蛋白质的性质实验（一）
蛋白质及氨基酸的呈色反应
一、目的
1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应
（一）双缩脲反应
1．原理
尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有
一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团的物质以及
一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2．试剂
3．操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1mL，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加卵清蛋白溶液约1mL和10％氢氧化钠溶液约 2 mL，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。
（二）茚三酮反应
1．原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH
条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2．试剂
3．操作
（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液mL，再各加 0.5 mL 0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1～2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
（2）在一小块滤纸上滴一滴0.5％甘氨酸溶液，风干后再在原处滴一滴0.1％茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色观察紫红色斑点的出现。
（三）黄色反应
1．原理
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
2．试剂
（1）鸡蛋清溶液 100 mL
将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1∶20混匀，然后用6层纱布过滤。
（2）大豆提取液 100 mL
将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。
（3）头发
（4）指甲
（5）0.5％苯酚溶液 50mL
3．操作
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10％氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
（四）考马斯亮蓝反应
1．原理
考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
1.目的 掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。 2.原理 蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数，即为蛋白质含量。 3.试剂 3.1浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾，所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制 3.2混合指示液 1份（1g/L）甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚氯乙醇溶液临用时混合。 也可用2份甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.3氢氧化钠溶液（400g/L） 3.4标准滴定溶液 硫酸标准溶液［c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L］或盐酸标准溶液［c（HCl） 0.0500mol/L］ 3.5硼酸溶液（20g/L） 4.仪器 定氮蒸馏装置 5.样品 全蛋（2.47g） 6.操作 6.1样品处理 准确称取2—5g半固体样品，小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉上，小火加热，待内容物全部炭化后，泡沫完全消失后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色呈请透明后，再继续加热0.5h，取下放冷，慢慢加入20mL水。 放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。 6.2连接装置 装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及少量硫酸，以保持水呈酸性，加入数滴玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，
实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定 一、目的和要求 1.了解蛋白质的两性解离性质。 2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。 二、原理 蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。 在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。 三、试剂和器材 1.试剂 0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液； 0.04%溴甲酚绿指示剂； 0.02N盐酸； 0.1N醋酸溶液； 0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液； 0.02N氢氧化钠溶液 2.器材
试管及试管架；滴管；吸量管（ 1、5ml） 四、操作方法 1.蛋白质的两性反应 （1）取1支试管，加 0.5%酪蛋白溶液20滴和 0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。观察溶液呈观的颜色，并说明原因。 （2）用细滴管缓慢加入 0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH 接近与酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 （3）继续滴入 0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。 （4）再滴入 0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。 继续滴入 0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？ 2.酪蛋白等电点的测定 （1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。 加入每种试剂后应混合均匀。 试管编号9
