核酸的分离纯化技术
从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。
④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似，而且分子量都十分大，所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。从DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶选
择地破坏RNA，这是比较有效的方法，但使用的核糖核酸酶中常含有极微量的脱氧核糖核酸酶，必须事先加热处理除去，然后将纯净的核糖核酸酶与样品溶液一起在37℃孵育数分钟，就可达到破坏RNA的目的。②钙盐分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10体积10%的氯化钙溶液，使DNA与RNA均成为钙盐后，再利用DNA钙盐在2/10体积乙醇中能形成沉淀析出，RNA钙盐不形成沉淀而彼此分离。
③活性炭吸附：将处理好的活性炭按1/15～1/20体积加入每毫升含有0.5～1mgDNA溶液中，0～4。C下搅拌1h ，以31000×g离心1h，除去RNA后的DNA 回收率可达94%。
在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。在没有阴离子化合物存在下，以等体积90%苯酚水溶液反复抽提RNA，可以除去绝大部分DNA。此外，也可采用加入脱氧核糖核酸酶处理，破坏DNA，或参考上述DNA 与RNA分离方法将DNA除去。
（4）同类核酸的分离
①RNA混合物的分离：经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时，多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。例如tRNA与rRNA的分离用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化钠溶液洗脱，或用蔗糖梯度（顶部5%浓度，底部20%浓度）离心法分开。mRNA的代谢速度较快，在细菌中平均寿命为90min，在哺乳动物中约为几小时至十几小时，常用密度梯度离心法和DNA-琼脂柱进行分离。制备rRNA时，由于共沉作用，常混有mRNA，一般可用萘-1，5-二磺酸处理，使二者分开。各种tRNA的提纯，通常采用逆流分溶法在磷酸缓冲液-甲酰胺-异丙醇系统下进行，分离效果较好。
②DNA混合物的分离：主要是变性或降解的DNA和天然的分离，常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析，逆流分溶，梯度离心等方法。一个具有生物活性高度提纯的DNA制品应具有如下标准：不含有蛋白质及多糖；不含有可透析的小分子杂物；在pH7时紫外吸收最大值在257～261μm之间，E（P）在6600左右；不含有RNA；固体为纤维状，水溶液具有高的粘度并有流动双折射作用；具有电泳均一性及超离心中单分散性；具有生物活性。
1. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA原理是什么原理是什么原理是什么原理是什么？？？？乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。 最常用的阳离子：1）醋酸铵：贮存液10.0mol/L 终浓度 2.0~2.5mol/L 常用于减少多余的杂质（如DNTP及多糖）与核酸的共沉淀。例如在2mol/L醋酸铵存在的情况下连续两次DNA沉淀可从DNA制品中除去>99％的dNTP。在通过琼脂糖酶消化琼脂糖之后沉淀核酸时，使用醋酸铵也是最佳选择，这种阳离子可以减少寡糖消化产物共沉淀的可能性。然而若用沉淀的核酸进行磷酸化时，就不要用醋酸铵沉淀核酸，因为铵离子能够抑制T4噬菌体多核苷酸激酶。2）氯化锂：贮存液8.0mol/L 终浓度0.8mol/L 常用于需高浓度乙醇进行的沉淀（如沉淀RNA）。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。小分子RNA（如tRNA及5S RNA）在高离子强度下（没有乙醇时）是可溶的，而大分子RNA则不溶。可以利用这个差异在高浓度LiCl（0.8mol/L)中纯化大分子RNA。3）氯化钠：贮存液 5.0mol/L 终浓度0.2 mol/L （0.2 mol/L）用于DNA样品中存在SDS时。这种去污剂在70％乙醇中仍为可溶。4）醋酸钠：贮存液 3.0mol/L（ph5.2）终浓度0.3 mol/L （0.3mol/L，ph5.2）在DNA和RNA的常规沉淀中最为常用。 2. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀DNA的区别是什么的区别是什么的区别是什么的区别是什么？？？？ 异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，如二楼所讲，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。 异丙醇沉淀核酸：优点：为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。 乙醇沉淀核酸：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍. 