核酸分离纯化方法
引言：
核酸分离纯化是分子生物学研究中常用的基础技术之一。通过分离纯化核酸可以获取高纯度的目标核酸样品，为后续的核酸分析和实验提供可靠的基础。本文将介绍几种常见的核酸分离纯化方法及其原理、步骤和应用。
一、酚/氯仿法
酚/氯仿法是最早用于核酸提取的方法之一，其基本原理是利用酚和氯仿的不同溶解度和密度，将核酸从其他细胞组分中分离出来。主要步骤包括细胞破碎、酚处理、氯仿处理和酒精沉淀等。该方法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中提取DNA或RNA。然而，酚/氯仿法存在操作危险性大、提取效果依赖于操作者经验等问题。
二、硅胶柱层析法
硅胶柱层析法是一种常用的核酸纯化方法，利用硅胶吸附核酸的特性实现核酸的分离纯化。该方法主要包括样品处理、硅胶柱处理和洗脱等步骤。硅胶柱层析法具有操作简便、纯化效果好、适用于各种核酸样品等优点，广泛应用于基因克隆、PCR扩增和测序等实验中。然而，硅胶柱层析法的纯化效果受到核酸长度和样品质量的影响。
三、离心管柱法
离心管柱法是一种基于离心技术的核酸分离纯化方法，其原理是利用离心管柱中填充的分离介质将核酸与其他杂质分离。该方法主要包括样品处理、离心管柱处理和洗脱等步骤。离心管柱法操作简单、纯化效果好、适用于多种核酸样品，被广泛应用于基因克隆、PCR 扩增和测序等领域。然而，离心管柱法的分离效果受到核酸长度和样品质量的影响。
四、凝胶电泳法
凝胶电泳法是一种常用的核酸分离纯化方法，可根据核酸的大小和电荷差异进行分离。该方法主要包括制备凝胶、样品处理、电泳和染色等步骤。凝胶电泳法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中分离DNA或RNA。然而，凝胶电泳法不能提供高纯度的核酸样品，常用于初步分析和检测。
五、商业化试剂盒法
随着分子生物学技术的发展，商业化试剂盒法逐渐成为核酸分离纯化的主要选择。商业化试剂盒包含了多种核酸纯化方法的关键试剂和耗材，操作简便、方便快捷。根据不同的试剂盒，可以选择合适的纯化方法。商业化试剂盒法适用于各种核酸样品，提供高纯度和高质量的核酸样品，广泛应用于基因克隆、PCR扩增和测序等研究领域。
结论：
核酸分离纯化是分子生物学研究中的关键步骤，选择合适的纯化方法对于后续实验的成功至关重要。酚/氯仿法、硅胶柱层析法、离心管柱法、凝胶电泳法和商业化试剂盒法是常用的核酸分离纯化方法，每种方法都有其特点和适用范围。在选择方法时，需要根据实验的具体要求和样品特性进行考虑。随着分子生物学技术的不断发展，核酸分离纯化方法也在不断改进和完善，为科研工作者提供更多选择和便利。
磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤 日期：2012-05-22 来源：互联网 标签：核酸纯化核酸分离磁珠法纯化DNA 摘要: 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 欢度大力神杯之夏，参与BRAND竞猜活动，获赠BRAND产品！ GeneCopoeia：qPCR mix免费试用体验活动开始！ 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 磁珠法纯化DNA原理 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性：排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。
核酸的分离纯化技术 从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。 ④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。 （2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。 （3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似，而且分子量都十分大，所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。从DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶选
1. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA原理是什么原理是什么原理是什么原理是什么？？？？乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。 最常用的阳离子：1）醋酸铵：贮存液10.0mol/L 终浓度 2.0~2.5mol/L 常用于减少多余的杂质（如DNTP及多糖）与核酸的共沉淀。例如在2mol/L醋酸铵存在的情况下连续两次DNA沉淀可从DNA制品中除去>99％的dNTP。在通过琼脂糖酶消化琼脂糖之后沉淀核酸时，使用醋酸铵也是最佳选择，这种阳离子可以减少寡糖消化产物共沉淀的可能性。然而若用沉淀的核酸进行磷酸化时，就不要用醋酸铵沉淀核酸，因为铵离子能够抑制T4噬菌体多核苷酸激酶。2）氯化锂：贮存液8.0mol/L 终浓度0.8mol/L 常用于需高浓度乙醇进行的沉淀（如沉淀RNA）。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。小分子RNA（如tRNA及5S RNA）在高离子强度下（没有乙醇时）是可溶的，而大分子RNA则不溶。可以利用这个差异在高浓度LiCl（0.8mol/L)中纯化大分子RNA。3）氯化钠：贮存液 5.0mol/L 终浓度0.2 mol/L （0.2 mol/L）用于DNA样品中存在SDS时。这种去污剂在70％乙醇中仍为可溶。4）醋酸钠：贮存液 3.0mol/L（ph5.2）终浓度0.3 mol/L （0.3mol/L，ph5.2）在DNA和RNA的常规沉淀中最为常用。 2. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀DNA的区别是什么的区别是什么的区别是什么的区别是什么？？？？ 异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，如二楼所讲，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。 异丙醇沉淀核酸：优点：为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。 乙醇沉淀核酸：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍. 缺点是总体积较大。需在-20度放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤 “蛋白质的变性”是指蛋白质分子中的次级键被破坏。主要是氢键和离子键。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。而引起蛋白质沉淀的原因一方面是由于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力，另一方面是因为这些有机溶剂是强亲水试剂，争夺蛋白质分子表面的水化水，破坏蛋白质胶体分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。
核酸分离纯化的技术原理 核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。 一、液相核酸分离纯化技术 （一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法 盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。含有DNA样本的水相可通
过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。 （二）碱性提取方法 碱裂解（alkaline lysis）主要用于质粒DNA的肠杆菌DNA提取。其基本原理是：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时沉淀下来。 （三）CTAB提取法 去污剂（表面活性剂）是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去污剂等多种类型，中性去污剂在蛋白提取中应用的较多。十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在
核酸分离纯化方法 引言： 核酸分离纯化是分子生物学研究中常用的基础技术之一。通过分离纯化核酸可以获取高纯度的目标核酸样品，为后续的核酸分析和实验提供可靠的基础。本文将介绍几种常见的核酸分离纯化方法及其原理、步骤和应用。 一、酚/氯仿法 酚/氯仿法是最早用于核酸提取的方法之一，其基本原理是利用酚和氯仿的不同溶解度和密度，将核酸从其他细胞组分中分离出来。主要步骤包括细胞破碎、酚处理、氯仿处理和酒精沉淀等。该方法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中提取DNA或RNA。然而，酚/氯仿法存在操作危险性大、提取效果依赖于操作者经验等问题。 二、硅胶柱层析法 硅胶柱层析法是一种常用的核酸纯化方法，利用硅胶吸附核酸的特性实现核酸的分离纯化。该方法主要包括样品处理、硅胶柱处理和洗脱等步骤。硅胶柱层析法具有操作简便、纯化效果好、适用于各种核酸样品等优点，广泛应用于基因克隆、PCR扩增和测序等实验中。然而，硅胶柱层析法的纯化效果受到核酸长度和样品质量的影响。
