基因敲除技术研究新进展 黄薇,严放北京大学医学部心血管研究所 gene knockout）技术是20世纪80年代发展起来的一门新技术。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚em cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学进展。基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人chi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了2 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除oxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 imizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统re的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。 实验室Cui[3]等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成组研究最先进的工具之一。 以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大动物更有益于某些繁琐的手术操作，同时血浆及组织样本量较大家介绍近两年来基因敲除技术在大动物模型上的突破及进展。 一、大鼠ES细胞基因打靶技术 ，大鼠的生理和药理特性与人类更相近，是研究人类疾病的一种重要动物模型，在心血管疾病和糖尿病等领域的作S细胞在体外难以长期维持自我更新，用传统培养方法无法获得具有生殖传代能力的大鼠ES细胞[5]。因此在过去二物模型远不及小鼠发展迅速。2010年Tong等[6]于《Nature》报道了p53基因敲除大鼠，这在基因敲除技术上又是
转基因研究的现状及发展 转基因作物是当今世界各国现代生物技术产业研究的热点，中国的转基因生物技术发展一、我国转基因作物的发展现状迅速，由于科学界对转基因作物对人类及生态环世界上最早的转基因作物诞生于年，是一境利与弊的争论，措政府应制定相应的政策、施对到种含有抗生素药类抗体的烟草。世纪年代，其进行安全管理。本文论述了转基因作物在国际农业生物技术已逐渐成为各国现代生物技术产业研国内的发展现状，分析了转基因作物对人类及生态环境的利与弊以及关于我国转基因作物安全管究的热点。 转基因技术的应用 1．在畜牧兽医中的应用 应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种，通过克隆特定基因组中的某些编码片段，对之加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组，如果转基因在宿主基因组能得以表达，那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力，或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。（其用于遗传育种，不仅可以加速改良的进程，使选择的效率提高，改良的机会增多，并且不会受到有性繁殖的限制。）例如Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊，获得的转基因动物抗病力明显提高；丘才良把一种寒带比目鱼抗冻基因成功地转移到大西洋鲑中，为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试。 2．在医学领域中的应用 用于生产药用蛋白用转基因动物的乳腺生产重组蛋白（乳腺生物反应器）可能是转基因动物的最大应用，这也是世界范围内转基因研究的热点之一。Swamdom （1992）用β-球蛋白的4个核酸酶I的高敏位点与人的两个基因相连，融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似。目前，把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注，不仅各国政府投资，一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。 3．转基因的应用存在的问题及展望 （1）转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达，影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高。 （2）难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。 （3）不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。 （4）制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键。 （5）对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。 当然，我们不能因为这些缺点的存在就否定转基因技术的研究价值。因为它作为一种新兴的生物技术，配合其他相关的生物技术将具有广阔的应用前景。随着这一技术日趋成熟，许多问题有望逐步得到解决。
生物与环境工程学院课程论文 转基因作物的研究进展 学生姓名：魏斌聪 学号：200806016139 专业/班级：生物工程081班 课程名称：生物工程原理 指导教师：陈蔚青教授 浙江树人大学生物与环境工程学院 2011年5月