缺点是总体积较大。需在-20度放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤 “蛋白质的变性”是指蛋白质分子中的次级键被破坏。主要是氢键和离子键。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。而引起蛋白质沉淀的原因一方面是由于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力，另一方面是因为这些有机溶剂是强亲水试剂，争夺蛋白质分子表面的水化水，破坏蛋白质胶体分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。
动物组织中核酸的提取与鉴定 一、原理 根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。 二、试剂 1.地衣酚（orcinol）试剂： 称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。 2.二苯胺试剂： 称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内保存备用。 3. 0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸），250ml； 4. 1mol/L氯化钠溶液，250ml； 5. 95%乙醇（冷）； 6. 氯仿； 7. 异戊醇 三、器材 a)冷冻离心机（3000rpm） b)组织捣碎机或组织匀浆器 c)不锈钢剪刀 d)冰浴 e)试管、试管夹 f)量筒、吸管 g)带塞比色管、带塞离心管
h)玻棒、烧杯 i)电炉等 三、方法 1. 制匀浆 将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl 溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。 将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。 2. 核酸的抽提 2.1RNA的提取 0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。 用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。 2.2DNA的抽提 将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以3000rpm离心20min，弃去沉淀，将其上清液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min，离心20min。将其上清液加入2倍体积的冷95%乙醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状DNA就缠绕在玻棒上待定性。 每次都需采用冷冻离心。 3. 定性试验 3.1RNA的呈色反应
核酸分离纯化的技术原理 核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。 一、液相核酸分离纯化技术 （一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法 盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。含有DNA样本的水相可通
过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。 （二）碱性提取方法 碱裂解（alkaline lysis）主要用于质粒DNA的肠杆菌DNA提取。其基本原理是：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时沉淀下来。 （三）CTAB提取法 去污剂（表面活性剂）是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去污剂等多种类型，中性去污剂在蛋白提取中应用的较多。十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在
核酸提取的常见方法及原理 核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。 1、什么是核酸 核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。 核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。 DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。2、核酸提取类型 1、总RNA提取 总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。 2、miRNA提取 MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。 3、基因组DNA提取 进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。 