蛋白质测定实验报告标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述： 1 材料与方法 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,
蛋白质的性质实验（二） 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、蛋白质等电点的测定 1．目的 （1）了解蛋白质的两性解离性质。 （2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2．原理 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸和醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3．器材 4．试剂 （1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 200mL 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200 mL锥形瓶内，用少量40～50 ℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10 mL1 mol／L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至 100 mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 5．操作 （1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4 管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。 二、蛋白质的沉淀及变性 1．目的 （1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 （2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 （3）了解蛋白质变性和沉淀的关系。 2．原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶 体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀和凝固，蛋白质和重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号
华南农业大学实验报告 专业班次 13食工1班组别 题目蛋白质功能性质的检测姓名黄俊怡日期 一、实验目的 通过本实验定性地了解蛋白质的主要功能性质。 二、实验原理 蛋白质的功能性质一般是指能使蛋白质成为人们所需要的食品特征而具有的物理化学性质，即对食品的加工、贮藏、销售过程中发生作用的那些性质，这些性质对食品的质量和风味起着重要的作用。蛋白质的功能性质与蛋白质在食品体系中的用途有着十分密切的关系，是开发和有效利用蛋白质资源的重要依据。 蛋白质的功能性质可分为水化性质、表面性质、蛋白质-蛋白质相互作用的有关性质三个主要类型，主要包括有吸水性、溶解性、保水性、分散性、粘度和粘着性、乳化性、起泡性、凝胶作用等。 三、实验材料、试剂和仪器 1. 实验材料 （1）2%蛋清蛋白溶液：取2g蛋清加98ml蒸馏水稀释，过滤取清夜。 （2）卵黄蛋白：鸡蛋除蛋清后剩下的蛋黄捣碎。 2. 试剂 (1) 硫酸铵、饱和硫酸铵溶液 (2) 氯化钠、饱和氯化钠溶液 (3) 花生油 (4) 酒石酸 3. 仪器 (1) 刻度试管 (2) 100ml烧杯
(3) 冰箱 四、实验步骤 1. 蛋白质水溶性的测定 在10ml刻度试管中加入蛋清蛋白，加入5ml水，摇匀，观察其水溶性，有无沉淀产生。在溶液中逐滴加入饱和氯化钠溶液，摇匀，得到澄清的蛋白质的氯化钠溶液。 取上述蛋白质的氯化钠溶液3ml，加入3ml饱和硫酸铵溶液，观察球蛋白的沉淀析出，再加入粉末硫酸铵至饱和，摇匀，观察清蛋白从溶液中析出，解释蛋清蛋白质在水中及氯化钠溶液中的溶解度以及蛋白质沉淀的原因。 2. 蛋白质乳化性的测定 取卵黄蛋白于10ml刻度试管中，加入水和5滴花生油；另取5ml水于10ml刻度试管中，加入5滴花生油；再将两支试管用力振摇2~3min，然后将两支试管放在试管架上，每隔15min观察一次，共观察4次，观察油水是否分离。 3. 蛋白质起泡性的测定 (1) 在二个100ml的烧杯中，各加入2%的蛋清蛋白溶液30ml，一份用玻璃棒不断搅打1~2min；另一份用吸管不断吹入空气泡1~2min，观察泡沫的生成、泡沫的多少及泡沫稳定时间的长短。 (2) 在二支10ml刻度试管中，各加入2%的蛋清蛋白溶液5ml，一支放入冰箱中冷至10℃，另一支保持常温（30~35℃），以相同的方式振摇1~2min，观察泡沫产生的数量及泡沫稳定性有何不同。 (3) 在三支10ml刻度试管中，各加入2%的蛋清蛋白溶液5ml，其中一支试管加入酒石酸，一支加入氯化钠；另一支作对照用，以相同的方式振摇1~2min，观察泡沫的多少及泡沫稳定性有何不同。 4. 蛋白质凝胶作用的测定 在试管中加入1ml蛋清蛋白，再加1ml水和几滴饱和食盐水至溶解澄清，放入沸水中，加热片刻观察凝胶的形成。
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：
1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1～1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量
紫外分光光度法测定蛋白质含量 一、实验目的 1.学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理； 2.掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。 二、实验原理 1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等。本实验采用紫外分光光度法。 2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白质略有不同）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律。 利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。 三、仪器与试剂 TU―1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg·mL-1、0.9%NaCl 溶液、试样蛋白质溶液。 10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。 四、实验步骤 1.绘制吸收曲线 用吸量管吸取2mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在190~400nm间每隔5nm测一次吸光度Abs，记录数据并作图。 2.绘制标准曲线 用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长280nm处分别测其吸光度，记录数据并作图。 3.样品测定 取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长280nm处测其吸光度，重复三次。在已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363），估算浓度为2.0960 mg·mL-1，再将原试液稀释至5倍（即取2mL试液，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀），估算浓度为0.4192 mg·mL-1，测吸光度，重复三次 五、数据处理与结果分析
