毕业论文
课题名称枯草芽孢杆菌培养基的优化研究
2014年5月18日
目录
摘要 (Ⅰ)
Abstract (Ⅱ)
1 前言 (1)
2 材料与方法 (3)
2.1材料以及试剂 (3)
2.2实验主要仪器设备 (4)
2.3试验方法 (4)
3 结果与分析 (6)
3.1 单因素试验结果 (7)
3.2 正交试验结果 (11)
4 结论及讨论 (13)
参考文献 (15)
致谢 (16)
枯草芽孢杆菌培养基的优化研究
摘要
本文选取BPG液体培养基研究该培养基配方对枯草芽孢杆菌生长的影响，通过相关资料的查询，选取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾这四个因素变量。先通过单因素实验确定这四个因素的最适含量，再进行L9(34)正交试验确定BPG液体培养最适培养基组合。最终得到最佳培养基配方含量是牛肉膏4.0g，蛋白胨3.8g，NaCl 3.3g，葡萄糖4.0g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.4g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0，其枯草芽孢杆菌生长量为3.631×107 CFU/mL。
关键词：枯草芽孢杆菌；葡萄糖；蛋白胨；牛肉膏；磷酸二氢钾；正交实验
Bacillus subtilis culture medium optimization research
Abstract
This article selected BPG liquid medium to study the culture medium formula of the effect on bacillus subtilis growth, through the relevant information query, glucose, peptone and beef extract, potassium dihydrogen phosphate this four factors variables. First determined by single factor experiment, the optimum content of these four factors, then L9 (34) orthogonal test to determine the BPG liquid culture combination optimal medium. Finally it is to know the best culture medium formula content is 0.40 g of glucose, peptone 0.38 g, 0.36 g beef paste, potassium dihydrogen phosphate 0.34 g.
Keywords:Glucose, peptone and beef extract, potassium dihydrogen phosphate, single factor experiment, orthogonal experiment
1前言
芽孢杆菌是人类最早发现的细菌之一[1]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），为芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌，芽孢大小为0.6～0.9×1.0～1.5 μm，外形为椭圆或柱状，一般处在菌体中央部位，形成芽孢后细菌体不会膨胀。菌落外观粗劣并且不通透，颜色为白色和微黄色，在液体培养基中生长时，会形成皱褶，生长需要氧气。
枯草芽孢杆菌是一种重要的α-淀粉酶的生产细菌，它能合成α-淀粉酶及多种酶类，与消化道和动物体内的消化酶类共同发挥作用。它在成长的过程中产生的枯草菌素、多粘菌素等活性物质，对致病菌和内源性感染的致病菌有着非常显著的抑制作用，而且作为好氧菌，可以迅速消耗肠道环境中的氧气，引起肠道缺氧，促进细菌的生长，并产生乳酸和其他有机酸，降低肠道pH值，对其他病原菌的生长起到不可忽视的作用[2]。同时枯草芽孢杆菌是一种多功能、高效、安全和极具开发潜力的微生物菌种，已经广泛应用于各类科研领域，跟随着科研水平的提高和经济的发展，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活越来越密切，随之而来的就是对枯草芽孢杆菌越来越多的培养研究，为了在工业生产中提高枯草芽孢杆菌的产量和降低生产成本，因此我们需要研究出更好的枯草芽孢杆菌培养基[3]。