转基因作物的研究进展 魏斌聪 （浙江树人大学生物与环境工程学院生工081班浙江杭州310015） 摘要：人们将所需要的外源基因(如高产、抗病虫害优质基因) 定向导入作物细胞中, 使其在新的作物中稳定遗传和表现,产生转基因作物新品种, 是大幅度提高作物产量的一项新技术。本文先描述了转基因作物的发展进程，对其基因问题的研究作了讨论，并列出转基因作物目前存在的主要问题并作分析，最后对此项技术作出展望。 关键词：转基因作物；DNA技术；基因导入；安全性 前言 转基因植物（transgenic plant），是指基因工程中运用DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期等提高其经济价值或实用价值。[ 1 ]其主要范围是在作物方面，如可食用的大豆、玉米等，或者可投入生产的棉花等作物。 从表面上看来，转基因作物同普通植物似乎没有任何区别，它只是多了能使它产生额外特性的基因。从1983年以来，生物学家已经知道怎样将外来基因移植到某种植物的脱氧核糖核酸中去，以便使它具有某种新的特性：抗除莠剂的特性，抗植物病毒的特性，抗某种害虫的特性。[ 2 ]这个基因可以来自于任何一种生命体：细菌、病毒、昆虫等。这样，通过生物工程技术，人们可以给某种作物注入一种靠杂交方式根本无法获得的特性，这是人类9000年作物栽培史上的一场空前革命。[ 3 ] 1 转基因作物的发展进程 转基因作物的研究最早始于20世纪80年代初期。1983年，全球第一例转基因烟草在美国问世。1986年，首批转基因抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1996年，美国最早开始商业化生产和销售转基因作物(包括大豆、玉米、油菜、
基因沉默研究进展 摘要：基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者表达减少的现象。基因沉默是基因表达调控的一种重要方式 ,是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制 ,在外源 DNA 侵入、病毒侵染和DNA 转座、重排中有普遍性。对基因沉默进行深入研究 ,可帮助人们进一步揭示生物体基因遗传表达调控的本质 ,在基因工程中克服基因沉默现象 ,从而使外源基因能更好的按照人们的需要进行有效表达;利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的表达 ,达到治疗疾病的目的 ,所以研究基因沉默具有极其重要的理论和实践意义[1]。 关键词：基因沉默，转录水平基因沉默，转录后水平基因沉默，病毒介导的基因沉默. 基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。一方面,基因沉默是遗传修饰生物(genetically modified organisms )实用化和商品化的巨大障碍 ,另一方面 ,基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应 ,为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略—RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance ,RMVR)[2～4]。 基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现。基因沉默主要发生在两种情况，一种是转录水平上的基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS） ,另一种是转录后基因沉默（post- transcriptional gene silencing, PTGS）。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是近几年发展起来的转录后基因阻断技术，RNAi在2002年被Science评为全球十大科技突破之一,作为一种在细胞水平的基因敲除工具,RNAi 正在功能基因组学领域掀起一场革命[5]。 一、基因沉默的分类及其机制 （一）、转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核RNA合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的RNA而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：1.基因及其启动子甲基化。2. 同源基因间的反式失活。 3. 后成修饰作用导致的基因沉默。 4. 重复序列。 5. 位置效应。 （二）、转录后水平基因沉默 转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳定转录，但在细胞质里却无相应稳定态mRNA存在的现象。与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂不可遗传性。目前发现主要有以下几种转录后水平基因沉默现象。1. 共抑制。2. 基因压制。3. RNA干扰。 二、植物基因沉默研究进展 基因沉默是普遍存在于植物界的一种防御反应．近年来,转录后水平上的基因沉默(PTGS)在植物中特别是在转基因植物中得到了广泛的研究.PTGS是植物的一种自然防御机制，是指基因能正常地转录，但所转录的mRNA在细胞质内积累量很低或根本检测不到．这是由于细胞核内转录mRNA进入细胞质后，与具