三、离心管柱法 离心管柱法是一种基于离心技术的核酸分离纯化方法，其原理是利用离心管柱中填充的分离介质将核酸与其他杂质分离。该方法主要包括样品处理、离心管柱处理和洗脱等步骤。离心管柱法操作简单、纯化效果好、适用于多种核酸样品，被广泛应用于基因克隆、PCR 扩增和测序等领域。然而，离心管柱法的分离效果受到核酸长度和样品质量的影响。 四、凝胶电泳法 凝胶电泳法是一种常用的核酸分离纯化方法，可根据核酸的大小和电荷差异进行分离。该方法主要包括制备凝胶、样品处理、电泳和染色等步骤。凝胶电泳法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中分离DNA或RNA。然而，凝胶电泳法不能提供高纯度的核酸样品，常用于初步分析和检测。 五、商业化试剂盒法 随着分子生物学技术的发展，商业化试剂盒法逐渐成为核酸分离纯化的主要选择。商业化试剂盒包含了多种核酸纯化方法的关键试剂和耗材，操作简便、方便快捷。根据不同的试剂盒，可以选择合适的纯化方法。商业化试剂盒法适用于各种核酸样品，提供高纯度和高质量的核酸样品，广泛应用于基因克隆、PCR扩增和测序等研究领域。
核酸提取的常见方法及原理 核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。 1、什么是核酸 核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。 核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。 DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。2、核酸提取类型 1、总RNA提取 总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。 2、miRNA提取 MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。 3、基因组DNA提取 进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。 在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。 4、质粒抽提 质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 3、核酸提取纯化原则和要求 1、保证核酸一级结构的完整性； 2、排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）； 3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4、其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 5、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。 提取方法（常规）： 1、总RNA提取 总RNA提取试剂盒 三氯甲烷1瓶 异丙醇1瓶 无水乙醇1瓶 无RNA酶枪头（1mL、200uL、10uL）各两盒、各一包 无RNA酶1.5mL离心管1包
核酸的提取 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为： 裂解细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 沉淀核酸 纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质 (一)DNA提取的经典方法 DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。 说明： 回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。 沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。 70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或8 RNA的提取 RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA 有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。
蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA 时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。 1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备 塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。 玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。 DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37℃浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1轕C于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。 2．RNA提取中RNase污染的控制 最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。 实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。 RN A提取方法 下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。 异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。 RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA 分子。 因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。
第五章核酸的分离纯化 核酸分离纯化的原则: 保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度 DNA与RNA在分子大小、理化性质等方面不同分离方法存在差异。 DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象 DNA和RNA的分离与纯化技术是分子生物学研究中重要的基本技术。 核蛋白：核酸+蛋白质 DNP：DNA+蛋白质 RNP：RNA+蛋白质 第一节核酸分离纯化的设计及原则 （一）材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、 产量及浓度有不同的要求。 ?需考虑制备核酸所需的时间与成本 ?应选择安全的试剂与制备方案 （二）选择原则 1.保持核酸碱基序列的完整性 2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 二、技术路线的设计 （一）核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。
（二）核酸的分离与纯化 应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸最常用的方法 常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除 三、核酸的鉴定与保存 （一）核酸的鉴定 1.浓度鉴定 （1）紫外分光光度法： 核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。
提取核酸细胞裂解液纯化柱 核酸是构成生物体遗传信息的重要分子之一，它的提取是进行分子生物学实验的基础步骤。而细胞裂解液和纯化柱则是核酸提取过程中必不可少的工具。本文将介绍核酸提取过程中细胞裂解液和纯化柱的作用及其使用方法，以帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。 一、细胞裂解液的作用和使用方法 细胞裂解液是将细胞内的核酸释放出来的重要试剂。它能够破坏细胞膜和核膜，使细胞内的DNA和RNA暴露于溶液中，便于后续的提取和纯化。细胞裂解液的配方多种多样，常见的包括SDS裂解液、裂解缓冲液等。 在使用细胞裂解液时，首先需要收集待提取核酸的细胞样品，如细菌、动物或植物细胞等。然后将样品加入细胞裂解液中，并进行充分混合。通常情况下，还需要对细胞裂解液进行离心处理，以去除细胞碎片和其他杂质。最后，收集上清液，其中含有核酸，可用于后续的纯化步骤。 二、纯化柱的作用和使用方法 纯化柱是用于提取和纯化核酸的一种常见工具。它能够通过特定的材料和结构，将混合溶液中的核酸与其他杂质分离开来，从而得到纯净的核酸样品。
使用纯化柱提取核酸的方法相对简单。首先，将待提取核酸的溶液样品加入纯化柱中，通常需要经过一系列的处理步骤，如添加试剂、洗涤和离心等。这些步骤能够在不同程度上去除杂质，并将目标核酸固定在纯化柱的材料上。然后，通过适当的缓冲液或溶剂，将纯净的核酸从纯化柱中洗脱出来，得到提取后的核酸样品。 三、细胞裂解液和纯化柱的选择 在进行核酸提取实验时，选择合适的细胞裂解液和纯化柱对于提取效果至关重要。不同类型的细胞裂解液和纯化柱适用于不同的样品和实验目的。例如，对于细菌细胞的提取，常使用SDS裂解液和硅胶纯化柱；而对于植物细胞的提取，则可能需要使用酚/氯仿裂解液和柱层析纯化柱。因此，在实验之前，需要根据样品的特性和实验要求，选择合适的细胞裂解液和纯化柱。 四、注意事项和常见问题解答 在进行核酸提取实验时，还需要注意一些重要的细节和常见问题。首先，应严格按照实验操作步骤进行，避免因操作不当而导致提取效果不佳。其次，注意细胞裂解液和纯化柱的保存条件和有效期，避免使用过期或贮存不当的试剂。另外，注意实验过程中的无菌操作，以防止细菌或其他污染物的污染。最后，如果在实验过程中遇到问题，可参考相关文献或咨询专业人士，寻求解决方案。 细胞裂解液和纯化柱在核酸提取中发挥着重要的作用。通过合理选