在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。 4、质粒抽提 质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 3、核酸提取纯化原则和要求 1、保证核酸一级结构的完整性； 2、排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）； 3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4、其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 5、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。 提取方法（常规）： 1、总RNA提取 总RNA提取试剂盒 三氯甲烷1瓶 异丙醇1瓶 无水乙醇1瓶 无RNA酶枪头（1mL、200uL、10uL）各两盒、各一包 无RNA酶1.5mL离心管1包
核酸的提取 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为： 裂解细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 沉淀核酸 纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质 (一)DNA提取的经典方法 DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。 说明： 回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。 沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。 70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或8 RNA的提取 RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA 有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。
蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA 时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。 1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备 塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。 玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。 DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37℃浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1轕C于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。 2．RNA提取中RNase污染的控制 最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。 实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。 RN A提取方法 下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。 异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。 RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA 分子。 因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。
第五章核酸的分离纯化 核酸分离纯化的原则: 保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度 DNA与RNA在分子大小、理化性质等方面不同分离方法存在差异。 DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象 DNA和RNA的分离与纯化技术是分子生物学研究中重要的基本技术。 核蛋白：核酸+蛋白质 DNP：DNA+蛋白质 RNP：RNA+蛋白质 第一节核酸分离纯化的设计及原则 （一）材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、 产量及浓度有不同的要求。 ?需考虑制备核酸所需的时间与成本 ?应选择安全的试剂与制备方案 （二）选择原则 1.保持核酸碱基序列的完整性 2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 二、技术路线的设计 （一）核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。