到目前为止，对枯草芽孢杆菌的国内外研究不在少数。1945年约翰逊报告了枯草芽孢杆菌防治植物病害的控制作用。此后，枯草芽孢杆菌制备的生防制剂用来防治植物病害的研究成为了国内外研究的热门话题。1980年Papavizas G C报导，枯草芽孢杆菌可以用来防治水稻等作物受多种真菌的病害[4]。1992年Hwang等报导，枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的根腐病[5]。20世纪90年代后，国外已有了多种枯草芽孢杆菌制剂投入市场。美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌QST 713菌株和QST 2808菌株分别研制出活菌杀菌剂SerenadeTM和Souata AS，已在美国登记使用，叶面喷施能防止蔬菜，樱桃，葡萄，葫芦和核桃，霜霉病，白粉病，灰霉病，细菌和真菌疾病。GBO3和MBI 600分别由古斯塔夫森和微生物公司美国发展公司，根施或种子处理可以防止霉菌，镰刀菌，链格孢和丝核菌引起的大豆，小麦，棉花和花生根腐病。2001古斯塔夫森将淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生物防治剂混合在一起，称为BioYield，解淀粉芽孢杆菌变种植物生长促进剂taensa商品生产，商品taegrotm，用于灌木、树苗和装饰植物根部的室内培养，用来防治根腐病和枯萎病[6]。
海内少许公司也对具备生防功能的枯草芽孢杆菌进行了研究，涉及的防治对象有土传病害和果实病害、大田作物的叶部病害等。不同菌株有着不同的抑制作用，抑菌作用，抑菌机理。如今已从植物的根部泥土、植物和叶片上分离出的许多枯草芽孢杆菌对不同作物的真菌和细菌病害具有抑制作用，与人工诱变方法做比较提高了应变和这些菌株的发酵条件，学习的效率，通过对一些抗菌物质的分离和研究它的特点，同时进行温室和田间生物防治剂的试验，海内已经成功研究出并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”获得农业部登记注册，在多个省市推广使用，推广面积约为4667 hm2，主要防治三七根腐病、水稻纹枯病、烟草黑胫病，百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908[7]。江苏省农业科学院陈志谊等经过生物防治水稻病的研究获得了50.0％~81.0％的防治水稻纹枯病的效果，现已在江苏等地得到广泛推广；黑龙江省级科学研究院应用微生物研究所研发出来的枯草芽孢杆菌水剂主要用来防治瓜类及保护地蔬菜枯萎病、豆类根腐病和立枯病，已在黑龙江等地进行普及应用[8]。
枯草芽孢杆菌是当前应用最广泛的工业酶生产菌种之一，根据部分统计，枯草芽孢杆菌生产的酶占全部酶市场的50 %[9]。由于枯草芽孢杆菌的优点，如安全性好、产酶量高、种类多和环保，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，在各领域发挥着重要作用，如发酵法生产的食品，饲料，酶洗，纺织，皮革，造纸，医药等。枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，有较强的防病功能，美国到现在已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest 公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并在2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用作防治多种作物的白粉病、灰霉病等病害；中国利用枯草芽孢杆菌，植物病害的防治已达到世界先进水平，商业制剂已研制成功并投入雅宝，百抗，丰宁生产，小麦曲宁产品如[10]。枯草芽孢杆菌是基因工程菌的受体，是制备近200基因原核和真核细胞的本源，无论是在生产或研究中，都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面[11]。枯草芽孢杆菌是国内准许使用的饲料微生物菌种，由于它的无毒害，经常被制造成为微生物添加剂，使用在改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病等方面。枯草芽孢杆菌的内生孢子存在于制剂中，在动物肠道中，孢子能迅速恢复和分泌高活性的上肠蛋白质，脂肪，淀粉，有助于牧草碳水化合
物的降解；此外，枯草芽孢杆菌为需氧菌，在厌氧环境中，可以通过肠耗氧促进肠道菌厌氧菌的繁殖，促进肠道的生态平衡[12]。据研究，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可应用于多种疾病的感染，如肠炎、支气管炎[13]。最初枯草芽孢杆菌在水产养殖中应用很晚，因为它可以分泌多种酶和抗生素，使池底积累大量的饲料、粪便、有害气体和动植物残体，使它成为小分子，然后分解为小分子有机物，最终分解为二氧化碳的水和无机盐，氨基氮水、亚硝酸盐和硫化物浓度减少，从而有效提高水的质量，而且还可以用于单细胞藻类浮游植物提供营养，促进再生。研究表明，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用，枯草芽孢杆菌酶主要应用在食品工业领域，全世界食品工业用酶约占总量的60%，而中国高达85%以上[14]。