基因沉默 摘要随着基因技术的迅速发展和广泛应用，在转基因技术实践中首先暴露出来的外源基因不能按照预期设想进行表达的问题越来越显得普遍，而人们对基因沉默现象的不断深入研究和探索，不仅揭示出了基因沉默的发生机制，也在一定程度上推动了新技术的产生和应用，这不仅推动了基因研究领域的发展，更在遗传群体构建、疾病治疗等方面建立了新方法、新体系，为生物学技术的发展做出了贡献。 关键字基因沉默分类机理应用 1.引言 基因沉默（Gene Silencing），又称为基因沉寂，是真核生物细胞基因表达调节过程中的一种特殊生理现象，是指细胞基因在表达过程中受到各种因素的综合作用而导致基因部分区段发生“沉寂”现象，从而失去转录活性并不予表达或表达减少。该现象最先于1986年Peerbolte在转基因植物研究中所发现，随后科学家在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现了基因沉默现象的存在。 转基因沉默是基因沉默现象最为频发和常见的，这也是转基因为何在受体难以百分之百全部表达的因素之一，其基本特征是导入并整合到受体基因组的外源基因在当代或后代中表达活性受到抑制。研究发现，其主要原因是由于转基因之间或转基因与内源基因之间存在着序列同源性，因此转基因沉默又被称为同源性依赖的基因沉默（homology-dependent gene silencing）。 根据沃森-克里克的核酸碱基互补配对模型，基因沉默可能涉及到DNA-DNA、DNA-RNA以及RNA-RNA三种不同形式的核酸分子之间的互作，简单地说就是插入的外源DNA或自身基因区段在核内高浓度的RNA作用下，能够与内源反向DNA 或者RNA进行碱基互补配对，并且在核内被重新甲基化，进而导致基因沉默；而另一种可能则是内源基因与转基因转录生成的RNA之间互补配对生成可被RNases酶性降解的双链RNA（dsRNA），其水解直接导致基因的不表达，即基因沉默效果。从染色体水平上看，基因沉默现象的实质是形成异染色质（Heterochromation）的过程，检查发现被沉寂的基因区段往往呈现出高浓缩状态，显然，这在一定程度上也决定了被沉寂基因的难表达性。实验早已证明，在高度浓缩的基因区段，正常的DNA转录活动是难以进行并维持的，换言之，即一旦形成异染色质进入高度浓缩状态，那么相应区段的基因片段就必然因为不能被
兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16
基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、
作物转基因技术的研究进展 摘要：作为生物技术领域的前沿，转基因技术已在多种植物上取得重大进展。本文主要介绍了当前作物转基因技术的三大主流方法：农杆菌介导法、基因枪介导法和花粉管通道法，并阐述了这几种转基因技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆，甘薯等几种主要农作物的应用进展状况。 关键词：转基因技术、农作物、应用 Genetically Modified---转基因，简称GM，是指运用科学手段从某种生物体中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，再从结果中进行数代的人工选育，从而获得特定的具有变异遗传性状的物质。而其衍生出的转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的，即把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。 1983年比利时科学家Montagu 等人和美国Monsanto 公司Fraley等人分别将T- DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,获得了世界上第一株转基因植株———转基因烟草。自此之后，作物转基因技术得到了迅速发展.截至目前,几乎所有的作物都开展了转基因研究,育种目标涉及到高产、优质、高效兼抗性及多用途等诸多方面.一批抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂等转基因作物已进入商品化生产阶段. 国际农业生物技术应用服务组织2 月13 日在京发布的1 份报告显示，全球27 个国 家超过1800 万农民，2013 年种植转基因作物，种植面积比2012 年增加了500 万公顷。此外，首个具有耐旱性状的转基因玉米杂交品种亦于2013 年在美国开始商业化。 据该报告显示，全球转基因作物的种植面积于转基因作物商业化的18 年中增加了100 倍以上，从1996 年的170 万公顷增加到2013 年的1.75 亿公顷，其中美国仍是全球转基因作物的领先生产者，种植面积达7010 万公顷，占全球种植面积的40%。国际农业生物技术应用服务组织创始人兼荣誉主席、本年度报告作者Clive James 表示，目前排名前10 位的国家种植转基因作物的面积均超过100 万公顷，这为将来转基因作物的多样化持续发展打下了广泛基础。在种植转基因作物的国家中，有19 个为发展中国家，8 个为发达国家；发展中国家的种植面积连续2 年超越发达国家。 目前，作物遗传转化的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体法、低能离子束法、超声波介导法、显微注射法、花粉管通道法等.但在当前作物基因工程研究中,主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法,这三种转基因技术也相对较为成熟. 一、农杆菌介导法 农杆菌介导法是指农杆菌侵染植物时，受到植物受伤后释放的酚类物质的刺激，活化质粒上Vir 区基因的表达，将质粒上的另一段DNA（T-DNA）共价整合到植物基因组上，在植物体内表达而改变植物的遗传特性。