Botanical Research 植物学研究, 2014, 3, 91-104
Published Online May 2014 in Hans. https://www.doczj.com/doc/bf13721437.html,/journal/br
https://www.doczj.com/doc/bf13721437.html,/10.12677/br.2014.33014
Progress of Virus Induced Gene Silence
(VIGS) System in the Studies of Gramineae
Plant
Huanhuan Tian1, Rui Qin1, Hong Liu1, Qingyun Liu2, Gang Li1*
1Engineering Research Centre for the Protection and Utilization of Bioresource in Ethnic Area of Southern
China, College of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan
2Hubei Xishui Agricultural Bureau, Huanggang
Email: *lglg863@https://www.doczj.com/doc/bf13721437.html,
Received: Mar. 5th, 2014; revised: Apr. 16th, 2014; accepted: May 2nd, 2014
Copyright ? 2014 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
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Abstract
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a new kind of reverse genetic technique which has devel- oped in recent years. By transferring the recombinant virus vector containing the target gene into host plants to inhibit the expression of endogenous genes of plants, VIGS makes host plants show different phenotypes, such as loss of function or decline in the gene expression of the target gene.
VIGS has the obvious advantages over the traditional technology: easy operation, without con- structing the transgenic plants, quickly obtaining the phenotype of gene silencing and so on. It has been used in studying functional genomics of plant widely nowadays. This article makes a descrip- tion of the mechanisms of VIGS, the process of operation, the factors that influence efficiency of si- lencing, and the application field of VIGS; then, this article will focus on available vectors, pro- gresses and prospects of Gramineous.
Keywords
Virus-Induced Gene Silencing, VIGS Vector, Silence Efficiency, Gramineae
病毒诱导基因沉默(VIGS)在禾本科植物中的
研究进展
田焕焕1，覃瑞1，刘虹1，刘清云2，李刚1*
*通讯作者。
1中南民族大学生命科学学院，南方少数民族地区生物资源保护与综合利用工程中心，武汉
2湖北浠水县农业局，黄冈
Email: *lglg863@https://www.doczj.com/doc/bf13721437.html,
收稿日期：2014年3月5日；修回日期：2014年4月16日；录用日期：2014年5月2日
摘要
病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是近几年新发展起来的一种反向遗传学技术。它是通过将含有目的基因的重组病毒载体导入到宿主植物中，抑制植物内源基因表达，使其表现出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型，属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。与传统的技术相比，VIGS技术具有操作简便、无需构建转基因植株、能快速获得沉默表型等明显优点，现已被广泛应用于植物功能基因组学的研究。本文对VIGS的作用机制、操作过程、影响沉默效率的因素、应用领域各个方面进行阐述，其中会对禾本科植物中的可用载体、研究进展、前景展望进行重点介绍。
关键词
病毒诱导基因沉默(VIGS)，VIGS载体，沉默效率，禾本科
1. 引言
目前，对植物功能基因的研究主要是基于基因的超量表达、基因沉默或敲除的原理建立的，其中后者采用的方法主要是辐射、化学诱变、插入突变、RNA干扰(RNA interference, RNAi)等，而且RNAi技术已在禾本科植物中被证实是基因沉默最有效的技术之一，广泛应用于水稻、玉米等作物研究中。常规的RNAi技术在功能基因组研究中，往往耗时耗力、较难得到稳定转化的植株，而瞬时表达的VIGS (virus-induced gene silencing, VIGS)技术可以克服传统技术的某些瓶颈，具有其独特的优势：快速、有效、高通量，无需构建转基因植株，因此VIGS技术在植物功能基因组研究中得到了广泛应用。
VIGS反应原本是植物体内抗病毒侵染的自然机制，可以阻止入侵病毒在植物细胞内的增殖和细胞间扩散。该反应在抑制入侵病毒的同时，也会抑制与插入片段同源的植物内源基因的表达，属于一种PTGS 的类RNAi现象，普遍存在于植物体中[1]。最早是在1990年，Napol和Stuitje分别在矮牵牛植株发现超量表达与粉色色素合成有关的查耳酮合成酶基因(CHS)[2]；随后在1992年，Romano和Maciano在粗糙脉孢菌中发现了转基因超量表达引起的目的基因的沉默现象[3]；在1995年，Kumagai等利用烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)作载体成功沉默烟草中的八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)基因标志了VIGS技术的产生[4]。从此以后，VIGS技术就逐渐发展为快速高效研究基因功能的技术，尤其是在双子叶植物研究中。目前，该技术在单子叶植物研究中的应用是较为欠缺的，主要原因是单子叶中可以使用的病毒载体较少。而水稻、小麦等主要的粮食作物又多属单子叶中的禾本科，所以将VIGS技术更好的应用于禾本科就显得尤为重要。下面将以禾本科植物为研究对象，从VIGS技术的作用机理、载体的选择、影响效率的因素等方面简要陈述，最后对VIGS技术的在禾本科中的研究进展及前景进行总结。
2. VIGS的作用机制
2.1. 基本诱导机制
VIGS反应的诱导因子同样是双链RNA (double-strand, dsRNA)，另外还需要两种关键酶：依赖于RNA
的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RDRP)和类Dicer酶(Dicer-like, DCL)，其中RDRP负责引导重组病毒的RNA形成dsRNA，DCL是一种RNaseIII酶，作用与动物体内RNAi中Dicer酶相同，都是对dsRNA进行切割。
当含有植物目标基因的重组病毒载体导入植物体后，先合成转基因的RNA，然后在RDRP酶作用下复制成dsRNA，继而引发PTGS反应。DCL酶识别dsRNA并将其切割成21~23 nt的小干扰RNA (short-interfering RNA, siRNA)，基因沉默复合体(RNA-induced silencing comple, RISC)与siRNA结合，其中的RNase将双链siRNA降解为单链siRNA，然后RISC通过单链的siRNA对植物的mRNA进行扫描，找到互补序列并特异性降解，从而使植物体内的该基因在mRNA水平发生沉默[5]-[7]。
以上所述是VIGS反应的基本机制(图1)，但是这种反应往往具有局限性，仅在病毒侵染的特定部位起作用。若以特异性的单链siRNA为模板，通过一定的途径合成双链siRNA，这样双链siRNA又能产生更多的活性单链siRNA，可以进一步增强目标基因的沉默效果；若siRNA在植物体内扩增后转移，就会引起远距离的目标特定基因沉默，甚至系统性地引起植物体全身各部分的基因沉默[8]。
2.2. 不同沉默载体间的差异
目前，绝大多数的VIGS体系都是建立于本氏烟(Nicotianan benthamiana)，进而推广应用于其他物种。而开发出来的沉默载体中主要是RNA病毒，少数为DNA病毒，以及基于两者的卫星载体，这三类载体的诱导机理又略有不同。
Figure 1. The basic induction mechanism of VIGS
图1.VIGS的基本诱导机制
2.2.1. RNA沉默载体
VIGS体系中，应用的RNA病毒载体绝大多是(+)ssRNA，像马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)，豌豆早枯病毒(Peaearly browning virus, PEBV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)，烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)，烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus X, TRV)，雀麦草花叶病毒(Brome mosaic virus, BMV)，大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)等。其中，最早被开发利用的是TMV 和PVX 载体，但这两种病毒对宿主的致病症状较重，对基因沉默的时间短、效率低，且对顶端分生组织无效[9]-[14]。在禾本科VIGS的研究中，BMSV是最早应用的病毒载体[12]，此外可用的RNA病毒载体还有BMV。
当重组的(+)ssRNA 载体进入植物体后，会在类囊泡结构中利用病毒自身编码的RDRP酶先形成(?)ssRNA，然后在宿主体内的内质网同源蛋白(Reticulon homology proteins, RHPs)作用下复制成为dsRNA，进而进行PTGS过程。其中的RHPs是病毒在植物细胞中复制的起始因子，当病毒进入宿主后与RHPs 相互作用，在宿主膜结构上形成病毒复制复合体(Viral replication complexes, VRCs)，来保证重组(+)ssRNA 的成功复制与作用[15] [16]。
2.2.2. DNA沉默载体
应用于VIGS体系中的DNA病毒载体有番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus,TGMV)、非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus,ACMV)、大白菜曲叶病毒(Cabbage leaf curl virus,CbLCV)、棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV)、水稻东格鲁杆状病毒载体(Rice tungro bacilliform virus, RTBV)、中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCV)等[17]-[22]，其中双链的RTBV已成功应用于水稻，其他均为单链环状的(+)ssDNA。
DNA病毒自身是没有RDRP基因，当(+)ssDNA进入植物体后，先利用宿主体内的DNA聚合酶形成dsDNA，在病毒产生的复制起始蛋白Rep作用下，进行滚环复制(Rolling-circle Replication, RCR)，形成大量的ssDNA的拷贝[23]。当这些重组的ssDNA转录后只能利用植物宿主的RDRP酶合成dsRNA，进而诱导PTGS过程。目前在水稻中发现的可用于VIGS的载体RTBV是dsDNA，它的具体作用机制未见报道，猜测可能是重组的dsDNA直接进行RCR形成ssDNA，在进行以后的过程。
2.2.