核酸的操作方法提取方式 核酸（nucleic acid）是生物体中的重要分子之一，包括DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。提取核酸的操作方法有多种，主要步骤包括样品预处理、细胞破碎、核酸溶解、纯化和测定。 1. 样品预处理： 样品预处理是提取核酸前的关键步骤，目的是为了去除干扰物质并保护核酸的完整性。常见的样品包括血液、尿液、组织等。样品预处理可以根据具体样品的特点选择相应的方法，如血液样品可以使用抗凝剂抽取血液并离心，组织样品可以冷冻保存或使用组织裂解液进行细胞破碎等。 2. 细胞破碎： 细胞破碎是提取核酸的关键步骤，目的是破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内核酸释放出来。常用的细胞破碎方法有物理方法和化学方法。物理方法包括振荡、高压破碎、超声波破碎等，化学方法包括酶解、碱裂解等。选择合适的方法应根据样品的特点和所需的核酸类型进行选择。 3. 核酸溶解： 细胞破碎后的溶液中含有核酸和其他的细胞组分，需要进行进一步的处理。首先将细胞碎片进行离心，沉淀废弃物质，获得上清液。然后，将上清液进行蛋白酶处理，以去除蛋白质。最后，使用一定的缓冲液或溶液使核酸溶解于其中，以便进行后续的纯化工作。
4. 核酸纯化： 核酸纯化是提取核酸过程中的关键步骤，常见的核酸纯化方法有有机相提取法、硅胶纯化法、树脂柱纯化法等。有机相提取法基于核酸在有机溶剂和水溶液之间的分配系数，通过多次萃取和相分离的步骤进行。硅胶纯化法利用硅胶的吸附性质，将核酸吸附到硅胶表面，再通过洗脱的步骤提取核酸。树脂柱纯化法则是利用树脂柱的特定亲和性，将核酸与其他杂质分离开来。选择合适的核酸纯化方法应根据实验的要求和核酸的特性来决定。 5. 核酸测定： 核酸提取完成后，需要对提取得到的核酸进行测定。常用的核酸测定方法有吸光法、电泳法、PCR等。吸光法可以通过核酸的吸光系数计算浓度，电泳法可以通过核酸在电场作用下的迁移距离计算分子大小，PCR则可以快速放大核酸片段以扩增数量。选择合适的核酸测定方法应根据实验的目的和需求来确定。 在核酸的提取过程中，需要注意一些操作要点，如在每个步骤中应保持样品洁净，避免受到污染。在细胞破碎的过程中，应根据样品的特点选择合适的破碎方法，避免核酸的降解和污染。在核酸纯化的过程中，应严格按照纯化方法的步骤和条件进行操作，确保获得纯净的核酸。 综上所述，提取核酸的操作方法包括样品预处理、细胞破碎、核酸溶解、核酸纯化和核酸测定等步骤。不同的样品和实验目的需要选择合适的方法和条件来进行
核酸提取及扩增技术原理简介 1核酸理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA可达10g/L，呈黏性胶体溶液，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 2细胞破碎 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 根据原理不同，细胞破碎主要包含机械破碎法，化学试剂法，酶溶解法。 1）机械方法：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp~>20kb之间，而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。 2）化学试剂法：经一定的pH 环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween 20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等）或强离子剂（异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍）而获得。而pH环境则由加入的强碱（NaOH）或缓冲液（TE、STE 等）提供。在一定的pH环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA 等）螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。 3）酶解法：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键，其在65 ℃及有EDTA、尿素（1~4mol/ L）和去污剂（0.5%SDS 或1%Triton X-100）存在时仍保留酶活性，这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。