虽然如今化学杀菌剂在农药产业中占主要地位，但枯草芽孢杆菌杀菌剂所具备的优点，让它更加符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治的要求，如：对人畜安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等。枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化和抗菌作用的分子机制、抑制基因的克隆和其表达调控的研究已经积累了非常丰富的资料，具有重要的理论意义和生产价值。
为了提高枯草芽孢杆菌的产量和降低工业生产的成本，在参照已有研究资料的前提下，本文主要以BPG的液体培养基作为枯草芽孢杆菌的发酵培养基，并对培养基中葡萄糖含量，牛肉膏含量，蛋白胨含量，磷酸二氢钾含量作为研究因素，研究他们对枯草芽孢杆菌生长的影响，然后再对这几个单因素做正交实验，从而确定在工业生产中最佳培养基。
2 材料与方法
2.1材料以及试剂
材料：枯草芽孢杆菌（湖南师范大学微生物实验室提供）
试剂：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾、氯化钠、可溶性淀粉、蒸馏水、硫酸锰等
2.2 实验主要仪器设备
高压灭菌锅、超净工作台、35℃摇床培养、培养箱、光学显微镜、电烘箱、电子天平、分析天平、锥形瓶、移液管、烧杯、玻璃棒、培养皿、酒精灯、分光光度器等
2.3试验方法
2.3.1基础培养基的配置
BPG液体培养基：牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl 3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.3g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
2.3.2 实验方法
（1）标准曲线的制定
按照BPG液体培养基的配方：牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl 3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.3g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，配制好母液，高温蒸汽灭菌后，冷却待用。然后将枯草芽孢杆菌的菌种接种到母液，35℃下摇床培养。每隔3小时取样测定OD值，并且通过平板菌落计菌数。根据所得数据制作标准曲线。
（2）BPG液体培养基的配置
在药剂柜中找出自己需要用到的药剂：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾、淀粉、氯化钠、硫酸锰，准备1000mL的去离子水和pH试纸。用电子天平分别称量牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl 3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.3g，MnSO4·7H2O 0.2g，加入1000mL去离子水，将pH值调节到7，用玻璃棒搅拌均匀，使药品充分溶解。
（3）枯草芽孢杆菌母液的培养
将之前配制好的BPG液体培养基高温蒸汽灭菌，冷却，将枯草芽孢杆菌接种到其中，35℃摇床培养18h，分光光度仪及平板菌落计数法制作其标准曲线，待用。
(4)单因素试验培养基的配制
单因素实验BPG液体培养的配制，是在母液培养基配方的基础上缩小10倍配制的。取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾四个因素进行单因素实验，每个因素取5个值进行实验。
葡萄糖为变量的配方：在蛋白胨0.34g、牛肉膏0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，葡萄糖分别取0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g，加入100mL去离子水，将pH调节到7。
蛋白胨为变量的配方：在葡萄糖0.34g、牛肉膏0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，蛋白胨分别取0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g，加入100mL去离子水，将pH调节到7。
牛肉膏为变量的配方：在葡萄糖0.34g、蛋白胨0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，牛肉膏分别取0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g，加入100mL去离子水，将pH调节到7。