3. 卫星载体
DNA和RNA两类病毒载体作用过程中可能会需要卫星载体和协助载体来诱导远距离的表型症状[20]。在基于RNA病毒的VIGS体系中，TMV的卫星RNA和协助RNA发现于本氏烟中，并证实了两者共同作用可能比卫星RNA单独作用的沉默表型更明显，常被称为卫星病毒诱导的沉默系统(satellite virus-induced silencing system, SVISS)[24]。此外，TYLCCNV的伴随卫星分子DNAβ构建成的DNAmβ载体，已用于烟草属多个种和番茄等多种茄科植物，且被证实TYLCCNV通过根吸收法有利于对功能基因进行高通量分析[21] [25] [26]。目前在禾本科植物研究中还未发现可用的卫星载体。
SVISS体系和DNAmβ也常被称作卫星载体，两者诱导基因沉默的具体作用机制不清，猜测可能是病毒由于基因组缺失先形成异常的(?)ssRNA或mRNA，再通过协助RNA的作用合成dsRNA，进而诱导植物发生基因沉默；此外还有可能是在周围辅助病毒和宿主特定的作用下来完成诱导过程。
2.3. VIGS的抑制
自然界中很多植物病毒自身含有编码抑制蛋白的基因，其合成的蛋白可抑制某些宿主RNA的沉默。在VIGS体系中，当大量抑制蛋白存在时，病毒的积累量减少，目的基因的沉默效果就会降低；而抑制蛋白只有在病毒大量复制时才会合成，所以在VIGS体系中只会影响病毒积累而不会完全抑制沉默效率。
如水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)作用于本氏烟的研究中，发现其编码的S6蛋白就能强烈抑制本氏烟中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因沉默[27]，但是这种结果在水稻等禾本科植物中还未证实。
来源于不同病毒的沉默抑制蛋白，它们的抑制机理又存在差别。其中，来源于CMV的抑制蛋白CmvZb和TavZb，可以抑制沉默信号的系统性转移，使新长出的叶片沉默效果逐渐减弱，另外来源于番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus, RBSV)的P19蛋白与CmvZb作用机制相同[28]；来源于马铃薯的HC-pro可抑制转GFP基因植株中的目的基因沉默，实验中发现HC-pro是通过抑制siRNA (21~25 nt)的积聚来影响沉默表型，但并不影响沉默信号的产生和系统性转移[29]；来源于PVX的抑制蛋白P25可能是通过与产生系统性信号的上游作用而抑制沉默[30]。
3. VIGS体系的整体流程
在对功能基因进行研究时，VIGS技术的基本操作过程是一致的。首先需要准确找到目标基因，选择最佳长度的基因片段；再选择合适的病毒，并构建重组病毒沉默载体；然后将重组载体导入到宿主；沉默处理后特定条件下培养宿主植物；最后对沉默表型和基因功能进行鉴定。下面将以禾本科植物中为例阐述该流程，并侧重介绍禾本科中载体的选择、已使用的载体的构建、以及不同重组载体侵染宿主的方法。
3.1. 目的片段的选择
插入载体中的序列与目的序列至少应该有23 bp完全一致，且同源性越高沉默效果就会越好[31]。插入片段的长度也是有限制的，一般不能超过1.5 kb，片段太长会降低其稳定性，且会阻碍载体在宿主中移动，影响沉默效果，以300~500 bp间最合适[32]。如果对某个基因家族进行研究时，应该选择该基因家族的保守序列；而当研究家族中某特定基因时，就应该选择该基因的非保守区域[32] [33]。
3.2. 病毒载体的确定
用于VIGS技术的病毒载体应该满足的条件：既易感于宿主又易接受外源基因，能在植物体内复制增殖，可以系统性浸染宿主植物，且病毒子代最好可以均匀分布在器官内的各个组织；决定病毒载体浸染、复制、转移等必不可少的基因序列最好可以集中在较小的范围内。这些条件限制了载体的选择，致使VIGS技术在禾本科植物中推广受阻。与双子叶植物VIGS体系中可用病毒载体相比，单子叶植物中可用的病毒载体很少，主要有BSMV、BMV、RTBV和兰花花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)[20]，而目前只有前三种载体在禾本科作物中得到应用。
BSMV是含α、β、γ三部分基因组的ssRNA病毒，其重组的沉默载体已经应用于大麦、小麦、水稻、玉米等多数单子叶植物中VIGS体系，还包括最近已经测序完成的谷类模式植物二穗短柄草，以及沉默效果不太好的燕麦属(一般实际中不用)。BSMV的宿主除了禾本科外，还包括热带作物姜(Zingiber offi- cinale)以及很有研究前景的香蕉(Musa acuminata)和车前草(M. xparadisiaca)[20]。该载体以往主要是用于沉默植物地面上的器官中的功能基因，现已在大麦中被证实了也可以作用于其根部组织，但是并不能说明可以作用于所有的根部组织中，因为沉默效果会受插入病毒基因组中的目的基因稳定性影响[34]。另一种可用的RNA病毒载体BMV也是有RNA1、RNA2、RNA3三部分，现已用于大麦、水稻、栽培玉米Va35等植物中，成功完成了对目的基因的沉默；另外该载体在玉米中也可以用来研究活体营养寄生物的相互作用，例如在宿主与病原体互作中，通过玉米本身携带的真菌玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)来抑制宿主基因的表达[20]。在水稻中发现的dsDNA病毒载体RTBV，目前仅应用于水稻。通过农杆菌转化法将重组载体导入水稻中，可以抑制处理过的水稻叶片中的PDS基因，效率高达90%[22]。最近研究者又
在蝴蝶兰(Phalaenopsis spec.)中运用对其无毒性的CymMV成功完成了对目标基因的沉默[20]。
3.3. 构建沉默载体
在构建沉默载体时，应该尽量降低病毒本身对宿主的病毒害作用，除去非必须的基因片段，加入必需的反式作用序列、宿主和病毒识别的序列、合适的多克隆位点、tRNA结合位点等，必要时加入泛素化的启动子来保证组成型表达。下面以禾本科植物的三种载体为例简单介绍其构建方法。
BSMV构建的载体多是利用修饰过的RNAβ、RNAγ来进行重组，Holzberg 等通过对BSMV的ND18品系进行修饰，包括除去RNAβ中外壳蛋白基因，在γb基因的下游加入多克隆位点(Pac I、Not I)[12]；Bruun-Rasmussen等则是在γb基因的下游插入含不同限制酶酶切的位点(Sma I、Pac I、Bam HI)的序列，但保留RNAβ中的外壳蛋白基因，结果在感染的大麦叶片上叶片病症较轻[35]；后来Meng等用Holzberg 构建的BSMV中的α、β、γ三部分的cDNA分别插入到单独的双亲载体中(35s启动和核酸酶终止子之间)，其中β部分是利用的是含有活性外壳蛋白基因的cDNA[36]。Campbell等将β、γ上分别携带两种不同的基因，用此重组载体浸染大麦，结果这两个基因同时沉默[37]。另外BSMV载体沉默时间短，且稳定沉默仅发生在前2~3个感染的叶片中，实际试验中往往将PDS基因与目的基因一起导入到载体中来，以PDS 作报告基因[38]。
BMV病毒是研究(+)ssRNA的模式病毒，主要有RNA1，RNA2，RNA3三部分组成，其中RNA1编码一个单顺反子的ORF，转录的蛋白质与RNA的甲基化、N-端加帽活性、C-端RNA解旋酶区域有关；RNA2编码一个单顺反子的ORF，翻译出的蛋白与RDRP同源；RNA3却编码双顺反子的ORF，编码运动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)作用于系统性病毒感染。有两品系F-BMV(Fescue-BMV)和R-BMV (Russian- BMV)，Ding等在构建时使用F-BMV的RNA1、RNA2和R-BMV的RNA3的组合体，前者是其易于感染宿主，后者中含有唯一的HindIII酶切位点使其易于接受外源基因。操作中F-RNA为基础，RNA1、RNA2不作处理，而RNA3用R-BMV中RNA3内的外壳蛋白和运动蛋白之间的序列替代，并将外源片段插入到R-RNA3外壳蛋白终止子的下游这样可以增加嵌合体RNA3的积累[39]。这种含有嵌合RNA3的BMV载体(C-BMV RNA3)作用效果更好，比F-BMV增殖快而比R-BNV致病性低[40]。随后又被改进，将RNA1、RNA2和嵌合的RNA3导入到处理后的双亲载体pCAMBIA的35s启动子和核酸酶终止子间[41]。之前较早时还有一种构建方法，也是Ding构建的载体的起源。将R-BMV中RNA3的外壳蛋白ORF的3端的更换两个限制酶，这两个酶切位点间有337-nt的空间来方便外源基因的插入[42]。
RTBV病毒是一种具有dsDNA的逆转录病毒，其DNA全长约8 kb编码4个开放阅读框(ORFs I-IV)，其中III负责编码有外壳蛋白、天冬氨酸蛋白酶和转录核糖核酸酶H组成的多聚蛋白，其他ORF功能现在还未鉴定出来[43]。Purkayastha等构架载体时，直接把ORFs I、II全部去除，将组织特异性的启动子换成了玉米泛素化的启动子，并引进MCP、tRNA结合位点。通过农杆菌法将重组载体导入水稻时，结果发现叶片中出现白色条纹[22]。
3.4. 沉默载体导入宿主的方法
浸染过程中，不同的浸染方式会影响沉默反应的初始底物浓度，进而影响沉默的效率。所以应该根据不同的载体、不同的要求选择最适方法。当用TRV载体浸染烟草和番茄时多采用真空渗透和高压喷射法，但若只想在其局部浸染且取得较好的效果应采用注射浸润法[44]。目前根据已经报道的文章，可以总结出三大类：摩擦接种法、农杆菌介导转化法、微粒轰击法。
摩擦接种法主要用于RNA病毒载体，它的浸染液多是采用体外转录或从已感染的叶片中提取的病毒载体RNA，再通过牙签或者是石英砂处理待浸染的叶片。这种方法的沉默效果还是很好的，尤其是对不