核酸纯化的基本原理 一、引言 核酸纯化是分子生物学中的基本实验技术之一，其目的是从复杂的生物样品中分离出纯净的DNA或RNA。本文将介绍核酸纯化的基本原理，包括样品制备、裂解、分离和纯化等步骤。 二、样品制备 在进行核酸纯化前，需要对样品进行制备。通常情况下，细胞或组织需要先经过裂解处理，以释放出其中的DNA或RNA。不同类型的样品需要不同的处理方式。 1. 细胞裂解 对于细胞样品，可以通过机械破碎、超声波处理或化学裂解等方式进行裂解。其中机械破碎可以使用搅拌器、超高压均质器等设备；超声波处理则需要使用超声波震荡器；化学裂解则可以使用表面活性剂（如SDS）、蛋白酶K等试剂。 2. 组织裂解 对于组织样品，则需要更加复杂的处理方式。通常情况下，可以先将组织切成小片，并加入一定量的缓冲液中进行均质处理。此外，还可以使用琼脂糖酶、胰蛋白酶等消化酶进行裂解。
三、核酸分离 在完成样品制备后，需要将其中的DNA或RNA分离出来。这一步通常可以通过几种不同的方式进行。 1. 酚/氯仿法 这是一种经典的核酸分离方法，其基本原理是利用DNA/RNA与酚和氯仿之间的亲和性差异进行分离。首先将样品加入到含有等体积的酚/氯仿中，混合均匀后离心。此时，DNA/RNA会沉淀到水相中，而其他杂质则会留在有机相中。最后将水相取出即可。 2. 硅胶柱层析法 硅胶柱层析法是一种高效、可重复性好的核酸纯化方法。其基本原理是利用硅胶柱对DNA/RNA与其他物质之间的亲和性差异进行分离。首先将样品加入硅胶柱中，并使用缓冲液进行洗脱。随着缓冲液的逐渐增多，不同大小、不同极性的DNA/RNA会逐渐被洗出。 四、核酸纯化 在完成核酸分离后，需要对其进行纯化，以去除其中的杂质。这一步通常可以通过几种不同的方式进行。 1. 乙醇沉淀法 乙醇沉淀法是一种经典的核酸纯化方法。其基本原理是利用
核酸纯度的测定方法 核酸纯度是指样品中的核酸分子与杂质分子的比例。测定核酸纯度的主要目的是为了保证核酸样品的质量和用途。以下将介绍一些常见的核酸纯度测定方法。 一、比色法 比色法是通过对核酸样品吸光度的测定来确定核酸纯度的方法。核酸的吸光度与波长和浓度有关。正常情况下，核酸在260nm处有最大吸收峰，而蛋白质等杂质在280nm处有吸收峰。因此，通过测定核酸在260nm和280nm处的吸光度比值可以确定核酸纯度。一般来说，纯度在1.8-2.0之间的标本可以认为是较纯的。 二、凝胶电泳法 凝胶电泳法是一种将核酸样品在凝胶电场中分离的方法。核酸在凝胶中的迁移速度与分子大小和电荷有关。经过电泳分离后，可以通过染色或者紫外线照射检测核酸纯度。凝胶电泳法可以同时检测核酸纯度和分子量大小，是比色法无法获得的更加详细的信息。 三、比重梯度离心法 比重梯度离心法是一种复杂的核酸纯度测定方法，主要适用于某些高级别的分子生物学研究。该方法基于核酸分子在不同比重的梯度中离心分离的原理。根据核酸分子的密度，可以将其分离到不同比重的位置。并且可以通过在离心过程中检测样品的荧光强度来确定核酸浓度和纯度。该方法精度高，可检测出几乎所有污染物，但操作步骤繁琐，需要专业的设备和技能支持。 四、荧光显微镜法 该方法利用了核酸的荧光特性进行检测。利用核酸比色，荧光显微镜法能够非常快速地检测核酸，并且具有比色法和凝胶电泳法无法实现的能力。核酸分子可以通过结合有色干扰素之类的异物，在固定的荧光信息下显现出彩色或亮度差异。尽管荧光显微镜法效果较好，但由于成本和设备限制，其常被应用于研究核酸荧光探针，而不是作
为一种常见的核酸纯度测定方法。 总之，核酸纯度的测定方法有很多种，科学家们可以根据需求、设备的可用性和经费的限制选用最适合自己的方法。无论哪种方法，都需要认真操作和严格控制实验条件，以确保获得精确可靠的结果。
dsrna纯化方法 DSRNA纯化方法 引言： DSRNA（双链RNA）是一种由两条相互互补的RNA链组成的分子，具有广泛的应用前景，包括基因沉默、病毒防治和基因治疗等领域。然而，由于其结构的特殊性，DSRNA的纯化一直是一个具有挑战性的任务。本文将介绍一些常用的DSRNA纯化方法，以及它们的优缺点。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化法 聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的核酸分离和纯化方法。DSRNA可以通过电泳的方式在聚丙烯酰胺凝胶中进行分离和纯化。该方法的优点是简单易行，成本低廉，同时对于小分子量的DSRNA具有较好的分离效果。然而，对于大分子量的DSRNA，由于其较大的分子大小，容易在凝胶中聚集，导致难以得到较高纯度的产物。 二、硅胶柱层析纯化法 硅胶柱层析是一种常用的核酸纯化方法，通过利用硅胶柱上的亲水性特点，将杂质分离并纯化目标DSRNA。该方法的优点是纯化效果好，可得到较高纯度的DSRNA产物。此外，硅胶柱层析可以用于大规模的DSRNA纯化，适用于工业化生产。然而，硅胶柱层析方法的操作相对复杂，需要一定的实验技巧和经验，对于初学者来说可能存在一定的难度。
