核酸分离纯化的总原则
核酸分离纯化的总原则主要包括以下几点：
1. 选择适当的提取方法：根据样品类型和目标核酸的特点选择合适的提取方法，如CTAB法、硅胶柱法、磁珠法等。
2. 去除污染物：通过选择合适的缓冲液和添加试剂来去除可能存在的污染物，如蛋白质、RNA、PCR抑制物等。
3. 确保纯化的选择性：选择合适的纯化方法来分离目标核酸，如凝胶电泳、柱层析、磁珠萃取等，使目标核酸与其他杂质分离。
4. 去除RNA和DNA降解酶：为了保护目标核酸的完整性和稳定性，在分离纯化过程中要避免使用RNase和DNase酶。
5. 确保纯化的高效性和高纯度：通过优化纯化条件和使用高质量纯化试剂来确保核酸的高效纯化和高纯度。
6. 储存和保存：纯化的核酸要储存和保存在合适的条件下，如使用低温冰箱或液氮保存，并注意避免冻融循环。
核酸的分离纯化技术 从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。 ④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。 （2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。 （3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似，而且分子量都十分大，所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。从DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶选
实验十六真核基因组DNA的分离纯化 核酸的分离与提取是分子生物学研究中最重要的基本技术之一，核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 核酸分离提取的原则 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；大多生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3'端带有Poly A 结构。 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核中，15%在细胞器中。 分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）；②排除蛋白质、脂类、糖类等其它分子的污染（纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如提DNA分子时，应去除RNA分子。） 为保证分离核酸的完整性及纯度，应尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各种不利因素对核酸的破坏，在实验过程中，应注意以下条件及要求：①减少化学因素对核酸的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；②减少物理因素对核酸的降解：强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些；③防止核酸的生物降解：细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构；DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性，而RNA酶，不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。 应用分子生物学技术分析基因组完整结构和功能，首先必须制备纯化的高分子量DNA，真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都可以用来制备DNA。 提取真核基因组DNA的方法由两部分组成：先温和裂解细胞及溶解DNA，使DAN与组蛋白分离，完整地以可溶形式独立分离出来，接着采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其它分子。 真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶K和去污剂温和处理法，为获得大分子量的DNA，避免物理操作导致DNA链的断裂，一般多采用后者温和裂解细胞。 去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80%甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得>200kb的DNA片段。 根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核染色体DNA。 方案一组织细胞DNA提取（酚抽提法） 【原理】 将分散好的真核生物组织、细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质。破坏细胞膜、核膜，SDS 可使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA能抑制细胞中DNase的活性，使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中，再用酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，（氯仿可除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡）得到的DNA溶液经乙醇沉淀进一步纯化，为获得高纯度DNA，操作中常加入RNase除去RNA，此法可获得100~200kb的DNA片段，适用于构建真核基因组文库，Southern blot分析。 【试剂】 1、组织细胞裂解液