能用其他方法的植物(拟南芥等)[45]。农杆菌转化法可以介导DNA和RNA病毒载体对宿主的浸染，先将含有宿主目的片段的VIGS载体导入到农杆菌中，再通过农杆菌液对植物进行接种。在该方法中使用的是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，具体操作又可以分为真空渗透法、高压喷射法、注射器浸润法、灌根法，牙签穿刺法。其中，灌根法是最简单易行的方法, 但沉默效率较低、适用范围较小(本氏烟、番茄个别品种)[46]；注射器浸润法适用于只能通过韧皮部浸染的DNA病毒(如RTBV作用于水稻)[20]；注射器浸润法和牙签穿刺法工作量大，沉默效率低，不适于大规模操作；而真空浸润法却可以使TRV在番茄上获得100%沉默效率，可高通量、大规模操作[47]。微粒轰击法，即使用基因枪通过金粉等金属粒子的轰击作用将重组载体导入宿主中，多用于DNA病毒载体，已经成功应用于TGMV[48]，CbLCV[18]及ACMV[49]，后来又证实了对BSMV也适用[36]。
就上述用于单子叶植物的三种载体来说，浸染方法也不尽相同。BSMV、BMV载体浸染宿主时只需对种子进行摩擦就可以感染，而RTBV则采用农杆菌介导的注射法。BSMV载体的浸染液是将含有目的基因序列的重组质粒线性化后，在体外转录，然后加入FES缓冲液[12] [38]，通过牙签、石英砂对种子摩擦进行接种[12] [50]，这种方法效果较好，但是操作复杂，且体外转录酶较昂贵。最近，Meng等通过微粒轰击的方法将含BMSV重组基因的载体成功导入了宿主中[36]，这种基于基因枪的转化方法无需体外转录酶，但是需要购买基因枪和金粉颗粒。BMV载体也可运用BSMV中的方法对种子进行摩擦接种，先在体外对线性重组质粒转录，再加入EFS缓冲液直接接种[12]；若重组BMV载体以DNA的形式浸染宿主时，则可以用农杆菌介导的真空渗透法将重组载体导入水稻，目前这种方法已成功用于水稻、高粱、谷子，但并非是其他植物的最佳方法[40]。另外，摩擦接种的方法得到了改进，可以先用BMV载体对本氏烟进行免疫，从中介植物感染的组织中提取汁液作为浸染液，再对宿主进行接种，这样浸染宿主的载体沉默效果更高效[42]。
3.5. 处理后植物的培育
由于处理后植物的培育条件会直接影响病毒的增殖、转移和植物的生长，而不同的沉默载体、不同的植物间的最适条件又不同，所以需要对分别对宿主、沉默载体的最适条件进行实验调查，其中主要是温度调查。然后进行VIGS研究时可以用植物培养箱来严格控制温度、湿度、光照等条件。
在单子叶植物的研究中已经证实，低温可以增强沉默表型。以BMV作用小麦的实验中发现18-22℃时沉默效果最好，对目标基因mRNA的降解力比26℃时强[50]；在大麦中20℃~24℃比16℃、28℃的沉默效果好[35]；另外，在研究兰花环斑病毒(cymbidium ringspot virus, CymRSV)时，发现24℃以下温度可以抑制植物对CymRSV基因的沉默,其原因是由于该条件抑制了siRNA的产生和积累[51]。
3.6. 沉默效果的鉴定
当培育到一定时间后，我们需要对植物中目的片段的沉默效果进行鉴定，最常用也是最简单的方法就是通过观察表型的变化。如PDS沉默会出现光漂白现象[22]、绿色荧光蛋白GFP沉默时绿色荧光会消失[27]，这两者也常作为报告基因与目的片段偶联导入沉默载体中，根据宿主中表型的改变来推断目的基因是否被成功沉默；若目的基因是抗病相关基因也可以通过抗病性变化来判断。此外,也可以通过对目的基因进行定量分析来检测沉默效果，反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PC)可进行半定量检测[22]，实时定量PCR (Real time-PCR)更精确些[35] [52]，但是两者都是可以显示出PDS、GFP等基因mRNA的降解程度。
4. VIGS沉默效率的影响因子
VIGS体系中的几乎每个过程都可以影响沉默效率，但是主要集中在以下几个方面：合适的重组载体、
外源基因片段的插入方向、重组载体中插入片段的稳定性、重组病毒载体的接种方法、处理后植物的培育温度。
4.1. 构建合适的载体
虽然基于BSMV、BMV沉默载体已经在部分禾本植物中得到了重大进展，但还未达到最佳的沉默效果，而且在其他的禾本植物中的有效性还未鉴定出来。原因可能是病毒对宿主的感染性不好、复制受阻或者是在宿主内的转移受阻。小麦中，栽培种“Bobwhite”表现出更强的光漂白现象，且22℃时对目标基因的沉默水平比“Clark”强[50]。目前所有实验中，并没有可以表现完全沉默的结果，因此应该是存在比目前更好的沉默效果。而在后来的研究中发现由于BSMV载体表达了GFP基因的部分片段，在小麦栽培种Renan中引发了与植物防御系统相关的基因表达，研究者推断出这些基因的表达与稻瘟病菌的抗性相关，而与小麦的白粉病的发生无关[53]。水稻中，BMV可以在栽培稻IR64、Drew和Cypress中会引起中度花叶症状，在栽培稻Moroberekan和IAC165中引起严重症状、甚至会引起也变得局部坏死，但却没有BMV可以感染日本粳稻(Nipponbare) [40]；另外，BMV在玉米的多个栽培品种中会引起严重的系统性坏死，所以不适合做其宿主植物[20]。也就是说病毒可以浸染目标植株并不代表适用于该植物中的VIGS 体系。
4.2. 插入片段的方向
多数目的基因片段反向插入到重组载体中的带来的沉默效果优于正向插入的效果[35][45] [54]。早期的研究中发现，在BSMV载体中插入反向重复的目标序列可以增强沉默的表型或者是下调目的基因的表达量[54]。然而，近期实验者在BSMV、BMV载体介导的VIGS体系中发现：这些短的反向重复序列非常不稳定性、沉默的有效性不如正向插入的片段[34]，所以需要进一步对禾本科植物沉默体系进行研究，来确定反向重复序列的普遍有效性。
4.3. 重组载体中插入片段的稳定性
维持重组载体中插入片段的稳定性也是获得良好沉默效果的重要因素，其稳定性与siRNA的产生、目标mRNA的沉默和沉默表型的维持均有密切关系[35] [50]。研究者利用TRV在本氏烟中沉默的基因，很少可以在子代该组织以及相关组织的所有细胞中出现沉默表型，这些表型的出现多与插入片段的稳定性密切相关[55]。然而在禾本科植物中，VIGS在系统性感染的组织中多为瞬时表型，仅有2~3个叶片或者茎组织间出现沉默表型；而且叶片中出现的沉默表型多为不完全的斑点状，在纵向的维管束中表型为或大或小的条纹。这些瞬时、不完全、可观察的沉默表型一般与外源基因的部分丢失相关联[35]。而外源基因片段的丢失机制还未完全破解，可能的原因有RNA聚合酶活性引起的插入片段的缺失、RNAs间的重组，这也就引起了宿主植物表现出复杂多样的表型[56]。
而插入片段的稳定性受片段大小、核酸组成的影响[35] [54]，这也可以解释两个基因同时插入载体中沉默效果不好的原因[50]。另外，插入片段的稳定性受宿主和病毒因素共同影响，因此在宿主间沉默的结果是多样的。目前，研究者多致力于研发可大量增殖的病毒载体、有更好沉默表型的宿主，而插入序列的稳定性研究还处于早期阶段。
4.4. 重组病毒载体的接种方法
农杆菌介导的VIGS最早用于本氏烟实验中，研究者通过对其优化，成功用于茄科、莴苣、拟南芥、番茄中并得到了稳定的沉默结果[46] [57]。目前在禾本科中，一些DNA病毒通过这种方法已成功应用于水稻、玉米、小麦中。在2009年，第一次报道了农杆菌介导的真空浸润法成功用于水稻中[41]，对栽培
稻IR64进行真空浸润产生的沉默效果比机械接种的得到的效果更强、持续时间更长[40]。
机械接种过程中，需要烟草等作为中介宿主植物，操作较复杂。先将重组BMV载体导入到烟草中，一定时间后从中提取病毒RNA的转录产物，然后通过摩擦接种到目标植物中。而农杆菌介导的转化中，需要体外转录酶，费用较高。其中含有重组载体的接种液是线性化的重组质粒在体外转录得到的，再经真空浸润法导入到水稻中。另外，微粒轰击法也是可以选择的方法，但是需提前购买基因枪和金粉。4.5. 处理后植物的培育温度
在双子叶植物中已经证实了：低温可以增强沉默的表型，高温易引起病毒基因组的沉默[32]，原因可能是低温利于不断积累病毒载体而高温会破坏病毒。对BMV实验研究中发现，低温条件(24℃/20℃，白天/晚上)时，病毒的浸染和积累主要发生在大麦维管束细胞内及附近细胞，这一结果提示了控制沉默条件是很重要的。因此，温度影响多用于分析新的植物–病原体组合[20]。
另外，选择的宿主植物所处的生长期也可以影响沉默效率。所有的宿主植物多为较小的苗期，此时重组载体较易侵入，Purkayastha等实验中所用的水稻为生长了15天的幼苗[22]。
5. VIGS技术的应用进展
近几年，病毒诱导基因沉默(VIGS)的研究在各个方面都有了很大的突破，人们逐渐发现VIGS技术独特的研究优势：快速、有效、高通量，不需要耗时耗力得到转基因植株，往往在1~2周就可以表现出沉默表型；可以通过将某基因的最保守序列整合进重组载体中，来对基因家族中的单个基因进行研究，反之也可以共沉默同源基因；可以在植物的苗期进行突变致死基因的功能研究；可以通过含有同源基因片段的重组载体感染不同物种，来对不同物种间进行比较基因组的研究[58]；还可以在未知全基因序列的条件下对该基因进行VIGS分析研究，另外还可以通过将cDNA文库中的片段随机的插入到载体中进行高通量的分析[59]。也正是这些优势使其受到越来越多研究者的青睐，目前应用最多的领域是在植物的功能基因研究中，包括植物抗病机制的研究、抗旱信号途径[60]、光合作用途径[61]、无义介导的mRNA 的降解(Nonsense-mediated mRNA decay, NMD)[62]等方面，最近在动植物(寄宿主间)互作方面也展开了研究[20]。
由于VIGS技术可以特定地诱导植物体内各个部位基因的沉默，因此常作为高效的反向遗传技术应用于植物体的功能基因研究中，尤其是在某些抗病基因功能、抗病信号路径的研究中发挥着越来越重要的作用。以BSMV为载体成功诱导大麦叶片中PDS基因的沉默，开辟了VIGS技术用于禾本科植物功能基因研究的先河。BMSV载体在使用中往往表现出沉默时间短、有效沉默仅发生在前2~3个感染的叶片中，所以可以将宿主的PDS基因也一起导进载体中，这样就可以通过光漂白现象来作为沉默的报告基因，而PDS的mRMA的降解情况可用RT-PCR进行检测。目前BSMV已经发展为大麦、小麦中VIGS的稳定载体，已广泛用于抗病基因相关研究，包括小麦中的叶锈病抗性基因(Lr21/Lr10)[63] [64]、茎锈病抗性基因(TaRLK1/2/3)[65]、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(Stpk-V)[66]、条纹病真菌抗性基因(TaHsp90.2、TaHsp90.3)[67]；大麦中的白粉病抗病基因(Hsp90)[68]、Blufensin1 (Bln1)[36]、WRKYs1/2[69]、编码阳离子交换蛋白HvCAX1的NecS1基因[70]，及大麦中其他非宿主抗病基因。另外，BMSV载体也成功用于小麦中抗虫基因的研究(蚜虫抗性基因WRKY53和Pal)[71]，种子萌发相关基因(TaHsp90.1)[68]；大麦中有关细胞壁代谢基因(P23k、CesA)[72] [73]、有关磷酸盐吸收的根尖基因(IPS1、PHR1、PHO2)[34]。后来发展的可用于禾本科BMV载体也成功用于以下研究：玉米中与玉蜀黍黑霉菌相互作用的基因Tps6/11、Ecb、Bti，其中沉默Tps6/11基因可以增强组织对玉米真菌病原体的易感性[74]。最近报道，BMV载体可以沉默玉米中的m-型的硫氧还蛋白[75]。而且，这些利用BMV载体使基因沉默表达的组织比甘蔗花