磷酸二氢钾为变量的配方：在葡萄糖0.34g、蛋白胨0.34g、牛肉膏0.34g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，磷酸二氢钾分别取0.31g，0.32g，0.33g，0.34g，0.35g，加入100mL去离子水，将pH调节到7。
按照以上四个配方，用千分之一电子天平一一称量出需要的药品，将其配制好，高温蒸汽灭菌。
(5)接种
将母液中的菌液接种到单因素实验培养基中，每个培养基接种5mL菌液，35℃摇床培养18h。
(6)测量OD420值
将培养好的单因素实验中的BPG液体培养基用紫外分光光度计分别测量它的OD420值，记录。
（7）正交实验设计
在单因素实验完成的前提下，设计出L9(34)正交试验表，根据正交实验表将所需要配制进行正交实验的BPG液体培养基配制好，每个培养基中接种5mL菌液，35℃摇床培养18h。培养好后一一检测OD420值，记录。
3 结果与分析
3.1 标准曲线的制定
3.1.1标准曲线制作的方法
（1）母液的培养
按照BPG液体培养基的配方：牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl 3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.3g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，
配制好母液，高温蒸汽灭菌后，冷却待用。
（2）接种
将枯草芽孢杆菌的菌种接种到母液，35℃下摇床培养。
（3）检测OD420值和活菌数
在确定的培养基的基础上，每隔3小时取样测定OD值，并且通过平板菌落计菌数如下。
表3.1 比浊法与平板菌落计数法测定活菌数的关系
时间（h）0 3 6 9 12 15 18 21 24 OD 0.008 0.034 0.085 0.112 0.153 0.211 0.278 0.246 0.245
活菌数
0.10 0.50 1.30 1.80 2.60 3.10 3.60 3.30 3.10 (×107CF
U/mL)
从图3.1可以看出OD值与活菌数呈现的关系，得到的关系式Y=1.3×108X+1.6×106，其中R2=0.9706，基本符合线性关系。所以当OD值≤0.278时，比浊法测定的OD值和活菌数呈现线性的关系。
图3.1 OD420值与活菌数的关系Array
3.2 单因素试验结果
在固定氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g、pH7.0、100mL水的前提下，通过四个单因素实验确定葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾的最适含量。实验结果如下。
3.2.1葡萄糖含量对枯草芽孢杆菌生长量的影响
为确定葡萄糖的最适含量，在蛋白胨0.34g、牛肉膏0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，分别加入0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g的葡萄糖含量，35℃下培养18h，检测其OD420值，根据标准曲线换算，以确定葡萄糖的最佳含量。结果见表3.2及图3.2。
表3.2 葡萄糖含量对枯草芽孢杆菌生长的影响
葡萄糖含量（g）活菌数（107）OD420
0.32 2.279 0.163
0.34 2.201 0.157
0.36 2.487 0.179
0.38 2.708 0.196
0.40 2.617 0.189
图3.2 葡萄糖含量对枯草芽孢杆菌生长的影响
图3.2显示，当葡萄糖含量为0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g时，其
测得的OD420分别为0.163、0.157、0.179、0.196、0.189。所以可以得出，随着葡萄糖含量的增大，OD420值也随之增加，直到葡萄糖含量为0.38g时，菌含量达到最高值，为2.708×107CFU/mL，之后随着葡萄糖含量的增加，菌含量值逐渐减小。这是由于当碳源含量过高时，反而抑制微生物的生长，因此葡萄糖的最适含量为0.38g。
3.1.2蛋白胨含量对枯草芽孢杆菌生长量的影响
为确定蛋白胨的最适含量，在葡萄糖0.34g、牛肉膏0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，分别加入0.32g，0.34g，0.36g，0.40g的蛋白胨含量，35℃下培养18h，检测其OD420值，以确定最佳的蛋白胨含量。结果见表3.3及图3.3。
图3.3显示，当蛋白胨含量为0.32g，0.34g，0.3i6g，0.38g，0.40g时，其测得的OD420分别为0.204、0.231、0.253、0.256、0.206。所以可以得出，随着蛋白胨含量的增大，OD420值也随之增加，直到蛋白胨含量为0.38g时，菌含量达到最大值，为3.488×107CFU/mL，之后随着蛋白胨含量的增加，菌含量值逐渐减小。这是由于碳源及氮源含量过高时，反而会抑制微生物的生长，因此蛋白胨的最适含量为0.38g。