生物化学实验报告 姓名： XXX 学号： XXXXXXXXXX 专业年级： 2015级护理（助产）组别：第六实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 实验日期2016-10-18 实验地点第六实验室 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。 2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。 3、熟悉分光光度计的用法。 二、实验原理 1、在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。 2、蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。 3、在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。 三、材料与方法： 1.实验材料 （1）样品 健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L （2）试剂 牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）；碱性硫酸铜溶液（当日有效）；Folin-酚试剂（3）仪器与器材
V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架；坐标纸 2.实验步骤 流程图： （1）取6支试管做好标记，再按下表加样：（1作空白对照，2-5作标准试管，6为待测样品） 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白标准液- 0.20 0.40 0.60 0.80 - 样品液（稀释300倍）- - - - - 0.50 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.50 碱性硫酸铜 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Folin-酚试剂0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 蛋白质浓度（μg/ml）0 40 80 120 160 未知（2）往各试管中按表格要求加入蛋白标准液、样品液、蒸馏水及碱性硫酸铜试剂后，混匀室温静置10min。 （3）向各管内加入Folin-酚试剂0.20ml，并于2s内迅速摇匀。 （4）加样完毕后，将各试管进行40℃水浴10min。 （5）冷却至室温后，以500nm波长比色，以1号管作空白对照，按2-6顺序测定试管内溶液吸光度并重复测三次，记录数据并计算结果。
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定 一、实验目的与要求 1.掌握蛋白质的两性解离性质； 2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。 二、实验原理 蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。 在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。 三、实验材料、试剂与仪器 1.材料与试剂 NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。 0.5 %酪蛋白溶液： 0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入 0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~ 8.5）；
0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有 0.57mL 0.1mol/LNaOH的水中。该指示剂的变色范围是： 酸性（pH 3.8）为黄色，pH 5.4为蓝色； 0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可； 0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL； 0.1 mol/L的乙酸溶液： 将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL； 0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL； 1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。 2.仪器 试管、滴管、移液管、pH试纸等。 四、实验方法与步骤 1.蛋白质的两性反应 1）取一支干净的试管，加入20滴 0.5 %的酪蛋白溶液，逐滴加入 0.01 %的溴甲酚绿溶液（约5~7滴），充分混合，观察溶液的颜色并解释（蓝色）。
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量 一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
探究蛋白质的性质实验 一、实验目的 通过本实验定性地了解蛋白质的主要功能性质。 实验准备：鸡蛋白溶液的配制：把一只鸡蛋的两端各扎一个小孔。从上面的孔吹气，使鸡蛋白从下面的孔流入量筒中。取5毫升蛋白，放入烧杯中，加30毫升蒸馏水，即成1：6的鸡蛋白胶体溶液。 二、实验步骤与实验方法 （一）、蛋白质的盐析 实验用品：鸡蛋白溶液、饱和硫酸铵或硫酸钠溶液、试管、胶头滴管等。 实验方法： 1、取一只试管注入2毫升的鸡蛋白溶液，慢慢的沿着试管壁加入2~4毫升饱和硫酸铵溶液，便有乳白色的沉淀析出。（为什么？因为盐析作用）说明：向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，只种作用叫做盐析。 2、将2毫升的带沉淀的溶液加入6~8毫升的蒸馏水中，沉淀逐渐溶解，证明盐析是个可逆过程。 实验结论：盐析出的蛋白质仍然可以溶解在水中，说明蛋白质盐析后并不影响原来蛋白质的性质。 （二）蛋白质的变性 实验用品：鸡蛋白溶液、硫酸铜、甲醛、酒精灯、试管夹等 实验方法： 1、加热：取一只试管加入2毫升鸡蛋白，把试管放在酒精灯上加热，看到 的现象是蛋白质凝结。把凝结的蛋白质放入盛有蒸馏水的试管中，凝结 的蛋白不溶解。说明：蛋白质受热后会发生变性；受热作用下蛋白质的 变性是不可逆的。 2、加入重金属盐：取一只试管加入2毫升鸡蛋白，用滴管滴入重金属盐如 硫酸铜，试管中的蛋白质凝结。把凝结的蛋白质放入盛蒸馏水的试管中，凝结的蛋白质不溶解。说明：在重金属盐的作用下的蛋白质的变性是不 可逆的。 3、加入有机化合物：取一只试管加入2毫升鸡蛋白，用滴管加入2毫升的 甲醛溶液，看到的现象是试管中的蛋白质凝结。把凝结的蛋白质放入盛 蒸馏水的试管中，凝结的蛋白质不溶解。