叶病毒(Sugarcane mosaic virus, ScMV)感染系统更容易得到[20]。
6. VIGS技术在禾本科中的前景展望
水稻、小麦、玉米等重要的粮食作物都是禾本科，怎样将VIGS技术更好的应用于农业生产中也就成了重要的课题。但由于VIGS技术在禾本科中还不成熟，不能特异性沉默基因的表达；就算在已经成功应用的植物品种中，也需要改进操作方案来获得更高沉默效率。另外，开发新载体、非转基因性状的可遗传性也将会是未来的研究热点。
VIGS技术在禾本科植物功能基因组研究方面虽然取得了重大的进展，但是目前禾本科中应用的病毒载体，多数是仅能在宿主叶片中瞬时表达，并不能表现出最佳沉默效果。所以，我们可以将现有的BSMV 和BMV载体进行修饰，使其能够在35s启动子后更易连接目的片段、更易表达，这样就可以使操作简便、节省时间[13] [36]。除了对现有载体进行修饰、在已知的ESTs数据库中选择最适目标片段，我们还可以提高目的片段在重组载体中的稳定性。这样就需要对现有载体病毒的DNA/RNA结构、顺式/反式作用因子进行分析，希望能得到更好地维持插入片段稳定性的载体。
在现有载体的基础上开发新载体也是今后重要的研究领域。目前新发现的绝大多数载体都会诱发宿主植物严重症状，我们还需要致力于研发通过昆虫和种子不能传递的新型病毒载体，这样就可以在较宽松的条件下进行研究。例如，黍花叶病(Panicum mosaic virus, PMV)是一种ssRNA，可以引起多数单子叶植物轻微的花叶症状，通过机械接种可以在植物间转移，而通过昆虫载体和种子不会进行传递[76]；X.S. Ding等基于该病毒的特点，成功构建出的PMV载体可以允许外源基因表达，但作为沉默载体的有效性还在研究中[20]。此外，Tatineni等构建出小麦条纹花叶病毒(Wheat streak mosaic virus, WSMV)的一系列载体，这些载体可以在大麦、小麦、玉米等多种禾本科植物中表达GFP基因；但是由于该病毒会编码一种RNA沉默的抑制蛋白，WSMV载体还需要进行仔细的评估[77]。所以目前为止，对现有载体进行优化是提高禾本科植物VIGS效果的最有效方法。
除了功能基因的研究，VIGS技术也经常用于植物–病原体的相互作用和植物发育领域的研究。尽管昆虫学家和植物学家不常用VIGS技术来研究植物–昆虫间的相互作用，但是也都意识到了VIGS具有的巨大潜力，所以这方面必将会成为VIGS技术研究的另一热点。用VIGS技术来研究植物–昆虫相互作用最早是有Stratman研究组提出并应用于番茄与M. sexta的研究中[78]，得到与Wu等[79]相同的结论：番茄对M. sexta幼虫的抗性是通过调节JA的生物合成来影响MAPKs的结果。另外，在黑芥(Brassica nigra)和拟南芥研究中，通过VIGS技术来研究菜粉蝶(Pieris rapae)在其宿主植物叶片上的产卵行为[80]。这是VIGS技术首次用于生态领域，来研究昆虫和植物的相互作用。这一研究思想也可应用于水稻、小麦等禾本科植物的中的研究中，进而研究寄宿主间的相互作用。VIGS在生态领域的应用也将会成为未来研究的重要领域。
项目基金
湖北省自然科学基金重点项目BZZ11001。
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植物病毒载体的类型及应用 摘要：植物病毒载体可分为5种类型，烟草花叶病毒载体是最常用植物病毒载体。植物病毒载体应用广泛，有诸多优点，也存在一些问题。本文对植物病毒载体进行综述。 关键词：植物病毒载体；类型；烟草花叶病毒载体；应用 The Types and Application of Plant Virus Vectors Abstract: Plant virus vectors can be divided into five types. Tobacco Mosaic Virus vector is the most commonly used plant virus vector. Plant viral vectors are widely used. They have many advantages，as well as some problems. This article provides an overview of plant virus vectors. Key words: plant virus vectors; type; Tobacco Mosaic Virus vector;application DNA 体外重组是基因工程技术的重要步骤之一，它是将外源目的基因与适当的载体相连。要把一个目的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，这个携带目的基因进入受体细胞中的工具就称为载体(V ector)。载体有很多种，病毒载体是其中的一种。病毒载体是利用病毒的基因组序列元件构建的真核基因转录工具[1]。植物病毒载体的研究开展得较晚，1984 年才诞生了第一例由植物DNA病毒——花椰菜花叶病毒(Califlower mosic virus，CaMV)构建的载体。但是植物病毒载体具有很多优点，例如短时间内可以生产大量成本低廉的外源蛋白，满足医药及工业用蛋白的需求。因此，1984年之后，人们尝试了多种植物病毒载体构建方法。目前已经构建了多种类型的植物病毒载体，已有用植物病毒载体pClYVV 表达了绿色荧光蛋白基因[2]、Nodulin gene基因、人的α-干扰素基因及小球状病毒抗原蛋白基因等的报告[3]。近年来也逐步利用植物病毒载体作为探针，用于研究植物和植物病原基因的表达调控、编码产物的功能以及植物与病原的相互作用。 一植物病毒载体的类型 植物病毒载体可分为置换型载体、插入型载体、互补型载体、抗原展示型载体和融合/释放型载体5 种。 1置换型载体 置换型载体是最原始的载体类型，由外源基因置换对植物病毒基因组复制影响不大的基因构建而成，一般用于转染原生质体进行瞬时表达以验证构建载体的可行性，较少接种于植株来系统地表达外源基因。CaMV 首先被用于构建置换型载体的研究。用外源基因置换CaMV 的基因Ⅱ(蚜传因子)后不影响其侵染性，成功地表达了细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)和人α-D 干扰素基因[4]，IFN-αD 的表达量可达到2μg/g(鲜叶)。 DEC 2012
基因沉默研究进展 摘要：基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者表达减少的现象。基因沉默是基因表达调控的一种重要方式 ,是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制 ,在外源 DNA 侵入、病毒侵染和DNA 转座、重排中有普遍性。对基因沉默进行深入研究 ,可帮助人们进一步揭示生物体基因遗传表达调控的本质 ,在基因工程中克服基因沉默现象 ,从而使外源基因能更好的按照人们的需要进行有效表达;利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的表达 ,达到治疗疾病的目的 ,所以研究基因沉默具有极其重要的理论和实践意义[1]。 关键词：基因沉默，转录水平基因沉默，转录后水平基因沉默，病毒介导的基因沉默. 基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。一方面,基因沉默是遗传修饰生物(genetically modified organisms )实用化和商品化的巨大障碍 ,另一方面 ,基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应 ,为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略—RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance ,RMVR)[2～4]。 基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现。基因沉默主要发生在两种情况，一种是转录水平上的基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS） ,另一种是转录后基因沉默（post- transcriptional gene silencing, PTGS）。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是近几年发展起来的转录后基因阻断技术，RNAi在2002年被Science评为全球十大科技突破之一,作为一种在细胞水平的基因敲除工具,RNAi 正在功能基因组学领域掀起一场革命[5]。 一、基因沉默的分类及其机制 （一）、转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核RNA合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的RNA而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：1.基因及其启动子甲基化。2. 同源基因间的反式失活。 3. 后成修饰作用导致的基因沉默。 4. 重复序列。 5. 位置效应。 （二）、转录后水平基因沉默 转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳定转录，但在细胞质里却无相应稳定态mRNA存在的现象。与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂不可遗传性。目前发现主要有以下几种转录后水平基因沉默现象。1. 共抑制。2. 基因压制。3. RNA干扰。 二、植物基因沉默研究进展 基因沉默是普遍存在于植物界的一种防御反应．近年来,转录后水平上的基因沉默(PTGS)在植物中特别是在转基因植物中得到了广泛的研究.PTGS是植物的一种自然防御机制，是指基因能正常地转录，但所转录的mRNA在细胞质内积累量很低或根本检测不到．这是由于细胞核内转录mRNA进入细胞质后，与具