农杆菌介导法的转化效率受众多因素影响，如农杆菌侵染外植体的影响因素、外植体再生能力的内在因素和环境条件（pH、温度和光照条件）等[32]，此法具有流程简单、仪器设备便宜、拷贝数低[33]，且基因沉默少，转移的基因片段长等优点。 农杆菌介导法是获得第一个转基因植物的方法，迄今为止，农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数85%，已成为植物基因转化首选方法。 二、基因枪介导法 基因枪法又称微弹轰击法，是将外源基因包裹在直径1~2 nm的钨或金颗粒表面，加速轰击植物外植体靶组织，穿过植物细胞壁和细胞膜而将外源基因带入植物细胞。因此，通过该方法进行DNA的转移过程不受外植体基因型的限制，可以将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原生质体中。 最早的基因枪是由美国Cornel 大学的Sanford 等在1987 年研制成功的。目前基因枪介
浅谈我国转基因水稻的研究(一) 论文关键词]水稻转基因论文摘要]稻转基因研究是国内外植物分子遗传学研究的热点之一。目前，水稻转基因研究在我国已取得显著进展。详细介绍转基因技术，并阐明我国转基因技术在水稻上的应用及研究进展， 水稻是我国的重要经济作物和粮食作物。水稻分布极其广泛，由于生态环境的复杂性和所处地理环境的影响，水稻在漫长的进化过程中，形成了极其丰富的遗传多样性，染色体组型和数目复杂多样，成为研究稻种起源、演化和分化必不可少的材料。 植物转基因技术是利用遗传工程手段有目的地将外源基因或DNA构建，并导入植物基因组中，通过外源基因的直接表达，或者通过对内源基因表达的调控，甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达，使植物获得新性状的一种品种改良技术。它是基因工程、细胞工程与育种技术的有机结合而产生的一种全新的育种技术体系。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的各种抗性或抗性相关基因转入水稻，进一步拓宽了水稻抗病基因源，为抗病育种提供了一条新途径。 一、国内外的转基因技术 转基因技术自20世纪70年代诞生以来，已经取得迅速的发展。到目前为止，中国已经是全球第4大转基因技术应用国。 转基因生物技术的应用，大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。中国是继美国之后育成转基因抗虫棉的第二个国家。现在河北省与美国孟山都合作育成33B抗虫棉（高抗棉铃虫、抗枯萎病、耐黄萎病）。由中国农科院生物中心、江苏省农科院导入Bt基因，由安徽省种子公司，安徽省东至县棉种场共同选育的抗虫棉“国抗1号”在安徽省已通过审定。国际水稻所将抗虫基因导入水稻，育成抗二化螟、纵卷叶螟的转基因水稻。中国农科院、中国农业大学、中国科学院、河南农科院等许多科研单位和高校将几丁质酶和葡聚糖酶双价基因导入小麦育成抗病转基因小麦、转基因烟草、转基因水稻等等。英国爱丁堡大学将水母发光基因导入烟草、芹菜、马铃薯等作物，获得发光作物，驱赶害虫。 至于油菜方面利用转基因工程培育雄性不育系及其恢复系的研究，亦取得了突破性的进展。比利时为了提高菜饼粗蛋白质的含量，将一种草控制的蛋白质基因转移到油菜上来，选出高蛋白质含量的转基因油菜品种。瑞典Svalow-Weibull等公司利用基因工程技术将外源基因导入甘蓝型油菜，培育成抗除草剂油菜新品种；比利时PGS公司采用基因工程手段创造出新的油菜授粉系统；法国应用原生质体融合技术将萝卜不育细胞质的恢复基因引入甘蓝型油菜，充分利用萝卜不育细胞质不育彻底的特性，实现了萝卜不育细胞质的三系配套，对推动全球杂交油菜育种具有革命性的影响。 二、我国转基因技术在水稻上的应用及研究进展 我国是农业超级国，因此，中国人吃饭问题的关键是水稻问题（高产和抗性问题），而水稻问题的核心便是转基因技术在水稻中的成功应用。 近年来，植物抗病毒基因工程的技术路线已趋向成熟，国内外相继开展了水稻东格鲁病、条纹叶枯病、黄矮病、矮缩病等8种病毒病的转基因育种研究，将各病原病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、编码结构或非结构蛋白基因干扰素CDNA等分别导入水稻，获得了抗不同病毒病的转基因株系或植株。在我国，转基因技术在水稻中的应用已经取得了惊人的成果。（一）转基因技术在提高水稻植株的抗Basra除草剂的成果 王才林等利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系“E32”，获得转基因植株。抗性鉴定表明，转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性；通过对转基因植株后代PCR分析，证实bar基因已整合到受体植株的基因组中，遗传分析表明，bar基因能在有性生殖过程中传递给后代，并在T代开始分离出抗性一致的稳定株系。段俊等利用转基因技术，
