~6.8,pH<5.2黄色，pH>6.8紫色）；发酵后产生的气体：甲烷、氢、二氧化碳等（杜氏小管内有气泡，产气漂浮）。2、M.R.及V.P实验很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产 生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下，这时若加甲基红指 示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4.4（红色）-pH6.2（黄色）。 若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产 生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH仍 在6.2以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。甲基红试验是用来检测由 葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代 谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色变为 红色。VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的 能力，如丙酮酸。丙酮酸经缩合、脱竣后生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性 条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白月东中精氨酸的服基作 用，生成红色化合物。 3、呻噪实验 呻噪试验是用来检测呻噪的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白 月东中的色氨酸产生呻噪和丙酮酸。呻噪与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红 色的玫瑰呻噪。 4、淀粉水解实验 微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞
竭诚为您提供优质文档/双击可除细菌的生理生化鉴定 篇一：细菌生理生化鉴定 实验九细菌的生理生化试验[日期：20XX-5-30]来源：作者：孔庆学[字体：大中 小] 实验九细菌的生理生化试验 1目的 1.1了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理 1.2掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法 2原理 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种 差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以 其发酵的类型和产物也不相同，也就是说
，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。 3材料 3.1菌种 大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、产气肠杆菌（enterobacteraerogenes）、普通变形杆菌（proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）的斜面菌种 3.2培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖） 3.3试剂 40％naoh溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。 3.4器具 超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。 4流程 糖发酵试验→V-p试验→甲基红试验→吲哚试验 5步骤 (一)糖类发酵试验
1目的 了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法． 2原理 可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可 在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即b.c.p指示剂，其ph在5.2以下呈黄色，ph在 6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放 入倒置杜氏小管观察。 3材料 3.2菌种 大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、产气肠杆菌（enterobacteraerogenes）、普通变形杆菌（proteus vulgaris）的斜面菌种 3.３培养基 葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 ４流程 发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录 5步骤 5.1试管标记图9-1糖发酵产气