（二）核酸的分离与纯化 应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸最常用的方法 常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除 三、核酸的鉴定与保存 （一）核酸的鉴定 1.浓度鉴定 （1）紫外分光光度法： 核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。
一、分离与纯化的方法 双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子，可用于重现犯罪现场和进行古生物学分析。但由于是很长的线性分子（如人的染色体DNA平均长度为100～150Mb）而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。在溶液中，由于碱基堆砌力的相互作用与磷酸基团的静电排斥作用，DNA分子非常粘稠，沉淀后很难溶解，而且也增加了它对剪切力的敏感性。即便是最轻柔的方式，高分子量的DNA也很容易因剪切力发生横向的断裂。常规方法分离基因组DNA时，大于150kb的DNA分子很容易发生断裂。 （一）酚抽提法 本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改进，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA 样品。其中，EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DN A酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性；SDS为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质，与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀，其非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性、解聚，所以SDS同时还有降解DNA酶的作用；无DN A酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，也有裂解细胞的作用；酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。多次抽提可提高DNA的纯度。一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀处理常以醋酸铵为盐类，用2倍体积的无水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗涤，最后得到的DNA大小在100kb～150kb。运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10mg至大到数百mg的DNA样品。由于分离纯化的每一步都有剪切力的影响，最后得到的DNA样品中分子量超过100kb～150kb的很少，但这种大小的DNA足以作为PCR反应的模板和进行Southern blotting分析以及构建以λ噬菌体为载体的基因组DNA文库。从5×107个培养的非整倍体哺乳动物细胞（如HeLa细胞）大约可以制备分子量在100kb～150kb的DNA 200mg，自20ml血液可得250mg。 （二）甲酰胺解聚法 为构建高容量载体的DNA文库和进行分子量巨大的DNA片段的脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分析，需要制备分子量大于200kb的DNA。该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性。但甲酰胺对蛋白酶K的活性无显著影响。本法因操作步骤少，尤其省却了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于200kb。 （三）玻棒缠绕法 缠绕法适于同时从不同的细胞或组织标本中提取DNA。与前两个方案不同，它有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀于细胞裂解液与乙醇液的交界面；二是要将沉淀的DNA缠绕于带钩玻棒上。通过带钩玻棒将高分子量DNA沉淀从乙醇溶液中转移到pH8.0的TE溶液重溶。小的DNA片段与RNA不能有效形成凝胶状线卷。该方案以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量只有大约80kb，不能有效构建基因组DNA文库，但用于Southern杂交和PCR反应可以获得很好的结果。 （四）DNA样品的进一步纯化 纯化的方法包括透析、层析、电泳及选择性沉淀等。其中电泳法简单、快速、易于操作、分辨率高、灵敏度好、易于观察及便于回收，在DNA的进一步纯化中占有重要的地位。由于聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）与琼脂糖凝胶（agarose gel）可以制成各种形状、大小和孔径不一的支持体，并可以在多种装置中进行电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与琼脂糖凝胶电泳（AGE）广泛用于核酸的分离、纯化与鉴定。 