《细胞》：不依赖于RNAi的基因沉默机制被发现 来自瑞士日内瓦大学细胞生物学系的研究人员发现了一种不依赖于RNAi（RNA干扰）的基因沉默机制，这为进一步揭示生物体中基因沉默的多样化，以及功能作用提供了重要信息。这一研究成果公布在最新一期的《细胞》（Cell）杂志上。 RNA沉默存在两种既有联系又有区别的途径：siRNA(small interference RNA)途径和miRNA(microRNA)途径。siRNA途径是由dsRNA(double-stranded RNA)引发的，dsRNA被一种RNaseⅢ家族的内切核酸酶(RNA- induced silencing complex，Dicer)切割成21－26nt长的siRNA，通过siRNA指导形成RISC蛋白复合物(RNA-induced silencing complex)降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA沉默。而miRNA途径中miRNA是含量丰富的不编码小RNA(21－24个核苷酸)，由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构RNA(hairpin RNA，hpRNA)形成。miRNA同样可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物，可以结合并切割特异的mRNA而引发RNA沉默。尽管引发沉默的来源不同，但siRNA 和miRNA都参与构成结构相似的RISC，在作用方式上二者有很大的相似性。 在最近的一项研究中，来自加州大学河畔分校的研究人员发现了一种新的小RNAs分子，而这些小RNAs与近期的研究热点PIWI-interacting RNAs （piRNAs）和repeat-associated siRNAs (rasiRNAs）也不相同，这说明了小RNA家族和小RNA介导的基因调控远比之前预想的复杂。同样在这篇文章中，研究人员也发现基因沉默机制包含有多种途径，他们最新发现酿酒酵母中，反义RNA稳定（Antisense RNA Stabilization）能通过组蛋白去乙酰化引起转录基因沉默。在之前的研究中，酿酒酵母全基因组研究分析揭示出其转录本中包含了大量的反义RNA（antisense RNAs），以及由外切酶体元件（exosome component）Rrp6调控的基因间转录（intergenic transcripts）。通过进一步研究，瑞士的研究人员发现当缺失了Rrp6的功能后，两个PHO84反义转录就会变得稳定，并且抑制了PHO84基因的转录。有趣的是，研究人员在野生型中也发现了同样的现象：在时间性老化（chronological aging）的过程中Rrp6功能缺失也能稳定PHO84反义转录。上位性和染色质免疫共沉（Epistasis and chromatin immunoprecipitation）实验结果说明Rrp6功能的缺失与PHO84基因以及邻近基因的Hda1组蛋白去乙酰化的补充有关，但是组蛋白的去乙酰化受限于PHO84基因，这又说明Hda1活性依赖于反义RNA。因此敲除反义产物，即使是在缺失Rrp6的条件下也会阻碍PHO84基因抑制。这些数据表明反义转录的稳定通过不同于转录干扰的一种机制导致了PHO84基因抑制，而Rrp6功能调节则通过RNA依赖性表观遗传修饰调控基因。 基因沉寂 基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被称为“基因沉默”。基因沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉寂实际上是形成异染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态。 定义RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象。 原理基因沉寂需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白N端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰（由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又被称为'过度’甲基化修饰（Hypermethylation) ) 、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质（MBP）形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的N端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白N端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉寂”失去转录活性。 作用这个“原则”就是目前尚没有真正完全清楚的“组蛋白密码”（Histone Code)。能够
现代分子生物学 课程论文 题目基因敲除技术 班别生物技术10-2学号 10114040220 姓名陈嘉杰 成绩
基因敲除技术的研究进展 要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥?卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁?埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组 前言 基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。2004年该实验室Cui等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成为目前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。 1. 基因敲除技术简介 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.1 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了