蛋白质的性质实验（一） 蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、目的 1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应 （一）双缩脲反应 1．原理 尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有 一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH 或—CHOHCH2NH2等基团的物质以及 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 2．试剂 3．操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1mL，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 向另一试管加卵清蛋白溶液约1mL和10％氢氧化钠溶液约 2 mL，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 （二）茚三酮反应 1．原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。 该反应十分灵敏，1∶1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 此反应的适宜pH为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 2．试剂 3．操作 （1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液mL，再各加 0.5 mL 0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1～2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 （2）在一小块滤纸上滴一滴0.5％甘氨酸溶液，风干后再在原处滴一滴0.1％茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色观察紫红色斑点的出现。 （三）黄色反应 1．原理
蛋白质化学性质实验方案（草案） 一、实验目的：通过实验，使同学们直观的了解蛋白质的化学性质（以盐析、变性、颜色反应、灼烧气味为主要方面进行实验设计），并熟练掌握。 二、实验安全：对可能用到的酒精灯、重金属盐【主要为CuSO4、(CH3COO)2Pb】、强酸【主要为盐酸、浓硝酸】、强碱【主要为NaOH】、甲醛、乙酸、乙醇等仪器及药品要做到使用安全，保证无意外事故发生。重点为防烧伤、防中毒，并对有毒有害废液要环保无害化处理。 三、实验设计：本实验课共设计了五个实验，但考虑到时间关系，可进行筛选，以降低实验难度及所用时间。 1.蛋白质的盐析反应：分别向两支试管中加入约2mL鸡蛋白 溶液,向溶液中慢慢加入饱和的 2.蛋白质的变性反应： 3.蛋白质的颜色反应： 4.蛋白质的灼烧反应： 5.酶的高效催化反应： 四、课堂结构分析：本节课为学生实验课，目的为通过实验，使同学们直观的了解蛋白质的化学性质（以盐析、变性、颜色反应、灼烧气味为主要方面进行实验设计），并熟练掌握。故本节课结构如下：首先，由教师以板书（可由学生完
成，以锻炼学生写板书的能力）或PPT课件（可由学生完成）的形式向学生系统的介绍本节课所要进行的实验，使学生了解将要进行的实验，以熟悉实验操作及注意事项，以提高实验成功率（约15min）。随后进行学生分组实验，为保证实验安全及效果，可指定数名学生分组进行监测（不干涉该组实验）。同时教师进行同步实验，必要时进行技术指导。及学生整理实验台（15min~20min）。最后，由教师进行点评及总结，并布置作业（完成实验报告），（约5min~10min）。 五、应急预案：对一切可能出现的意外事故均应有完整的处置方案，以降低伤害程度。 1.火焰烧伤：迅速离开火源，并用大量清洁的冷水冲洗伤处持续10分钟以上，并适当处理，严重者应及时就医。 2.强酸烧伤：迅速用大量清洁的冷水冲洗伤处持续15分钟以上，并涂上5%的碳酸氢钠溶液，严重者应及时就医。 3.强碱烧伤：迅速用大量清洁的冷水冲洗伤处持续15分钟以上，并涂上3%的硼酸溶液，严重者应及时就医。 4.重金属盐中毒（重金属盐溶液溅到皮肤上）：迅速用大量清洁水冲洗被污染的皮肤，并涂上适量解毒剂，严重者应及时就医。 拟稿人：高二1班郑天浩 时间：2016年2月24日 21:20:00
【关键字】报告 酪蛋白粗提取实验报告 篇一：实验一蛋白质含量测定方法的研究 生物化学实验预习报告 实验一蛋白质含量测定方法的研究 一、研究背景 蛋白质含量的测定广泛应用于生产实践、医药卫生等各个领域，如测定牛奶等食品中蛋白质的含量作为其营养成分的参考值，测定病人尿液中蛋白质的含量以检测其是否患有某种疾病等，因而测定蛋白质的含量具有非常重要的意义。由于蛋白质本身具有一系列的特点（如具有等电点、富含有机氮、含有肽键、存在某些含共轭双键的氨基酸残基、可与某些染料结合等），利用它的这些特点可以通过特定的化学反应或者某些物理手段，将一定量的蛋白质转化为可以方便定量测定的其他量，从而达到测定蛋白质含量的目的。蛋白质诸多特点的存在决定了它会有不同的测定方法，同时由于多种非蛋白组分的存在和干扰以及各种方法本身的局限性（适用条件），每一种测定方法都有各自的优缺点，某一种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，所以多种测定方法的共存是有意义的。目前常用的蛋白质含量测定方法有四种：凯氏定氮法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法、紫外法，其中后三种方法最常用。在实际工作中，需要根据所测定对象的具体情况综合考虑各种因素(如实验器材的限制、实验所要求的灵敏度和精确度、所测定蛋白质的种类与性质、溶液中存在的干扰物质、测定所花费的时间等)，有选择性地使用某种方法。 二、研究目标 1.掌握常用的蛋白质含量测定方法的原理和操作流程；（基础目标） 2.了解不同测定方法的优点和局限性，掌握在实际工作中不同测定方法的选择条件；（基础目标） 3.证明非蛋白组分在蛋白质含量测定中存在干扰，并通过分析实验结果确定该干扰在实际工作中是否可以忽略。（高级目标） 三、研究策略 本实验最重要的目的是为了确定非蛋白组分在蛋白质含量测定中存在的干扰是否可以忽略。思路有两种：一种方法是先测定纯蛋白质溶液中蛋白质含量，随后在该溶液中加入非蛋白组分（如嘌呤、嘧啶等吸光物质，Ca2+等金属离子，无机酸或无机碱，甚至某些色素等），测定此时蛋白质含量，对比两次测定结果，计算相对误差，从而得出非蛋白组分的影响程度；另一种方法是直接使用天然的蛋白质粗提取物（含有非蛋白组分，并将其中包含的所有非蛋白组分看成一个影响因素），来测定粗提取物中的蛋白质含量。考虑到第一种方法中涉及到的非蛋白组分的加入量没有标准，这些非蛋白材料（影响因素）实验室内也不一定有，更重要的是该实验所具有的实际意义不大，故决定采用第二种方案。但是方案二所存在的一个问题是所测组分蛋白质含量的真实值未知，测得的结果没有可以参考比较的依据，所以需要另外找一个可以参考的标准。 所采取的策略是先用不同的方法测定已 知标准蛋白质溶液的浓度，三个测定值之间会有一定的相关性（或者说测定值之间的变化符