二、DNA片段的回收 通过凝胶电泳，我们可以对各种大小与来源的DNA片段进行分离、纯化与鉴定。目前，琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶是最常使用的电泳支持体，电泳分离的DNA处于凝胶的三维网状结构中。下面介绍从琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的主要方法。 （一）总的原则与要求 无论采用何种方法从何种支持介质中回收DNA片段，都要注意两个原则。一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA 样品中的污染。回收的DNA样品往往因支持介质的不纯、回收溶液的使用及不慎操作等因素而引入污染，这些污染可能严重影响后继的实验。根据实验要求，应对回收的DNA样品进行纯化，以除去污染物。常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化
核酸的理化性质及应用 核酸是一类含有大量核苷酸单元的生物大分子，在细胞中起着重要的生物学功能。核酸分为两类：脱氧核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。下面我将介绍核酸的理化性质及应用。 一、核酸的理化性质： 1. 化学成分：核酸由核苷酸单元组成，单个核苷酸由一个五碳糖（脱氧核糖或核糖）、一个含氮碱基和一个磷酸基团组成。 2. 结构：DNA是由两条互补的链以双螺旋结构排列而成，RNA是以单链形式存在。DNA的碱基对是按照互补规则特异性配对的，腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间有两个氢键相连，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间有三个氢键相连，保持了DNA分子的稳定性。 3. 酸碱性：核酸是一种多酸性物质，可与碱性染料结合。通过电泳技术可将核酸分离，由于核酸是多酸性的，具有负电荷，在电场中可被迁移，从而实现其分离和纯化。 4. 稳定性：由于DNA中的碱基对通过氢键相连，DNA分子具有较高的稳定性，可在适宜条件下长期储存。
二、核酸的应用： 1. 遗传学研究：核酸是遗传物质的重要组成部分，在遗传学研究中发挥着关键作用。通过对DNA或RNA的序列进行分析，可以揭示生物个体之间的遗传差异，并研究基因与功能的关系。例如，人类基因组计划（Human Genome Project）使用DNA测序技术对人类整个基因组进行了测序，从而为深入研究人类遗传学奠定了基础。 2. 诊断医学：核酸在疾病诊断中的应用日益重要。通过PCR（聚合酶链式反应）技术可以在体液或组织中检测到微量的病原体DNA或RNA，从而实现病原体的快速检测和诊断。例如，在新冠疫情中，核酸检测成为最常用的方法之一。 3. 基因工程：核酸在基因工程领域具有重要应用。通过将外源DNA或RNA导入细胞中，可以实现基因的插入、删除或替换，从而实现基因改造或修复。这种技术在生物技术、农业、医学等领域中有着广泛的应用，如转基因作物的培育、基因治疗等。 4. 疾病治疗：核酸药物被广泛应用于疾病的治疗。例如，RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）可以通过注射外源小干扰RNA（siRNA）来沉默或抑制特定基因的表达，从而实现基因沉默治疗。这种技术在癌症治疗、遗传病治疗等领域有着巨大的潜力。
提取核酸细胞裂解液纯化柱 核酸是构成生物体遗传信息的重要分子之一，它的提取是进行分子生物学实验的基础步骤。而细胞裂解液和纯化柱则是核酸提取过程中必不可少的工具。本文将介绍核酸提取过程中细胞裂解液和纯化柱的作用及其使用方法，以帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。 一、细胞裂解液的作用和使用方法 细胞裂解液是将细胞内的核酸释放出来的重要试剂。它能够破坏细胞膜和核膜，使细胞内的DNA和RNA暴露于溶液中，便于后续的提取和纯化。细胞裂解液的配方多种多样，常见的包括SDS裂解液、裂解缓冲液等。 在使用细胞裂解液时，首先需要收集待提取核酸的细胞样品，如细菌、动物或植物细胞等。然后将样品加入细胞裂解液中，并进行充分混合。通常情况下，还需要对细胞裂解液进行离心处理，以去除细胞碎片和其他杂质。最后，收集上清液，其中含有核酸，可用于后续的纯化步骤。 二、纯化柱的作用和使用方法 纯化柱是用于提取和纯化核酸的一种常见工具。它能够通过特定的材料和结构，将混合溶液中的核酸与其他杂质分离开来，从而得到纯净的核酸样品。
使用纯化柱提取核酸的方法相对简单。首先，将待提取核酸的溶液样品加入纯化柱中，通常需要经过一系列的处理步骤，如添加试剂、洗涤和离心等。这些步骤能够在不同程度上去除杂质，并将目标核酸固定在纯化柱的材料上。然后，通过适当的缓冲液或溶剂，将纯净的核酸从纯化柱中洗脱出来，得到提取后的核酸样品。 三、细胞裂解液和纯化柱的选择 在进行核酸提取实验时，选择合适的细胞裂解液和纯化柱对于提取效果至关重要。不同类型的细胞裂解液和纯化柱适用于不同的样品和实验目的。例如，对于细菌细胞的提取，常使用SDS裂解液和硅胶纯化柱；而对于植物细胞的提取，则可能需要使用酚/氯仿裂解液和柱层析纯化柱。因此，在实验之前，需要根据样品的特性和实验要求，选择合适的细胞裂解液和纯化柱。 四、注意事项和常见问题解答 在进行核酸提取实验时，还需要注意一些重要的细节和常见问题。首先，应严格按照实验操作步骤进行，避免因操作不当而导致提取效果不佳。其次，注意细胞裂解液和纯化柱的保存条件和有效期，避免使用过期或贮存不当的试剂。另外，注意实验过程中的无菌操作，以防止细菌或其他污染物的污染。最后，如果在实验过程中遇到问题，可参考相关文献或咨询专业人士，寻求解决方案。 细胞裂解液和纯化柱在核酸提取中发挥着重要的作用。通过合理选