基因沉默与RNAi技术 定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA 与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。 RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 基因沉默是一种RNA干扰技术。 RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA ，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex ，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制. 一、基因沉默的分类及其机制 （一）转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核 ＲＮＡ合成的失活， 它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： １．基因及其启动子甲基化 甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率 在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。［４］ 近来的研究表明，发生在转基因启动子５'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３'端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。 ２．同源基因间的反式失活 反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种"沉默子"，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 ３．后成修饰作用导致的基因沉默 后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。４．重复序列 外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基
基因敲除技术的最新进展 yunfenglin 干细胞与组织工程讨论版 【摘要】 自从上世纪80年代初的胚胎干细胞技术的成熟，在短短的20年里，关于基因敲除动物模型的报道呈几何数增长。现在的技术已经可以产生在时间和空间上都可以人为控制的，从点突变到染色体组大片段的删除和重排的各种基因突变小鼠，这样就可以让研究每个基因的具体功能成为可能。本文将首先简介基因敲除技术的技术背景、基本原理、基本步骤；然后将重点介绍现在基因敲除的常用策略及其利弊；接着将探讨基因打靶结果不理想的常见因素，包括基因背景、基因重复、基因补偿、和基因补充；最后介绍基因打靶技术的技术热点，包括组织特异性打靶、诱导性打靶。并探讨基因打靶技术在颌面外科的应用前景。 【关键词】基因敲除、条件性基因打靶、组织特异性基因打靶、诱导性基因打靶 技术背景 基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的[1]，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。所谓胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞[2]，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。[3] 基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术[4]。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。２０００年初的敲除了决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植排除了一道重要的障碍，展示了基因敲除技术的美好前景。 基本步骤 利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为： ａ．ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。c57BL／6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。[5,9,11] ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体[6,7]。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源
转基因动物技术应用研究进展 摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字：动物转基因技术；应用；展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,