三、离心超滤纯化法 离心超滤是一种通过离心作用将DSRNA与杂质分离的方法。通过调整离心超滤装置的膜孔大小，可以选择性地分离不同分子量的DSRNA。该方法的优点是操作简单，纯化效果好，适用于大规模的DSRNA纯化。然而，离心超滤纯化方法对于DSRNA的产量有一定要求，如果DSRNA的产量较低，则可能无法得到足够的纯化产物。四、亲和层析纯化法 亲和层析是一种通过特定亲和剂与目标DSRNA之间的相互作用来实现分离和纯化的方法。例如，可以利用亲和剂与DSRNA中的特定序列结合，然后通过洗脱的方式将DSRNA纯化出来。亲和层析方法可以选择性地纯化目标DSRNA，得到较高纯度的产物。然而，该方法的亲和剂选择和合成需要一定的技术和成本支持，对于某些特殊的DSRNA结构，可能无法找到合适的亲和剂。 结论： DSRNA纯化是一项关键的实验步骤，对于后续的研究和应用具有重要意义。根据DSRNA的特殊结构，我们可以选择合适的纯化方法来实现高效、高纯度的DSRNA产物。聚丙烯酰胺凝胶电泳、硅胶柱层析、离心超滤和亲和层析是常用的DSRNA纯化方法，每种方法都有其独特的优点和适用范围。在实际应用中，我们应根据实验需求和条件选择最适合的纯化方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。
DNA提取原理和方法 样本处理是DNA提取的第一步，主要目的是将样本处理成适合提取DNA的形式。不同的样本需要不同的处理方法。例如，从动物组织中提取DNA时，可能需要粉碎组织样本，使得细胞更容易破碎，从而释放DNA。而从细菌培养液中提取DNA时，则需要先离心去除其他细胞组分，然后使用溶解酶破坏细胞壁。 细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一、细胞破碎的目的是释放DNA分子，使其能够在后续步骤中被分离和纯化。常见的细胞破碎方法包括机械破碎、化学破碎和酶解破碎。机械破碎是使用物理力量（例如，搅拌、磨碎、超声波等）来破坏细胞壁，从而释放细胞内的DNA。化学破碎是使用化学物质（例如，洗涤剂、酸、碱等）来破坏细胞壁和细胞膜，从而释放DNA。酶解破碎是使用特定酶（例如，蛋白酶、胰酶等）来降解蛋白质和核酸，从而破碎细胞。 核酸纯化是DNA提取的核心步骤，其目的是将DNA与其他细胞组分（如蛋白质、RNA、杂质等）分离。核酸纯化的方法有很多种，常见的包括酚-氯仿提取法、离心柱纯化法和磁珠纯化法。酚-氯仿提取法是最常用的DNA纯化方法之一、该方法先使用酚提取样品中的核酸，然后使用氯仿去除蛋白质。离心柱纯化法是使用离心管柱进行分离和纯化，其中DNA结合到离心柱上的固相载体上，而其他细胞组分则被洗脱。磁珠纯化法是使用表面被修饰的磁珠与DNA结合，并使用磁场来分离和纯化DNA。 DNA提取完成后，需要对提取得到的DNA进行测量。DNA的浓度和纯度测量是判断DNA质量的重要指标。常用的测量方法包括比色法、荧光分光光度法和凝胶电泳法。比色法是使用特定的染料与DNA结合，并通过比色读数来测量DNA的浓度。荧光分光光度法是使用荧光分光光度计来测量
蛋白和核酸的分离方法 1. 引言 蛋白质和核酸是生物体内两种重要的生物大分子，它们在细胞的功能调控、遗传信息传递以及疾病发生发展等方面起着关键作用。对于研究它们的结构、功能和相互作用，需要将其从复杂的细胞或组织中分离出来。本文将介绍几种常用的蛋白质和核酸的分离方法。 2. 蛋白质分离方法 2.1 离心法 离心法是一种简单且常用的蛋白质分离方法。通过利用不同蛋白质在离心过程中的沉降速度差异，可以将它们从混合物中分离出来。一般情况下，使用超速离心机进行操作。 2.2 凝胶电泳法 凝胶电泳法是一种基于蛋白质电荷和大小差异进行分离的方法。常见的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 •SDS-PAGE：通过添加表面活性剂SDS使蛋白质带有负电荷，然后根据蛋白质的大小差异进行分离。 •PAGE：不添加SDS，根据蛋白质的电荷和大小差异进行分离。 2.3 柱层析法 柱层析法是一种基于蛋白质在柱子中各种填料上的相互作用差异进行分离的方法。常见的柱层析方法有： •尺寸排除层析：根据蛋白质的大小差异进行分离。 •亲和层析：利用特定配体与目标蛋白之间的特异性结合进行分离。 •离子交换层析：根据蛋白质与填料之间的电荷差异进行分离。 3. 核酸分离方法 3.1 酚氯仿法 酚氯仿法是一种常用的核酸提取方法，适用于从细胞或组织中提取总核酸。其原理是利用酚和氯仿形成两相体系，使DNA或RNA从水相转移到有机相中，然后通过离心将核酸从有机相中分离出来。
3.2 硅胶柱层析法 硅胶柱层析法是一种常用的核酸纯化方法。通过将混合样品加入硅胶柱中，利用核酸与硅胶之间的亲和力差异进行分离。根据不同的条件和方法，可以选择性地分离DNA或RNA。 3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法也可以用于核酸的分离。与蛋白质的凝胶电泳类似，通过电场作用下核酸在凝胶中的迁移速率差异进行分离。 4. 结论 蛋白质和核酸的分离是生物学、生物化学等领域研究的基础工作。本文介绍了几种常用的蛋白质和核酸分离方法，包括离心法、凝胶电泳法和柱层析法等。这些方法各有优缺点，根据实验需要选择合适的方法进行操作。通过这些方法，可以高效地从复杂样品中提取纯化蛋白质和核酸，为后续的研究提供了可靠的基础。 参考文献： 1.王晓鹏, 李敬明. 生物化学实验技术[M]. 高等教育出版社, 201 2. 2.柴荣祖. 生物分离技术[M]. 化学工业出版社, 2005.