生物大分子的分离和纯化技术生物大分子是指具有较大分子量的生物分子，如蛋白质、核酸、多糖等。要研究这些生物大分子的结构和功能，需要对它们进行 分离和纯化。生物大分子的分离和纯化技术是生物学和生物工程 学中的重要内容，它们的发展和应用使得我们能够更深入地了解 生命的奥秘，同时也推动了医药、农业、工业等领域的发展。 生物大分子的分离和纯化需要经过多个步骤，这些步骤通常包 括细胞破碎、分子分离、分子鉴定等。其中，分子分离是最基本、最关键的步骤之一，它可以使得目标分子从复杂混合物中被分离 出来，并得到相对纯度较高的产物。目前，生物大分子的分离和 纯化技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、尺寸排 除层析、逆向相色谱层析和高效液相色谱层析等方法。 凝胶过滤层析是一种基于分子尺寸差异的分离方法。在这种方 法中，样品被加入到一列凝胶柱中，较大的分子无法穿过凝胶孔隙，而较小的分子则可以顺着凝胶孔隙通过。因此，随着溶液通 过凝胶柱，不同大小的分子会被分离出来。这种方法适用于大小 分子差异较大的生物大分子的分离。
离子交换层析是基于分子电荷的分离方法。在这种方法中，一 种带有正电荷或负电荷的树脂被用来吸附目标分子，通过控制溶 液的pH和离子强度等参数，可以使得目标分子从树脂上逐渐被洗下来。这种方法适用于分子之间的电荷差异较大的生物大分子的 分离，如蛋白质。 亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。在这种方法中， 一种特殊的树脂被用来吸附具有特定结构或性质的目标分子。例如，可以将某种亲合剂固定在树脂上，然后用于吸附与该亲合剂 有特异结合关系的目标分子。这种方法适用于具有高度特异性活 性的生物大分子的纯化。 尺寸排除层析是一种基于分子形状的分离方法。在这种方法中，一种具有多孔性的材料被用来吸附目标分子，具有大分子尺寸和 形状的目标分子沿着孔隙穿过，而具有小分子尺寸的分子则通过 孔隙空隙。这种方法常用于分离蛋白质和糖类等生物大分子。 逆向相色谱层析是一种基于亲水性的分离方法。在这种方法中，一种特殊的树脂被用来吸附目标分子，通过控制溶液中离子强度、有机溶剂浓度等参数，可以使得目标分子从树脂上逐渐被洗下来。这种方法适用于极性分子的分离。
生物分子的分离和纯化技术生物分子的分离和纯化是生命科学研究中不可或缺的一环，也是许多生物医学应用和生产工艺的核心。分子的分离和纯化技术包括多种方法，其基本原理是利用不同的物理和化学性质，将混合系统中的各个分子分离开来。 生物分子的分离和纯化技术通常是从含有目标分子的组织或细胞裂解液中开始的。通常，该液体首先要通过离心等手段除去细胞碎片、核酸、脂质和其他杂质。接下来，可以利用不同的分离和纯化技术分离和纯化目标分子。下面将介绍几种通用的分子分离和纯化技术。 1.凝胶过滤chromatography 凝胶过滤chromatography是一种分子分离技术，通常用于分离分子量不同时的生物大分子。凝胶过滤chromatography基于分子体积的大小，通过孔径大小选择分子的峰值通过孔径大小选择分子的峰值。较大分子通常沿着填充体的较周折的路径流过，而较小分子则会进入较细的分子而停留在其中。由于这种技术可以清除大小不同的杂质，使样品更纯净并且不受影响。它也可以用于分离游离的生物大分子，例如酶和蛋白质。
2.离子交换chromatography 离子交换chromatography是一种电静力分离技术，通常用于分 离带有相反电荷的生物大分子。离子交换chromatography基于非 共享原子、阴离子和阳离子之间的吸引力或排斥引力原理。通过 这种方式，样品中的阴离子分子可以被吸附到阳离子交换树脂中，而阳离子分子可以被吸附到阴离子交换树脂中。这种技术通常用 于纯化蛋白质和其他biomolecules 3.氢氧化铝亲和chromatography 氢氧化铝亲和chromatography是一种结合亲和原理的分离和纯 化技术。它是基于分子间的较强吸附相互作用，通常用于分离含 有电中性、疏水基团或氢氧基团的蛋白质。它列为具有很小结合 物的可逆性和如外部pH和ionic强度等变量的影响，它是一种比 较简单的结合方法。 4.亲和chromatography
生物学中的分离和纯化技术生物学是一门十分综合的学科，它囊括了生物在不同细胞和组织层次的多种结构和功能。要研究具体的生物物质，必须进行分离和纯化，这是生物学研究中不可或缺的技术。本文将对分离和纯化技术在生物学中的应用进行介绍和探讨。 一、离心分离技术 离心分离技术是一种基于不同颗粒物质重量或密度差异的分离技术。这种技术通常用于分离细胞和组织等样本中的细胞器、膜组分和其他分子。例如，离心分离可以分离细胞中的线粒体、叶绿体和内质网等细胞器。这种技术的原理是将细胞样本在离心机中离心，通过重力分离使得不同颗粒物质在不同的区域沉淀，从而实现分离。 二、电泳技术 电泳技术是一种基于分子电荷和大小差异的分离技术。这种技术通常用于分离和鉴定蛋白质和核酸等生物大分子。例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将蛋白质按照分子大小和电荷进行分离。这