《细胞》：不依赖于RNAi的基因沉默机制被发现 来自瑞士日内瓦大学细胞生物学系的研究人员发现了一种不依赖于RNAi（RNA干扰）的基因沉默机制，这为进一步揭示生物体中基因沉默的多样化，以及功能作用提供了重要信息。这一研究成果公布在最新一期的《细胞》（Cell）杂志上。 RNA沉默存在两种既有联系又有区别的途径：siRNA(small interference RNA)途径和miRNA(microRNA)途径。siRNA途径是由dsRNA(double-stranded RNA)引发的，dsRNA被一种RNaseⅢ家族的内切核酸酶(RNA- induced silencing complex，Dicer)切割成21－26nt长的siRNA，通过siRNA指导形成RISC蛋白复合物(RNA-induced silencing complex)降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA沉默。而miRNA途径中miRNA是含量丰富的不编码小RNA(21－24个核苷酸)，由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构RNA(hairpin RNA，hpRNA)形成。miRNA同样可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物，可以结合并切割特异的mRNA而引发RNA沉默。尽管引发沉默的来源不同，但siRNA 和miRNA都参与构成结构相似的RISC，在作用方式上二者有很大的相似性。 在最近的一项研究中，来自加州大学河畔分校的研究人员发现了一种新的小RNAs分子，而这些小RNAs与近期的研究热点PIWI-interacting RNAs （piRNAs）和repeat-associated siRNAs (rasiRNAs）也不相同，这说明了小RNA家族和小RNA介导的基因调控远比之前预想的复杂。同样在这篇文章中，研究人员也发现基因沉默机制包含有多种途径，他们最新发现酿酒酵母中，反义RNA稳定（Antisense RNA Stabilization）能通过组蛋白去乙酰化引起转录基因沉默。在之前的研究中，酿酒酵母全基因组研究分析揭示出其转录本中包含了大量的反义RNA（antisense RNAs），以及由外切酶体元件（exosome component）Rrp6调控的基因间转录（intergenic transcripts）。通过进一步研究，瑞士的研究人员发现当缺失了Rrp6的功能后，两个PHO84反义转录就会变得稳定，并且抑制了PHO84基因的转录。有趣的是，研究人员在野生型中也发现了同样的现象：在时间性老化（chronological aging）的过程中Rrp6功能缺失也能稳定PHO84反义转录。上位性和染色质免疫共沉（Epistasis and chromatin immunoprecipitation）实验结果说明Rrp6功能的缺失与PHO84基因以及邻近基因的Hda1组蛋白去乙酰化的补充有关，但是组蛋白的去乙酰化受限于PHO84基因，这又说明Hda1活性依赖于反义RNA。因此敲除反义产物，即使是在缺失Rrp6的条件下也会阻碍PHO84基因抑制。这些数据表明反义转录的稳定通过不同于转录干扰的一种机制导致了PHO84基因抑制，而Rrp6功能调节则通过RNA依赖性表观遗传修饰调控基因。 基因沉寂 基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被称为“基因沉默”。基因沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉寂实际上是形成异染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态。 定义RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象。 原理基因沉寂需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白N端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰（由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又被称为'过度’甲基化修饰（Hypermethylation) ) 、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质（MBP）形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的N端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白N端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉寂”失去转录活性。 作用这个“原则”就是目前尚没有真正完全清楚的“组蛋白密码”（Histone Code)。能够
植物JAZ基因的功能及生理作用 摘要：JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白是植物中茉莉酸信号调控途径中重要的负调控因子，他的出现使茉莉酸类物质的研究得到了极大的进展。本文将具体介绍JAZ基因的功能、生理作用以及JAZ基因在几种植物中的作用。 关键字：JAZ；功能；生理作用；茉莉酸信号传递 JAZ是茉莉酸响应的抑制因子，其研究主要以模拟生物拟南芥为研究对象，细菌、真菌、动物基因组中未发现JAZ同源基因，这和很多的研究结果一样，因此JAZ基因为植物特有。此外，在低等水生藻类植物中也未能检测到JAZ及其同源基因，所以很有可能JAZ基因有可能起源于陆生植物[1]。研究发现，在拟蓝芥中的12个JAZ蛋白中，除了保守的ZIM结构域外，在靠近C端还有一个保守的jas结构域，但它们只有十三个氨基酸完全相同，且氨基酸的数目范围是131~352，所以JAZ成员在氨基酸数量上有很大差异。此外，其两个结构域的相对位置也不固定。ZIM结构域含有28个氨基酸，一般位于JAZ蛋白的中间，在他的N端含有一个TIFY基序，C端有两个不变的丙氨酸[2]。由于保守的ZIM结构域，JAZs是属于TIFY蛋白的大基因家族，他们不含任何已知结构域，但某些JAZs定位于细胞核。此外，JZA家族基因之间能发生同源互作和异源互作，也能与茉莉酸相关的转录因子结合[3]。 1、JAZ基因的功能 在JAZ基因的研究中，我们发现植物基因组中的重复基因JAZ家族可分为多个亚家族，这是由于在进化过程中，JAZ亚家族间发生功能分化，即不同的JAZ亚家族可能具有不同的功能[1]。JAZ蛋白功能的行驶方式是通过一系列因子的互作完成，主要分为五类：包括F-box受体、bHLH转录因子、R2R3MYB转录因子、荷尔蒙信号通路涉及到的转录因子、共阻遏物以及JAZ家族本身[4]。在不同的植物中，过表达JAZs的表型不同：水稻过表达TIFY11b可以增加籽粒大小；大豆过表达GsJAZ2可以增加植物对盐碱的敏感性；烟草中过表达NaHAZd和NaJAZh分别可以抑制花蕾脱落和促进尼古丁的合成[4]。这是由于不同植物中JAZ结构和功能的差异引起，但不同家族成员在JA信号途径的功能是互补的。下面我们介绍两个特殊结构域——ZIM结构域和jas结构域的功能。 1、1 ZIM结构域功能 ZIM结构域，甚至是TIFY基序与JAZ蛋白形成同聚肽和异聚肽有关，缺失jas结构域的JAZ10蛋白——JAZ10.4，如果JAZ10.4过量表达，会导致雄性不育的coil突变体表型以及根的生长不被茉莉酸所抑制，但突变 JAZ10.4蛋白TIFYmotif没有上述前者现象。JAZ10.4蛋白不易被降解，表现出稳定的特性，平且可以通过与其他正常的JAZ蛋白形成二聚体形式
高级植物病毒学
高级植物病毒学 第一讲 1.病毒：病毒是一组（一种或一种以上）RNA或DNA核酸模板分子，包被在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞内，依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制，随着核酸的变化而发生变异。 2.病毒与其他类似生物的区别： ⑴与细胞型寄生物的区别：①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜（continuous bilayer membrane）与寄主细胞的细胞质分开 ②病毒中缺少蛋白质合成的系统。 ③病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体（virion或virus particle）。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。⑵与质粒的区别：①正常的病毒具有粒子形态，其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的，并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。 ②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化，对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。 ③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡，但是质粒不会。 ⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别： ①大小: 一些痘病毒（pox virus）比衣原体的原体更大。 ②基因组的性质和大小: 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。 ③DNA 和RNA 的存在 ④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。 ⑤在活的寄主细胞外面，病毒与许多类群的专性细胞性寄生物（cellular parasite）如衣原体都不能生长。 ⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。 ⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。