表3.3 蛋白胨含量对枯草芽孢杆菌生长的影响
蛋白胨含量（g）活菌数（107）OD420
0.32 2.812 0.204
0.34 3.163 0.231
0.36 3.449 0.253
0.38 3.488 0.256
0.40 2.838 0.206
图3.3 蛋白胨含量对枯草芽孢杆菌生长的影响
3.1.3牛肉膏含量对枯草芽孢杆菌生长量的影响
为确定牛肉膏的最适含量，在蛋白胨0.34g、葡萄糖0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，分别加入0.32g，0.34g，0.36g，0.40g的牛肉膏含量，35℃培养18h，检测其OD420值，以确定最佳的牛肉膏含量。结果见表3.4及图3.4。
图3.4显示，当牛肉膏含量为0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g时，其测得的OD420分别为0.187、0.194、0.184、0.220、0.178。所以，由表3.4可以得出，随着牛肉膏含量的增大，OD420值也随之增加，直到牛肉膏含量为0.38g 时，菌含量达到最大值，为3.020×107 CFU/mL，之后随着牛肉膏含量的增加，菌含量值逐渐减小。这是由于碳源含量过高时，反而会抑制微生物的生长，因此牛肉膏的最适含量为0.38g。
表3.4 牛肉膏含量对枯草芽孢杆菌生长的影响
牛肉膏含量（g）活菌数（107）OD420
0.32 2.591 0.187
0.34 2.682 0.194
0.36 2.552 0.184
0.38 3.020 0.220
0.40 2.474 0.178
图3.4 牛肉膏含量对枯草芽孢杆菌生长的影响
3.1.4磷酸二氢钾含量对枯草芽孢杆菌生长量的影响
为了确定磷酸二氢钾的最适含量，在蛋白胨0.34g、牛肉膏0.34g、葡萄糖0.34g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，分别加入0.31g，0.32g，0.33g，0.34g，0.35g的磷酸二氢钾的含量，35℃培养18h，检测其OD420值，以确定最佳的磷酸二氢钾的含量。结果见表3.5及图3.5。
图3.5显示，当磷酸二氢钾含量为0.31g，0.32g，0.33g，0.34g，0.35g时，其测得的OD420分别为0.175、0.189、0.247、0.218、0.187。所以，由表3.5可以得出，随着磷酸二氢钾含量的增大，OD420值也随之增加，直到磷酸二氢钾含量为0.38g时，菌含量达到最大值，为3.371×107CFU/mL，之后随着磷酸二氢钾含量的增加，菌含量值逐渐减小。这是由于无机盐含量的过高，反而会抑制微生物的生长，因此磷酸二氢钾的最适含量为0.33g。
表3.5 磷酸二氢钾含量对枯草芽孢杆菌生长的影响
磷酸二氢钾含量（g）活菌数（107）OD420
0.31 2.435 0.175
0.32 2.617 0.189
0.33 3.371 0.247
0.34 2.994 0.218
0.35 2.591 0.187
图3.5 磷酸二氢钾含量对枯草芽孢杆菌生长的影响
3.2正交试验结果
参照单因素实验，确定氯化钠加入量为0.33g、淀粉加入量为0.33g、硫酸锰加入量0.02g、pH为7.0、水加入量为100mL，以影响枯草芽孢杆菌生长量的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾为四个影响因素，取各自三个水平进行正交实验，因素水平表见表3.6。
表3.6 正交试验设计直观分析表
序号A葡萄糖/g B蛋白胨/g C牛肉膏/g D磷酸二氢钾/g OD420活菌数(107)
1 1(0.36) 1(0.36) 1(0.36) 1(0.32) 0.109 1.577
2 1 2(0.38) 2(0.38) 2(0.33) 0.187 2.591
3 1 3(0.40) 3(0.40) 3(0.34) 0.191 2.643
4 2(0.38) 1 2 3 0.154 2.162x107
5 2 2 3 1 0.168 2.344x107
6 2 3 1 2 0.009 2.770x106
7 3(0.40) 1 3 2 0.237 3.241x107
8 3 2 1 3 0.243 3.319x107
9 3 3 2 1 0.198 2.140x107
K10.487 0.500 0.361 0.485
K20.331 0.518 0.539 0.433
K30.678 0.398 0.596 0.588
K1 0.162 0.167 0.120 0.162
K2 0.110 0.173 0.180 0.144
K3 0.226 0.133 0.199 0.196
R 0.116 0.040 0.079 0.052