种技术的原理是将样本经过电泳，电荷带正的物质向负极移动，电荷带负的物质向正极移动，从而实现分离。 三、层析技术 层析技术是一种基于分子相互作用的分离技术。这种技术通常用于分离和纯化蛋白质、核酸等生物分子。例如，离子交换层析可以将带电荷的分子与带相反电荷的分离柱上的离子进行竞争结合，从而实现分离。这种技术的原理是将样品通过某些介质（如凝胶、树脂、硅胶等）让目标分子和其他分子之间相互作用，利用吸附性、离子交换、大小排异等原理进行分离和纯化。 四、亲和层析技术 亲和层析技术是一种基于生物分子间特异性结合作用的分离技术。这种技术通常用于分离和纯化某些具有特殊亲和力的生物分子，如酶、抗体、蛋白质、DNA等。例如，亲和层析可以利用对应亲和物质如互补的DNA序列、配体、抗体来捕获目标分子。这种技术的原理是利用生物分子之间特定的化学反应结合，在某些介质上捕获目标分子，从而实现分离和纯化。
提取rna原理及应用 RNA提取是从细胞或组织中分离纯化RNA的过程。RNA（核糖核酸）是一种生物大分子，它在细胞中具有多种功能，例如：作为信息分子参与蛋白质合成、调节基因表达、催化化学反应等。因此，对RNA的研究具有重要意义，需要进行RNA提取来获取纯净的RNA样本。 RNA提取的原理可以分为以下几个步骤： 1. 细胞破碎和裂解：通过机械破碎或化学处理等方法，将细胞或组织破碎并释放RNA分子。 2. 离心：通过离心将细胞碎片与残余细胞器分离，以分离除RNA。 3. 蛋白质去除：通过酶解、酸性沉淀等方法去除蛋白质，以净化RNA。 4. RNA沉淀：向上清液中加入盐酸异丙醇或乙醇等沉淀剂，使RNA沉淀下来。 5. 洗涤：用乙醇洗涤RNA沉淀，以去除杂质。 6. 干燥和溶解：将得到的RNA沉淀干燥，并用水或缓冲液溶解，得到纯净的RNA样本。
RNA提取的应用非常广泛，主要包括以下几个方面： 1. 基因表达分析：通过提取细胞中的RNA，可以分析基因的表达水平，了解不同条件下基因的活性和调控机制。这对于研究细胞发育、生长和疾病发生机制具有重要意义。 2. RNA测序：随着高通量测序技术的发展，RNA提取成为进行转录组测序的重要步骤。通过测序得到的转录组数据，可以对细胞中所有的转录本进行全面分析，揭示基因的结构、变异和功能。 3. siRNA合成和功能研究：RNA提取可以用于合成小干扰RNA（siRNA），用于基因沉默实验。siRNA是一种能够特异性降低目标基因表达的双链RNA，可以用于研究基因的功能和信号通路。 4. RNA互作研究：RNA提取可用于研究RNA之间的相互作用。通过技术如RNA 免疫共沉淀（RIP）和RNA交联免疫沉淀（CLIP），可以分析RNA与蛋白质或其他RNA分子之间的相互作用。 5. 分子诊断和生物医学研究：RNA提取可用于分析与疾病相关的基因表达变化。例如，在癌症诊断中，可以通过提取肿瘤组织中的RNA，分析肿瘤相关基因的表达水平，预测病情和指导治疗策略。
核酸免提取 介绍 核酸免提取是一种新兴的分子生物学技术，它可以在不进行传统提取步骤的情况下直接从生物样本中获取核酸。传统的核酸提取方法通常需要耗费大量时间和精力，而且存在一定的操作风险。而核酸免提取技术则可以大大简化这个过程，提高实验效率，降低实验成本。 优势 核酸免提取技术具有以下几个显著的优势： 1. 简化操作流程 相比传统的核酸提取方法，核酸免提取技术可以省略一系列的提取步骤，如细胞破碎、蛋白质去除、有机溶剂萃取等。这样不仅减少了实验的复杂性，还能够节省大量的时间和劳动力。 2. 提高核酸回收率 传统的核酸提取方法在提取过程中常常会造成一定程度的核酸丢失，特别是在样本量较少的情况下。而核酸免提取技术通过优化提取条件和采用高效的纯化方法，可以显著提高核酸的回收率，从而得到更多的目标分子。 3. 适用范围广 核酸免提取技术适用于各种类型的生物样本，包括细胞、组织、血液、体液等。不同于传统的核酸提取方法对样本类型有一定的限制，核酸免提取技术可以更加灵活地应用于不同的实验需求。 4. 降低实验成本 由于核酸免提取技术省去了许多传统提取方法中的耗材和试剂的使用，因此可以有效降低实验的成本。此外，核酸免提取技术还可以减少实验中的人工操作，进一步降低了实验的成本。 方法 核酸免提取技术的具体方法可以根据不同的实验目的和样本类型进行适当的调整，但一般包括以下几个步骤：
1. 样本预处理 样本预处理是核酸免提取技术的关键步骤之一。在进行核酸免提取之前，需要对样本进行适当的处理，如细胞破碎、蛋白质去除等。这些处理可以通过机械破碎、酶解、高温等方法进行。 2. 核酸提取 核酸提取是核酸免提取技术的核心步骤。在样本预处理之后，可以直接进行核酸提取。核酸提取可以通过化学方法、磁珠法、膜法等多种方式进行。其中，化学方法是最常用的提取方法，它通过酸碱处理、有机溶剂萃取等步骤将核酸从样本中分离出来。 3. 核酸纯化 核酸纯化是为了去除提取过程中的杂质，提高核酸的纯度。核酸纯化可以采用柱层析、磁珠法、电泳法等多种方法。其中，柱层析法是最常用的纯化方法，它通过特定的柱子和缓冲液体系将核酸与杂质分离。 4. 核酸定量 核酸定量是为了确定提取和纯化过程中核酸的浓度和纯度。核酸定量可以采用比色法、荧光法、光谱法等多种方法。其中，比色法是最常用的定量方法，它通过测定核酸与染色剂之间的吸光度来确定核酸的浓度。 应用 核酸免提取技术在生命科学研究和临床诊断中有着广泛的应用前景。以下是一些常见的应用领域： 1. 基因组学研究 核酸免提取技术可以用于基因组学研究中的DNA测序、基因表达分析等。通过直接从样本中提取核酸，可以减少实验中的操作步骤和杂质的干扰，提高研究结果的准确性和可靠性。 2. 传染病诊断 核酸免提取技术在传染病的早期诊断中具有重要意义。通过直接从患者样本中提取核酸，可以快速、准确地检测出病原体的存在，为临床诊断和治疗提供依据。 3. 病理学研究 核酸免提取技术可以用于病理学研究中的基因突变检测、肿瘤标志物筛查等。通过直接从组织样本中提取核酸，可以准确地分析基因变异和表达水平的差异，为疾病的发生机制和治疗靶点的研究提供重要依据。