蛋白质浓度的测定 一．实验原理 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当他与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感性。 在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可用于蛋白质浓度的测定。 二．实验设备与试剂 设备：普通离心机，721型分光光度计 试剂：标准蛋白液（100ug/ml） 三．实验材料 新鲜绿豆芽 四．实验内容 1.标准曲线的制备 取9支干净的试管，按表进行编号并加入试剂。 2.样品蛋白的测定 （1）样品蛋白液制备 准确称取2g新鲜绿豆芽胚轴的部分，研磨成匀浆，离心分离（4000r/min,10min）。取上清液用0.9%nacl定容到10ml。 （2）含量测定 另取两只干净的试管，加入样品液0.1ml，0.9mlnacl和考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀。室温静置3min，与波长595nm处比色，读取吸光度。 五．实验结果 1.标准曲线 结果如表所示，并以吸光度为纵坐标，个标准液含量为横坐标做标准曲线。
2.样品蛋白含量的测定 样品蛋白的比色结果如表，根据直线方程求出每支试管中蛋白质含量。 根据公式求出样品绿豆芽蛋白质含量 样品蛋白的体积 蛋白质含量（ug/g鲜重）= 测定时取样的体积 称取样品的重量 六．结果与讨论 结果：绿豆芽蛋白质含量=1233.0ug/g 讨论： 1.试液为混合均与就取样 2.量取溶液时读数有误差 3.读取A值时有读数误差 4.比色杯中的误差
实验十六蛋白质含量的测定 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。 一、目的与要求： 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消 化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。 二、原理： 凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。 ( 1 ) 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2 (2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4 (3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O (4) (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 三、试剂与仪器： 1、硫酸钾 2、硫酸铜 3、硫酸 4、2％硼酸溶液 5、40％氢氧化钠溶液 6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成． 7、0.01mol/LHCL标准溶液或0．01mol/L硫酸标准溶液． 8、KDN-08A(04A)定氮仪 10、三角瓶250ml 3只。 11、量筒50ml、l0ml、l00ml。
微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告 一、实验目的 1.学习微量凯氏定氮法的原理 2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等） 二、实验原理 凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。 当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称为“消化”。 此过程进行的相对较为缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高溶液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。氧化剂过氧化氢也能加速反应。 消化过程： 4 24423)(2SO NH SO H NH →+3 22242NH O H SO CO SO H +++→+含氮有机物 蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热
蒸馏，即可释放出氨气。 反应方程式如下： OH NH SO N OH N SO NH 4424242a a 2)(+→+ 吸收与滴定：蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（即滴定至蓝紫色)，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。 324333BO H NH BO H NH →+ 334324BO H CL NH HCL BO H NH +←+ 三、实验试剂、材料和器材 实验材料：食用面粉。 实验试剂：浓硫酸、30%氢氧化钠溶液、克氏催化剂、2%硼酸、指示剂、0.01M HCL 。 实验器材：凯氏烧瓶、电炉、凯氏定氮蒸馏装置、锥形瓶、100ml 容量瓶、酸式滴定管。 四、操作步骤 1.消化 （1）准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上；
蛋白质的两性性质及等电点的测定 一实验目的 通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。 二实验原理 蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除末端a－氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a－羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。 R COOH N H3+ R COO N H3+ R COO H2N OH 在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。本实验采用酪蛋白在不同pH溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH值为该种蛋白质的等电点。 三实验设备 (1) 试管架1个 (2) 吸管1mL 2支；2mL 1支；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管2支 四实验试剂 （1）1mol/L醋酸溶液： 量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL，加水至50 mL。 （2）0.1mol/L醋酸溶液： 量取1mol/L醋酸5 mL，加水至50 mL。 （3）0.01mol/L醋酸溶液：