·EDTA作用：抑制DNA酶活性，降低细胞膜稳定性SDS作用：降解细胞膜及乳化脂质蛋白质，使蛋白质变性，解聚和降解DNA酶 ·染色体DNA与质粒DNA分离原理：利用染色体DNA与质粒DNA变性复性差异，加碱后两者都变性再加酸质粒DNA分子小，可复性，在用酚抽提 ·PCR反应原理：依据DNA变性与复性原理，在模板DNA，引物和四种dNTP存在对的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反映，有变性—退火—延伸三个步骤 ·载体具备条件:能自主复制，具备筛选标记，具备多克隆位点，（拷贝数高，有较高遗传稳定性，分子量小，易于转化，配备与宿主细胞相适应的调控元件如启动子，增强子） ·引物设计原则：1两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列3′末端互补。2长度为18~40个核苷酸。3两条引物之间不应存在互补序列，避免形成引物二聚体。4引物的碱基组成应平衡。5引物的5′端可被修饰。 ·化学裂解法测序：原理1.用放射性核素标记待测DNA-侧链末端即3’末端 2.将标记DNA 分为G，A+G，C+T，C4个反应体系 3.用不同的化学试剂处理不同反应体系，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4.电泳分离，通过放射自显影可读出DNA序列 原核表达载体分为：非融合型表达载体，分泌型表达载体，融合蛋白表达系统 核酸分子杂交按作用方式可分为固相杂交（菌落原位杂交，斑点和狭缝杂交，southern印记杂交，northern印记杂交）液相杂交（吸附杂交，发光液相杂交，液相夹心杂交，复性速率液相杂交） OLA原理：野生型等位基因的DNA变性为单链DNA，等位基因特异探针和通用探针分别与之杂交，由于野生型等位基因特异探针与通用探针与靶序列完全互补，连接酶将它们连接成一条链，突变型等位基因通用探针与靶序列没有完全互补，因此连接酶不能将它们与通用探针连接起来。 信号放大技术检测方法：液相杂交检测方法，杂交捕获系统和支链DNA检测技术 遗传性疾病分子诊断：直接诊断策略，基因多态性连锁分析，基因突变的定量，基因表达分析，mRNA检测性 ·描述乳糖操纵子的正负调控：①结构：调节基因+启动子+操纵基因+结构基因；②负调控：无乳糖时：调节基因表达，形成诱惑性调节pro，并与操纵基因结合，阻止了转录；有乳糖时：调节基因表达，形成有活性调节pro，但有活性的四聚体在小分子物质的变构调节的作用下，失去活性，形成无活性的四聚体，无法与操纵基因结合，基因能顺利的转录；③正调控：低葡萄糖时，CAMP浓度↑，与CAP结合成CAMP-CAP复合物，结合在CAMP-CAP 位点，促进结构基因的转录；④要让乳糖操纵子表达的基础：高乳糖、低葡萄糖 ·质粒的特征：①结构：时环状超螺旋DNA分子；②自我复制；③质粒具有不相容性，不同的质粒里同一个子细胞，彼此竞争，只有一种质粒稳定存在；④可扩增性；⑤可转移性：质粒可以从一种宿主细胞导入另一种宿主细胞；⑥带有选择性标记：氨苄青霉素 ·蓝白斑筛选：在IPTG的诱导下，产生具有完整酶活性的β-半乳糖苷酶，将无色的X-gal 水解为蓝色产物，形成蓝色菌落，当外源基因插入La'Z基因的克隆位点，无α-互补能力，形成白色菌落，成为蓝白斑筛选 ·核酸的分离与纯化遵循的原则：①保持核酸一级结构的完整性；②尽可能提高核酸品质的纯度 ·核酸分离用酚抽提法，原理，以含EDTA，SDS，RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用PH8.0的Tris饱和分抽提获得DNA粗制品 ·核酸的纯化常用的方法：琼脂糖凝胶电泳法 ·A260/A280是什么标志：核酸纯度标志，纯DNA=1.8 纯RNA=2.0 ·核酸浓度的鉴定：紫外分光光度法（适用于浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液）：①核酸具有共轭双键，对波长260nm左右的紫外光有教强的吸收特性；②在波长260nm的读数，可
核酸分离纯化的技术原理 核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。 一、液相核酸分离纯化技术 （一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法 盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。含有DNA样本的水相可通
过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。 （二）碱性提取方法 碱裂解（alkaline lysis）主要用于质粒DNA的肠杆菌DNA提取。其基本原理是：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时沉淀下来。 （三）CTAB提取法 去污剂（表面活性剂）是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去污剂等多种类型，中性去污剂在蛋白提取中应用的较多。十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在
磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁（Magnet ic Silic a Partic le）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COO H）等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长 链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。 (2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。而p H 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。 (3) 酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。 2. 酶处理:在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。
核酸分离纯化方法 引言： 核酸分离纯化是分子生物学研究中常用的基础技术之一。通过分离纯化核酸可以获取高纯度的目标核酸样品，为后续的核酸分析和实验提供可靠的基础。本文将介绍几种常见的核酸分离纯化方法及其原理、步骤和应用。 一、酚/氯仿法 酚/氯仿法是最早用于核酸提取的方法之一，其基本原理是利用酚和氯仿的不同溶解度和密度，将核酸从其他细胞组分中分离出来。主要步骤包括细胞破碎、酚处理、氯仿处理和酒精沉淀等。该方法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中提取DNA或RNA。然而，酚/氯仿法存在操作危险性大、提取效果依赖于操作者经验等问题。 二、硅胶柱层析法 硅胶柱层析法是一种常用的核酸纯化方法，利用硅胶吸附核酸的特性实现核酸的分离纯化。该方法主要包括样品处理、硅胶柱处理和洗脱等步骤。硅胶柱层析法具有操作简便、纯化效果好、适用于各种核酸样品等优点，广泛应用于基因克隆、PCR扩增和测序等实验中。然而，硅胶柱层析法的纯化效果受到核酸长度和样品质量的影响。
三、离心管柱法 离心管柱法是一种基于离心技术的核酸分离纯化方法，其原理是利用离心管柱中填充的分离介质将核酸与其他杂质分离。该方法主要包括样品处理、离心管柱处理和洗脱等步骤。离心管柱法操作简单、纯化效果好、适用于多种核酸样品，被广泛应用于基因克隆、PCR 扩增和测序等领域。然而，离心管柱法的分离效果受到核酸长度和样品质量的影响。 四、凝胶电泳法 凝胶电泳法是一种常用的核酸分离纯化方法，可根据核酸的大小和电荷差异进行分离。该方法主要包括制备凝胶、样品处理、电泳和染色等步骤。凝胶电泳法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中分离DNA或RNA。然而，凝胶电泳法不能提供高纯度的核酸样品，常用于初步分析和检测。 五、商业化试剂盒法 随着分子生物学技术的发展，商业化试剂盒法逐渐成为核酸分离纯化的主要选择。商业化试剂盒包含了多种核酸纯化方法的关键试剂和耗材，操作简便、方便快捷。根据不同的试剂盒，可以选择合适的纯化方法。商业化试剂盒法适用于各种核酸样品，提供高纯度和高质量的核酸样品，广泛应用于基因克隆、PCR扩增和测序等研究领域。
第五章核酸的分离纯化 核酸分离纯化的原则: 保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度 DNA与RNA在分子大小、理化性质等方面不同分离方法存在差异。 DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象 DNA和RNA的分离与纯化技术是分子生物学研究中重要的基本技术。 核蛋白：核酸+蛋白质 DNP：DNA+蛋白质 RNP：RNA+蛋白质 第一节核酸分离纯化的设计及原则 （一）材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、 产量及浓度有不同的要求。 ?需考虑制备核酸所需的时间与成本 ?应选择安全的试剂与制备方案 （二）选择原则 1.保持核酸碱基序列的完整性 2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 二、技术路线的设计 （一）核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。
（二）核酸的分离与纯化 应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸最常用的方法 常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除 三、核酸的鉴定与保存 （一）核酸的鉴定 1.浓度鉴定 （1）紫外分光光度法： 核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。
核酸纯化的基本原理 一、引言 核酸纯化是分子生物学中的基本实验技术之一，其目的是从复杂的生物样品中分离出纯净的DNA或RNA。本文将介绍核酸纯化的基本原理，包括样品制备、裂解、分离和纯化等步骤。 二、样品制备 在进行核酸纯化前，需要对样品进行制备。通常情况下，细胞或组织需要先经过裂解处理，以释放出其中的DNA或RNA。不同类型的样品需要不同的处理方式。 1. 细胞裂解 对于细胞样品，可以通过机械破碎、超声波处理或化学裂解等方式进行裂解。其中机械破碎可以使用搅拌器、超高压均质器等设备；超声波处理则需要使用超声波震荡器；化学裂解则可以使用表面活性剂（如SDS）、蛋白酶K等试剂。 2. 组织裂解 对于组织样品，则需要更加复杂的处理方式。通常情况下，可以先将组织切成小片，并加入一定量的缓冲液中进行均质处理。此外，还可以使用琼脂糖酶、胰蛋白酶等消化酶进行裂解。