RNA的分离与纯化 包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mR NA仅占1%～5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA 与mRNA上。 一、RNA制备的条件与环境 为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。 从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。 二、总RNA的分离与纯化 由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又
现代生物化学实验技术 一、引言 现代生物化学实验技术是生物化学研究领域的重要组成部分，为生物化学研究提供了强大的实验工具和手段。本文将重点介绍几种常用的现代生物化学实验技术，包括蛋白质分离与纯化技术、核酸分离与纯化技术、酶活性测定技术以及基因克隆技术。 二、蛋白质分离与纯化技术 蛋白质是生物体内最重要的大分子有机物之一，其分离与纯化是生物化学研究的关键步骤。常用的蛋白质分离与纯化技术包括电泳分离技术、层析分离技术和亲和纯化技术。 1. 电泳分离技术 电泳分离技术是利用蛋白质在电场中的迁移性差异进行分离的方法。常用的电泳分离技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE电泳和等电点聚焦电泳。这些技术可以根据蛋白质的分子量、电荷和等电点进行分离和纯化。 2. 层析分离技术 层析分离技术是基于溶液中物质在固定相与流动相之间的相互作用力差异进行分离的方法。常用的层析分离技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析。这些技术可以根据蛋白质的大小、电荷和亲和性进行分离和纯化。
3. 亲和纯化技术 亲和纯化技术是利用特定配体与目标蛋白质之间的特异性结合进行分离和纯化的方法。常用的亲和纯化技术包括金属螯合亲和纯化、抗体亲和纯化和亲和标记纯化。这些技术可以根据蛋白质与特定配体的亲和性进行分离和纯化。 三、核酸分离与纯化技术 核酸是生物体内存储遗传信息的重要分子，其分离与纯化是生物化学研究的另一个关键步骤。常用的核酸分离与纯化技术包括凝胶电泳、超滤技术和柱层析技术。 1. 凝胶电泳 凝胶电泳是利用核酸在电场中的迁移性差异进行分离的方法。常见的凝胶电泳技术包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。这些技术可以根据核酸的大小、电荷和形态进行分离和纯化。 2. 超滤技术 超滤技术是利用滤膜的孔径大小选择性地分离不同大小的分子的方法。常用的超滤技术包括离心超滤和压力超滤。这些技术可以根据核酸的分子量和形态进行分离和纯化。 3. 柱层析技术 柱层析技术是利用固定相与流动相之间的相互作用力差异进行分离
核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔（F.Miescher）在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼（R.Altmann）于1889年认识其酸性后，定名为核酸。 二、核酸的分类和功能 核酸分为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。 DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。 核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖（核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代）。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。 三、核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。 四、细胞裂解： （一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。 经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等）和盐（如Tris、EDTA、NaCl等）。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如NaCl）等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如GIT、GuHCl等）裂解的，该方法已经成为了RNA抽提的主流，却不是基因组DNA抽提的主流。 （二）细胞的裂解方法