植物组织培养研究进展 摘要 植物组织培养技术作为一种科研手段,发展异常迅猛。从组织培养的原理、培养过程中遇到的问题以及前景和展望这3方面综述了我国近几年植物组织培养的新研究。 关键词: 组织培养；存在问题；措施；发展 20 世纪后半叶，植物组织培养发展十分迅速，利用组织培养，不仅可以生产大量的优良无性系，并可获得人类需要的多种代谢物质；细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力；还可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体；组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料[1]。因此，植物组织培养广泛应用于植物科学的各个分支，如植物学、植物生理学、遗传学、育种学、栽培学、胚胎学、解剖学、病理学等，并广泛应用在农业、林业、医药业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，被认为是一项很有潜力的高新技术。 1组织培养的基本原理 1.1植物组织培养的概念 植物组织培养技术是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织或潜伏芽等，或长成完整的植株的技术[2]。 1.2植物组织培养的依据 植物组织培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家GHaberlanclt根据细胞学理论[3]，大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直到单个细胞，即植物体细胞在适当的条件下具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜力的观点。1943年，美国人White在烟草愈伤组织培养中, 偶然发现形成一个芽, 证实了GHaberlanclt的论点[4]。在许多科学家的努力下，植物组织培养技术得到了迅速发展，其理论和方法趋于完善和成熟，并广泛应用产生了巨大的经济效益和社会效益。 1.3培养基的选择 组织培养的基础培养基有MT、MS、SH、White等[5]。由于不同植物所需要的生长条件有所不同，会对培养基做一些不同的处理，一般采用较多的是MS。组织培养采用固体培养基的较多，但只有在植物周围的营养物和激素被吸收，如果其他残留的培养基也能被利用，对工厂化生产的成本减少方面有很大的帮助。董雁等[6]利用回收转换后废弃的继代培养基，加入原继代培养基30 %浓度母液的培养基，培养效果与原继代培养基的基本相同，说明继代培养基再利用是可行的，这为规模化组培育苗开辟了新的途径。杜勤[7]等在无外源激素条件下，研究液体和固体培养基对黄瓜子叶培养器官分化的影响，结果用液体培养基直接诱导花芽率更高，分化高峰期出现的时间也更早，说明液体培养基对外植体的生长更有利，只是固体培养基更易操作而被较广泛应用。 2植物组织培养过程中存在的问题 2.1 污染问题 组织培养过程中的污染包括内因污染和外因污染。内因污染指由于外植体的表面或者内部带菌而引起的污染；外因污染则是主要由环境污染和操作不当引起，是指在接种或培养过程中病菌入侵，例如培养基、接种工具和接种室消毒不严格以及操作不规范等[8]。 针对植物组织培养中污染产生的原因，应从以下2个方而着手来控制污染。一是控制外植体自身带菌，外植体的表而带菌可以经过一系列的杀菌处理来减少；而外植体的内部带菌是不
植物转基因沉默的机制及克服方法 专业：植物学学号：220100905010 姓名：潘婷 摘要：植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用，转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。 关键词：转基因沉默；外源基因；DNA甲基化；共抑制 1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后，研究者对转基因沉默进行了许多深入探索，以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。 1 转基因沉默机制 转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。 1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制 1．1．1 甲基化作用从目前报道看，几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关，DNA甲基化都是从启动子区域开始的，主要发生在基因5’端启动子区域。甲基化通常发生在DNA的GC 和CNG序列的C碱基上，C碱基甲基化不是转基因沉默前提，但对维持基因沉默是必需的。甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。 1．1．2 位置效应转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。研究发现，转基因烟草中稳定表达的T-DNA
至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻，并且位于端粒附近。而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。1．1．3 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。它有顺式失活和反式失活2种作用方式。进行多个基因转化时，基因启动子间同源序列相互作用也能引起反式失活。 1．2 转录后水平基因沉默(PTGS)机制 1．2．1 RNA阈值模型 1994年Dougherty等提出RNA阈值模型，认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。监控系统能促使超量表达的mRNA降解，使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。 1．2．2 异常RNA模型鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平，而是有一种不同于正常mRNA的异常的RNA(aRNA)存在，English等1996年提出了异常RNA模型，该模型认为aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的活性，RdRp 再以aRNA为模板合成大量约25bp的互补RNA (cRNA)。这些cRNA如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分双链结构一dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别、降解。在该过程中，内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合，并被同时降解。这样外源基因的导入，会最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，即出现共抑制现象。 1．2．3 双链RNA模型 Waterhouse认为转基因沉默原因在于外源基
植物基因功能诠释研究方法的新进展 (东北农业大学，150030) 摘要：本文通过阅读大量的文献，总结了植物基因功能注释研究方法的最新进展。对每种方法的原理及优缺点做了综述，拟供初学者和作相关研究者参考。 关键词：基因功能；研究方法；新进展 基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组(functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。功能基因组学(functional genomics)又往往被称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。[1,2]这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析，cDNA微阵列，DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体。 自华大基因启动“千种动植物基因组参考序列谱构建计划”和“千种植物转录组研究”以来，已完成水稻、黄瓜、马铃薯、白菜等植物的基因组序列图谱绘制，并通过对大豆的重测序研究建立了高密度分子标记图谱。这将是21世纪生命科学研究的重要领域。[3]本文将对研究基因功能的新技术及其新进展作一综述。 1 利用生物信息学方法分析基因的功能 生物信息学是利用生物信息学和电子技术(互联网技术)寻找并克隆新的未知功能的基因,着重于技术和操作层面,利用生物信息学对新基因进行电子克隆,及克隆该新基因的序列后对其进行简单的功能分析,如基因的编码区、启动子区、内含子/外显子、翻译启始位点和翻译终止信号预测,基因的同源比对,编码的氨基酸辨识蛋白质,蛋白质的物理性质,蛋白质的二级/三级结构、特殊局部结构以及功能预测等[4]。 1.1 通过序列比对预测基因功能