水稻转基因育种研究进展 王彩芬,安永平,韩国敏,张文银,马 静 (宁夏农林科学院农作物研究所,宁夏永宁 750105) 摘要:对水稻转基因技术在抗虫、抗病、抗逆及改良米质等方面的进展进行了综述。 关键词:水稻; 转基因育种; 进展 中图分类号:S511.035.3 文献标识码:A 文章编号:1002-204X(2005)06-0055-03 20世纪下半叶以来,由于分子生物学研究的巨大成就,使生物学成为自然科学的带头学科,它的理论和方法已渗透到生命科学的许多领域,为生命科学的研究带来新的思维方式和研究手段。基因工程技术在植物遗传育种上应用很广泛,并取得了显著成就。 水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。据专家预测,到2025年在现有稻谷产量的基础上再增加60%才能满足需要(K hush,1995)。随着人口的增长和耕地面积的减少,世界尤其是我国将面临粮食问题的严峻挑战,培育优良品种是提高稻谷产量的主要途径。传统的育种技术已为培育水稻新品种做出了巨大贡献,并将在今后继续发挥主导作用,但由于品种资源的贫乏,单靠传统育种已很难有大的突破。基因工程技术为水稻分子标记辅助育种、水稻转基因育种提供了一条新途径。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的抗病、抗虫、抗除草剂、抗旱、耐盐、改善品质、提高产量等基因转入水稻,从而实现水稻种质创新和为生产提供优良品种。自1988年以来,国内外已得到了许多水稻转基因植株,涉及到抗虫、抗病、抗除草剂、抗旱、耐盐、改良品质等重要农艺性状,有些已进入田间试验和应用阶段。 1 水稻转基因育种进展 植物转基因育种是利用遗传工程的手段,有目的地将外源基因或DNA构建导入植物基因组,通过外源基因的直接表达,或通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达,使植物获得新的性状的一种品种改良技术。在植物分子生物学研究的众多材料中,水稻不仅是世界重要粮食作物,而且由于其基因组较小、重复序列较少的优点而成为一种重要的分子遗传学研究的单子叶模式植物,基因组测序已完成。自1988年首次获得转基因水稻以来,水稻转基因技术已获得突飞猛进的发展,目前已成功获得籼稻、粳稻、爪哇稻的转基因植物。随着基因枪转化技术的建立和根癌农杆菌介导转化法的成功,水稻基因转化技术日益完善。而且转移目标基因已从报告基因或筛选标记基因进入改良水稻抗性和适应性,以及改善品质,提高产量等重要基因的利用。 1.1 抗虫转基因水稻育种 水稻是虫害最多的大田作物,稻螟虫和稻飞虱危害最为严重,水稻中抗虫资源贫乏,转基因技术为抗虫品种的培育提供了一条新途径。自从1989年实现苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)抗虫基因转化水稻并得到再生植株以来,转抗虫基因水稻的研究取得了很大进展。转抗虫基因水稻包括转Bt基因、转蛋白酶抑制基因和转凝集素基因。在转Bt基因的研究方面,中国农科院生物技术中心杨虹等(1989)将Bt基因导入水稻品种台北309、中花8号的原生质体并获得再生植株;Fujim oto等(1993)通过电激法将cry LAb 基因导入水稻,首次报道了转Bt基因水稻对二化螟和稻纵卷叶螟的抗性。项友斌等(1999)利用农杆菌介导实现了苏云金杆菌抗虫基因cryI A(b)和cryI A(c)在水稻中的转化;黄健秋等(2000)利用农杆菌介导获得转(Bt)基因秀水11和春江11植株;薛庆中等(2002)利用农杆菌介导获得转双价抗虫基因(cryI Ac和豇豆胰蛋白酶抑制基因C pTI)浙大19植株;朱常香等(2002)获得Bt和X a21共转化水稻(C48)植株。近几年转Bt基因研究越来越多,进展很快,在籼稻、香稻、爪哇稻、杂交稻、深水稻中获得成功,选育出克螟稻1号、2号、3号(舒庆尧等,1998)。转Bt基因水稻在我国已进入环境释放阶段,有望培育出应用于生产的抗虫品种。 在转蛋白酶抑制剂基因水稻研究方面,通过电激介导原生质体转化,Xu等(1996)把豇豆胰蛋白酶抑制剂基因C pT i转入粳稻品种台北309,转基因植株对大螟和二化螟2种水稻虫害都具有抗性;通过基因枪介导马铃薯蛋白酶抑制剂基因PinⅡ转化水稻,Duan等(1996)获得了Nipponbare、台南67和Pi4等3个粳稻品种的抗大化螟转基因株系;Lee等(1999)利用PEG介导法将大豆K units胰蛋白酶抑制剂(SK TI)的cDNA转入粳稻Nagdongbyeo的原生质体,再生转基因植株的后代抗褐飞虱。曾黎琼等(2004)利用农杆菌介导将马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ)导入玉优1号、HT-7中;孔维文等(2004)利用农杆菌介导将PT A和马铃薯高赖氨酸蛋白基因(S B401)同时转入超级杂交稻亲本材料1826中。在转凝集素基因水稻研究中,主要是转雪莲花凝集素(G NA)基因,采用基因枪法,英国John Innes Centre(Maqbool等,1999;Rao等,1998;Sudhakar等,1998)把G NA基因导入AS D16、M5、M7、M12、FX92D、Basmati370等籼稻品种中,得到200多株转基因植株,G NA在水稻中呈高水平的组成性表达(用Ubi启动子)或韧皮部专一性表达(用Rssl启动子),转基因植株抗褐飞虱。在我国,傅向东等(1997)用G NA基因枪转化水稻IR72、IR76、珍汕97和秀水11等品种,部分转基因植株子代对褐飞虱有一定抗性;T ang(唐克轩等,1999)通过基因枪介导实现了G NA 基因和X a21基因的共转化,得到了转基因植株。唐克轩等(2003)利用农杆菌介导将半夏凝集素基因(pta)导入粳稻鄂宛105、中花12和籼稻E优532中,获得7个转基因纯系。 1.2 抗病转基因水稻育种 抗病转基因水稻包括转抗病毒基因、抗真菌病害基因和抗细菌病害基因。抗病毒转基因已开展了8种病毒的转基因研究,包括水稻通枯罗病毒(rice tungro disease)、水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged 收稿日期:2005-07-21 作者简介:王彩芬(1968-),女,副研究员,从事水稻花培育种研究。T el:0951-*******E-mail:caifen-68@https://www.doczj.com/doc/6317816819.html,