三、核酸分离 在完成样品制备后，需要将其中的DNA或RNA分离出来。这一步通常可以通过几种不同的方式进行。 1. 酚/氯仿法 这是一种经典的核酸分离方法，其基本原理是利用DNA/RNA与酚和氯仿之间的亲和性差异进行分离。首先将样品加入到含有等体积的酚/氯仿中，混合均匀后离心。此时，DNA/RNA会沉淀到水相中，而其他杂质则会留在有机相中。最后将水相取出即可。 2. 硅胶柱层析法 硅胶柱层析法是一种高效、可重复性好的核酸纯化方法。其基本原理是利用硅胶柱对DNA/RNA与其他物质之间的亲和性差异进行分离。首先将样品加入硅胶柱中，并使用缓冲液进行洗脱。随着缓冲液的逐渐增多，不同大小、不同极性的DNA/RNA会逐渐被洗出。 四、核酸纯化 在完成核酸分离后，需要对其进行纯化，以去除其中的杂质。这一步通常可以通过几种不同的方式进行。 1. 乙醇沉淀法 乙醇沉淀法是一种经典的核酸纯化方法。其基本原理是利用
核酸的分离原理 核酸的分离原理主要包括物理法和化学法两类。物理法包括电泳法、超离心法和温度梯度法；化学法包括酚-氯仿法、酒精沉淀法、盐沉淀法和硅基法等。以下将分别详细介绍这些分离原理。 一、电泳法： 电泳法是核酸分离中最常用的物理法，它的原理基于核酸的电荷特性。核酸在电场中的运动速度与其大小和形状相关。电泳法主要分为凝胶电泳、溶液电泳和毛细管电泳等。 凝胶电泳是将熔融状态下的琼脂糖或琼脂糖-琼脂糖乳胶混合物浇注在平板或离心管中凝固成胶状，然后将样品装入孔洞中，施加电场使核酸在胶状基质中移动。根据核酸的分子量大小，可以采用不同浓度的凝胶来进行分离。 溶液电泳是将核酸样品直接溶解于缓冲液中，然后直接进行电泳。这种方法在分离小分子核酸片段时非常常用。 毛细管电泳是将核酸样品注入毛细管中，然后利用电场进行分离。这种方法的优势在于分离速度快，分辨率高。 二、超离心法： 超离心法是通过离心作用，根据核酸在高速离心过程中的沉淀速度和分子量大小
的不同，来实现核酸的分离。该方法可分为差速离心和密度梯度离心两种。 差速离心是通过离心机产生离心力，使核酸按照沉淀速度的不同进行分离。这种方法可以根据核酸的分子量大小来调节离心时间和离心速度，进而实现分离。 密度梯度离心是通过在离心管中制备离心液，使其密度呈梯度分布。样品在离心过程中，根据核酸的密度与离心液的密度对比，核酸会沉淀在合适的密度梯度处，从而进行分离。 三、温度梯度法： 温度梯度法是一种物理分离方法，利用DNA在升温和降温过程中的变性和重绕特性实现核酸分离。样品经过热变性后，再经过慢降温或快速冷却，核酸会根据其序列和长度在一定温度范围内恢复特定的空间结构，从而进行分离。 四、酚-氯仿法： 酚-氯仿法是一种化学分离方法，通过DNA与酚和氯仿在酸性pH条件下形成两相体系，从而实现核酸的分离。酚主要是通过溶解蛋白质沉淀，而氯仿则用于去除酚。 五、酒精沉淀法： 酒精沉淀法是一种常用的化学分离方法，可以将核酸从溶液中沉淀。通过添加盐和酒精，可以改变核酸的溶解性，使其与溶液中的其他成分分离。
核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔（F.Miescher）在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼（R.Altmann）于1889年认识其酸性后，定名为核酸。 二、核酸的分类和功能 核酸分为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。 DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。 核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖（核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代）。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。 三、核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。 四、细胞裂解： （一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。 经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等）和盐（如Tris、EDTA、NaCl等）。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如NaCl）等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如GIT、GuHCl等）裂解的，该方法已经成为了RNA抽提的主流，却不是基因组DNA抽提的主流。 （二）细胞的裂解方法
RNA的分离与纯化 包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mR NA仅占1%～5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA 与mRNA上。 一、RNA制备的条件与环境 为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。 从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。 二、总RNA的分离与纯化 由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述 一、核酸的分离纯化技术 1.超声破碎法 超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。该方法操作简便，效果较好。 2.酚-氯仿提取法 酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。 3.离心沉淀法 离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。 4.配对离心法 配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。 二、核酸的鉴定技术 1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）
紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内 的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。根据核酸中含有的吸收波长为 260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。 2.电泳分析法 电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸 分离效应来分析核酸的方法。主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶 电泳两种方法。核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带 状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。 3.PCR（聚合酶链式反应） PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在 体外进行核酸的扩增以达到检测目的。PCR可用于快速检测目标DNA的存 在与否，以及定性和定量分析。 4.基因测序技术 基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指 二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。常用的 基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。 三、应用 核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子 生物学、基因工程和疾病诊断等领域。例如，通过核酸的提取和纯化技术，可以从患者的体液或组织中提取出DNA或RNA样品，用于检测患者的遗传 疾病或感染病原体的存在。此外，核酸的鉴定技术还可以用于DNA指纹鉴定、基因检测和基因表达分析等研究。
生物分子分离纯化的原理与技术路线生物分子分离纯化是现代生物科学研究的重要内容之一，它在 生命科学、医学、化学、农业等许多领域中发挥着重要应用。生 物分子分离纯化是指将某种复杂生物体系中的生物分子依据其特 定的物理化学性质从该体系中分离出来，进而纯化的过程。这一 过程需要基于分子的特性，结合各种理化技术手段，构建出相应 的技术路线，进而实现对生物分子的高效分离纯化。本文将详细 介绍生物分子分离纯化的原理与技术路线。 一、生物分子的特性 生物分子是一类由生物体内合成而成的，拥有特定结构的分子，包括蛋白质、核酸、多糖、脂质等，在代谢过程中发挥着极其复 杂的生物功能。不同的生物分子具有不同的物理化学性质，因此 对于不同类型的生物分子，选择不同的分离策略与纯化方法是很 有必要的。 二、生物分子分离的原理
常用的生物分子分离方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析、逆流层析、氢氧化铝纤维素膜过滤、高效液相色谱等。下面将对 其中几种方法进行详细介绍。 1、离子交换法 离子交换法是利用载有不同离子电荷的基质，将带有相反电荷 的生物大分子吸附并固定。离子交换基质的离子交换能力取决于 其离子化程度、离子交换基团的种类、柱子pH值等。因此，在进行离子交换分离时，应综合考虑这些因素，进而选择最合适的离 子交换柱。常用的离子交换柱包括阴离子交换柱、阳离子交换柱 和混合离子交换柱。离子交换法分离出来的生物分子具有较高的 纯度，但往往需要进行多次重复柱层析才能达到理想纯度。 2、凝胶过滤法 凝胶过滤是最常见也是最简单的生物分子分离方法，它是利用 凝胶颗粒的孔隙在生物分子样品中分子量大分子分离的方法。大 分子将通过直接流过凝胶颗粒填充层析柱时逐渐逼近凝胶颗粒的 空隙，并逐渐进行“筛分”，从而被分离并纯化。但凝胶颗粒的孔
12检验分子诊断学复习题 一、名词解释:(本大题共6小题，每小题3分，共计18分） 1、顺式作用元件 2、基因 3、probe 4．Western bloting： 5、PCR 6、分子克隆：. 7、基因诊断： 8、载体： 二、填空题：（每空格1分，共计20分) 1、基因芯片的基本步骤包括：、、和。 2、分子杂交是利用DNA 和这一基本性质来进行DNA 和RNA定性、定量分析的. 3、世界三大数据库分别为、和. 4、生命体中携带的基因信息在某一时段所表达的全部蛋白质称为。 5、在选择核酸的分离纯化方法，应遵循的总原则是:一是保证核酸( )；二是尽可能（）。 6、在PCR反应中，Mg++是个至关重要的因素，浓度(过低)会降低酶的活性,浓度（过高）又会导致非特异性扩增。 三、问答题： 1、简述印记技术的概念与特点、分类及应用. 2、。简述病毒基因组的一般特征 3、双脱氧法DNA测序原理 4、简述DNA芯片技术的应用。 5、简述核酸探针及其应用。 6、PCR引物的设计应遵循哪些原则,PCR技术的应用？ 7、简述Southern blotting 及主要步骤 8、简述PCR技术的基本原理及基本反应步骤。 9、简述核酸分子杂交的基本原理、类别和应用。 10、简述2—DE的基本原理与步骤. 四、单项选择题： 1．下列哪种物质在PCR反应中不能作为模板（) A．cDNA B。单链DNA C。RNA D。蛋白质E。双链DNA 2．Northern blotting 与Southern blotting 不同的是（) A.基本原理不同B。不需要进行限制性内切酶消化 C.探针必须是DNA D。探针必须是RNA E.靠毛细作用进行转移