植物组织培养的研究进展和发展趋势 （甘肃农业大学生命科学技术学院植物生物技术，甘肃兰州730070） 摘要:植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的原理而发展起来的一门生物技术。本文简要概述了植物组织培养的概念及研究进展，较全面的综述了植物组织培养新技术以及在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面的研究现状，最后展望了植物组织培养的发展趋势。 关键词：组织培养；研究进展；发展趋势 Research Progress in Plant Tissue Culture and trends (College of life science and technology of plant biotechnology of Gansu Agricultural University,gansulanzhou 730070) Abstract: Plant tissue culture plant cells are totipotent under the principle and developed a biotechnology. This article provides a brief overview of the concepts and plant tissue culture research, a more comprehensive overview of plant tissue culture propagation of new technologies as well as in detoxification, breeding, germplasm conservation, extraction of secondary metabolites, and other aspects of gene transfer research status , Finally, the future trends in plant tissue culture. Key words: organizational culture; research status; trends 引言 植物组织培养是20世纪之初，以植物细胞全能性为理论基础发展起来的一门新兴技术，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工配制的环境里培养成完整的植株，也称离体培养或植物克隆。自1902年德国科学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性理论, 到1934 年美国White 等用番茄根进行离体培养证实这一观点以来,植物离体培养技术在基础理论和应用研究，已广泛应用到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学 等各个研究领域, 成为生物学科中的重要研究技术和手段之一[1]。近年来，随着 科学技术的不断发展，植物组织培养新方法和新技术不断涌现，研究重点也由器官、细胞水平向分子、基因方向转移。21世纪，生物技术是最有生命力的一门学科，而植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段，被认为具有巨大的潜力，现就植物组织培养技术研究进展做一简单综述。 1在植物育种上的应用 植物组织培养技术对培养有粮作物品种开辟了全新的途径。目前，国内外已
植物抗病基因研究进展 摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。近年来，通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。本文简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略, 并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。 关键词植物病毒、抗病基因、基因工程、前景 一、植物抗病基因工程原理 植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆、与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒、用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒、筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。 植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足现代农业的生产要求。病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植物抗病品种抗性丧失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生植物中的储存；第三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是以线虫和真菌传播的植物病毒能在土壤中存活许多年。因此，在适宜病毒介体生长的温度条件下，大面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。Hamilton[1]于 20 世纪 80 年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。近 20 多年来，基因工程的发展，为防治病毒病开辟了新途径。 二、利用非病毒来源的基因策略 1.植物自身基因介导的病毒抗性 一些植物在病毒侵染的时会启动主动防御机制，最普遍最常见的主动防御机制就是通常所说的过敏反应，也就是那些最初被病原侵染点周围的细胞发生程序性死亡最终在病原最初侵染点周围形成坏死斑。如番茄中的 Tm-1 或 Tm-2 和Tm-22基因，马铃薯的 Rx，Ry，烟草中的 N 基因等等[2]。这类基因通常称为 R 基因。根据其抗性水平的不同还分为：真实免疫指病毒复制完全不能发生、阈下侵染指病毒的复制仅局限于受侵染的细胞。不管 R 基因是在模式植物还是在
基因沉默 摘要随着基因技术的迅速发展和广泛应用，在转基因技术实践中首先暴露出来的外源基因不能按照预期设想进行表达的问题越来越显得普遍，而人们对基因沉默现象的不断深入研究和探索，不仅揭示出了基因沉默的发生机制，也在一定程度上推动了新技术的产生和应用，这不仅推动了基因研究领域的发展，更在遗传群体构建、疾病治疗等方面建立了新方法、新体系，为生物学技术的发展做出了贡献。 关键字基因沉默分类机理应用 1.引言 基因沉默（Gene Silencing），又称为基因沉寂，是真核生物细胞基因表达调节过程中的一种特殊生理现象，是指细胞基因在表达过程中受到各种因素的综合作用而导致基因部分区段发生“沉寂”现象，从而失去转录活性并不予表达或表达减少。该现象最先于1986年Peerbolte在转基因植物研究中所发现，随后科学家在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现了基因沉默现象的存在。 转基因沉默是基因沉默现象最为频发和常见的，这也是转基因为何在受体难以百分之百全部表达的因素之一，其基本特征是导入并整合到受体基因组的外源基因在当代或后代中表达活性受到抑制。研究发现，其主要原因是由于转基因之间或转基因与内源基因之间存在着序列同源性，因此转基因沉默又被称为同源性依赖的基因沉默（homology-dependent gene silencing）。 根据沃森-克里克的核酸碱基互补配对模型，基因沉默可能涉及到DNA-DNA、DNA-RNA以及RNA-RNA三种不同形式的核酸分子之间的互作，简单地说就是插入的外源DNA或自身基因区段在核内高浓度的RNA作用下，能够与内源反向DNA 或者RNA进行碱基互补配对，并且在核内被重新甲基化，进而导致基因沉默；而另一种可能则是内源基因与转基因转录生成的RNA之间互补配对生成可被RNases酶性降解的双链RNA（dsRNA），其水解直接导致基因的不表达，即基因沉默效果。从染色体水平上看，基因沉默现象的实质是形成异染色质（Heterochromation）的过程，检查发现被沉寂的基因区段往往呈现出高浓缩状态，显然，这在一定程度上也决定了被沉寂基因的难表达性。实验早已证明，在高度浓缩的基因区段，正常的DNA转录活动是难以进行并维持的，换言之，即一旦形成异染色质进入高度浓缩状态，那么相应区段的基因片段就必然因为不能被
组培的研究进展及发展趋势 植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的原理而发展起来的一门生物技术。简要概述了植物组织培养的概念及研究进展，较全面的综述了植物组织培养新技术以及在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面的研究现状，最后展望了植物组织培养的发展趋势。 关键词：组织培养；新技术；应用现状；发展趋势 植物组织培养是20世纪之初，以植物细胞全能性为理论基础发展起来的一门新兴技术，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工配制的环境里培养成完整的植株，也称离体培养或植物克隆。自1902年德国科学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性理论, 到1934年美国White 等用番茄根进行离体培养证实这一观点以来,植物离体培养技术在基础理论和应用研究，已广泛应用到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域, 成为生物学科中的重要研究技术和手段之一。近年来，随着科学技术的不断发展，植物组织培养新方法和新技术不断涌现，研究重点也由器官、细胞水平向分子、基因方向转移。21世纪，生物技术是最有生命力的一门学科，而植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段，被认为具有巨大的潜力。 一、植物组织培养新技术的研究 随着科学技术的发展和对植物组织培养技术的不断深入研究，一些新的培养方法和技术不断出现，为植物组织培养技术的不断优化和发展提供了新的途径。 1.新型光源的应用 光是植物生长发育必不可少的重要因素之一，光照长短、光质、光周期对植物的生长、形态建成、光合作用、新陈代谢以及基因表达均有调控作用。传统的组织培养光源灯普遍存在寿命短、发热量大且不均以及发光效率不理想等缺点。LED作为植物组织培养光源早在1991年就有栽培试验。研究发现, 光质比例和光照强度可调的LED 光源比通常植物组织培养使用的荧光灯更能有效地促进试管苗的光合作用和生长发育。蒋要卫利用LED作为大花蕙兰组培苗光源的研究发现, LED光源可以显著改善大花惠兰试管苗的生长状况和提高其品质。日本的田中道男等运用阴极荧光灯( CCFL)作为文心兰试管苗光源, 结果表明其地上部干、鲜重和试管苗的高度都有显著提高。另外田中道男等利用SILHOS 作为生菜组织培养光源, 获得了高质量的组织培养苗。目前LED是组织培养中最有效的人工照明光源，而CCFL等新型光源是未来发展的主要方向。 2.开放组织培养技术 传统的植物组织培养属于严格的封闭式培养，因而造成灭菌成本偏高、培养基易污染、外界环境调控难度大等缺点。而开放组织培养新技术是在外加抗菌剂的条件下，使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，在自然开放的有菌环境中进行，恰好弥补了这些不足。赵青华等采用开放式组培技术，在培养基中添加抑菌剂，克服了非灭菌条件下魔芋组织培养污染问题，有效地简化了实验步骤，降低了生产成本。何松林的研究表明在添加抗菌剂的开放式组培中，文心
第9卷 第1期2007年3月 衡水学院学报 J o u r n a l o f H e n g s h u i U n i v e r s i t y V o l.9,N o.1 Ma r.2007植物功能基因组学及其研究技术 崔兴国 (衡水学院 生命科学系,河北 衡水053000) 摘 要:植物基因组的研究已经由以全基因组测序为目标的结构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究.植物功能基因组学研究是利用结构基因组学积累的数据,从中得到有价值的信息,阐述D N A序列的功能,从而对所有基因如何行使其职能并控制各种生命现象的问题作出回答.近年来植物功能基因组学的研究技术主要包括表达序列标签、基因表达的系列分析、D N A微阵列和反向遗传学等.对植物功能基因组学的研究将有利于我们对基因功能的理解和对植物形状的定性改造和利用. 关键词:植物;功能基因组学;研究技术 中图分类号:Q3-3 文献标识码:A 文章编号:1673-2065(2007)01-0023-04 基因是细胞的遗传物质,决定细胞的生物学形状,细胞的生物学功能最终是由大量的基因表达完成的.随着人类基因组“工作框架图”的完成,生命科学研究的重点已经从结构基因组学转移到了功能基因组学的研究,特别是模式植物拟南芥(A r a b i d o p-s i s t h a l i a n a)和水稻(O r y z a s a t i v a)基因组测序的完成,公共数据库中已经积累了大量基因序列信息,获得了许多与植物发育相关的功能基因,在此基础上应用实验分析方法并结合统计和计算机分析来研究基因的表达、调控与功能,并相应诞生和发展了一批新的研究技术,为功能基因组学的研究提供了必要而有效的技术支撑.功能基因组学研究的最终目标是解析所有基因的功能,即从基因水平上大规模批量鉴定基因的功能,进而全面研究控制植物生长发育及响应环境变化的遗传机制,在基因组序列与细胞学行为之间起到桥梁作用,共同承担起从整体水平上解析生命现象的重任. 1 植物功能基因组学研究 植物的生长和发育是一个有机体或有机体的一部分形态建成和功能按一定次序而进行的一系列生化代谢反应的总合,反应在分子水平上,它要求相应的遗传代谢途径必须按照特定的时空次序严格进行以保证正常发育.植物功能基因组研究就是要利用植物全基因组序列的信息,通过发展和应用系统基因组水平的实验方法来研究和鉴别基因组序列的作用;研究基因组的结构、组织与植物功能在细胞、有机体和进化上的关系以及基因与基因间的调控关系;从表达时间、表达部位和表达水平3个方面对目的基因在植物中的精细调控进行系统研究.当前植物功能基因组学研究主要集中于一年生的拟南芥与水稻两个物种上,这主要是由于它们的遗传背景清楚,基因组较小,基因结构简单而且易于进行分子生物学操作.拟南芥研究组“2010计划”的宏伟目标是充分利用拟南芥基因组计划获得的序列信息并结合功能基因组研究技术来获知其25000个基因的全部功能,例如开花的诱导过程是植物生活周期中最奇妙的过程,目前从拟南芥中鉴定了提早开花和延迟开花的多种突变体,显示植物开花受多个遗传基因的控制,如延迟开花的两个突变体是由等位基因 C O(C O N S T A N S)和L D(C O L D L U M I N I D E P E N- D E N S)突变引起,这两个基因均已被克隆,并使其在转基因植物的叶片中进行表达,将C O基因转移到拟南芥中,高效表达C O蛋白的转基因植株即使处于短日照条件下也会开花,这说明C O基因具有激活开花基因的作用.对模式植物功能基因组的研究将有助于整个植物基因组学的研究. 目前的功能基因组研究主要包括以下几个方面:(1)c D N A全长克隆与测序;(2)获得D N A芯片 ①收稿日期:2006-10-12 作者简介:崔兴国(1963-),女,河北冀州市人,衡水学院生命科学系副教授.
基因沉默与RNAi技术 定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。 RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 基因沉默是一种RNA干扰技术。 RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA ，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex ，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制. 一、基因沉默的分类及其机制 （一）转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核 ＲＮＡ合成的失活， 它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： １．基因及其启动子甲基化 甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率 在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。［４］ 近来的研究表明，发生在转基因启动子５’端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３’端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。 ２．同源基因间的反式失活 反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种“沉默子”，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 ３．后成修饰作用导致的基因沉默 后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与
国内外苔藓植物组织培养研究进展 文章在对苔藓植物的特征及组织培养研究简史进行简要介绍的基础上，重点介绍了国内外学者对苔藓植物组织培养材料及基质的选择、外植体的消毒方法、培养基成分的选择及培养条件的筛选等4个方面的研究进展。 标签：苔藓植物；组织培养；消毒方法；培养基 苔藓植物是植物界中比较特殊的一个植物类群，主要生活在阴湿的环境中，是一类由水生向陆生过渡的重要的原始高等植物。苔藓植物生活史为典型的异型世代交替，孢子体则寄生于配子体上生活，孢子在产生新的配子体过程中还需要经过一个原丝体阶段。目前，全世界大约有2.3万种苔藓植物，其种类仅次于被子植物。 苔藓植物能够蓄积大量水分，因此对水土保持与涵养、森林及某些附生植物的发育都有极其重要的作用。此外，苔藓植物还含有脂类、萜类、黄酮类、生物碱、醌类等活性物质，因此具有极高的药用价值。 苔藓植物的组织培养历史可以追溯到1902年Haberlandt的研究和1905年Goebel等人的研究，此后的50余年时间内，科学家的关注点更多的集中于被子植物组织培养上，对苔藓植物的组织培养几无涉及。1957年，Allsopp利用石地钱和小叶苔的孢子进行组织培养，首次成功获得相应愈伤组织及再生叶状体。此后，世界范围内的关于苔藓植物组织培养的实验研究逐渐展开并取得了一定的成果。 1 苔藓植物组织培养供试材料及基质 目前，可以用于苔藓植物组织培养的材料主要是苔藓植物的配子体、孢子体和原丝体，此外还可以利用其生殖器官、芽孢、游离原生质体等。1960年，Ward 以Knudson培养基培养金发藓和波叶仙鹤藓的孢子并获得其无菌原丝体，并在添加了蔗糖的基本培养基中利用该无菌原丝体诱导获得了相应的愈伤组织及再生植株。2003年，高永超等利用牛角藓配子体茎段诱导获得相应愈伤组织，并探讨了蔗糖及大量元素对愈伤组织细胞生长的影响。2007年，于传梅利用膨叶唇藓苔和溪苔的叶状体、柳叶藓的茎段、短叶藓和江岸立碗藓的孢子进行组织培养，获得了相应的愈伤组织或再生植株。 2 苔藓植物组织培养供试材料的消毒 可用于苔藓植物外植体消毒的试剂包括乙醇、次氯酸钠、升汞等，不同的供试材料和不同部位的外植体所用消毒剂有所不同。Saboljevic等研究表明，适用于Aloina aloides孢子和配子体消毒的次氯酸钠浓度分别为120.00g·L-1和90.00g·L-1。于传梅（2007）研究表明，适用于膨叶唇藓苔和溪苔的叶状体消毒的试剂为0.1%次氯酸钠，消毒时间为5分钟。梁书峰（2010）研究表明，适用