因素主次顺序A>C>D>B
优水平A3B2C3D3
优组合A3B2C3D3
通过实验结果的直观分析，8号组合A3B2C1D3的菌体含量最高；但是经过计算分析的最优水平为A3B2C3D3。所以为了确定最优水平组合，分别按照这两个水平组合的培养基配方，配制BPG液体培养基，35℃下培养18h，测定其OD420值，确定最优水平。实验结果如表3.7。
表3.7 追加实验数据比较结果
水平组合活菌数（107）OD420
A3B2C3D3 3.631 0.267
A3B2C1D3 3.280 0.240 由表3.7可得，枯草芽孢杆菌最适生长量的最优组合为A3B2C3D3。
4.结论及讨论
本文选用BPG液体培养基来培养枯草芽孢杆菌，配方为牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl 3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO43.3g，MnSO4·7H2O0.2g，1000mL蒸馏水，pH7.0。针对其中四个因素：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾来进行单因素实验，再进行L9（34）正交实验来确定枯草芽孢杆菌的最优培养基水平组合。最终确定的最优水平组合为A3B2C3D3：牛肉膏4.0g，蛋白胨3.8g，NaCl 3.3g，葡萄糖4.0g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.4g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0，该条件下，枯草芽孢杆菌生长量为3.631×107 CFU/mL。
在本次实验中，得出了以下结论：
1.在四个单因素水平实验（葡萄糖含量、蛋白胨含量、牛肉膏含量、磷酸二氢钾含量）中，葡萄糖含量的改变对枯草芽孢杆菌的生长是四个因素影响水平中占主导地位的。
2.培养基中的四个因素变量的增长不是一直上升的，因为过高的碳源、氮源对微生物的生长是起到抑制作用的，所以在枯草芽孢杆菌培养基的配制中成分的添加都要控制在一定的范围之内。
3.选用的基础BPG液体培养基（配方：牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl 3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.3g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.0）培养枯草芽胞杆菌，35℃培养18h，检测出来的活菌数为3.2×106 CFU/mL，而经过实验的出的最佳培养基（配方：牛肉膏
4.0g，蛋白胨3.8g，NaCl 3.3g，葡萄糖4.0g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.4g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.0），培养的枯草芽孢杆菌的活菌数为3.631×107CFU/mL，相比原本的基础培养基，枯草芽孢杆菌的活菌数增大了一个数量级，所以认为本实验对枯草芽孢杆菌BPG液体培养基成分的优化是起到了一定的效果。
4.因为该课题《枯草芽孢杆菌培养基的优化研究》和同组的赵天武同学研究的课题《枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究》有很多相关联的地方，所以两个课题的实验结果可以相互比较从而从不同角度的角度发现问题。
赵天武同学培养出来的液体培养基检测的OD420值和活菌数相对于本文研究的液体培养基检测出来的实验数据相差不大，本文最优培养基成分培养的枯草芽孢杆菌
的菌含量为3.631×107CFU/mL，而他最优培养条件下枯草芽孢杆菌的含菌量为3.785×107CFU/mL。所以对于枯草芽孢杆菌BPG液体培养基而言，无论是培养成分和培养条件对其菌种的生长量的影响都是具有相当重要的，所以在往后培养枯草芽孢杆菌的研究道路上，可以针对这两个方面进行进一步优化。
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致谢
毕业论文暂告收尾，这也意味着我在学院的四年的学习生活既将结束。回首既往，自己一生最宝贵的时光能于这样的校园之中，能在众多学富五车、才华横溢的老师们的熏陶下度过，实是荣幸之极。在这四年的时间里，我在学习上和思想上都受益非浅。这除了自身努力外，与各位老师、同学和朋友的关心、支持和鼓励是分不开的。
论文的写作是枯燥艰辛而又富有挑战的。老师的谆谆诱导、同学的出谋划策及家长的支持鼓励，是我坚持完成论文的动力源泉。在此，我特别要感谢我的导师。从论文的选题、文献的采集、框架的设计、结构的布局到最终的论文定稿，从内容到格式，从标题到标点，她都费尽心血。没有老师的辛勤栽培、孜孜教诲，就没有我论文的顺利完成。
感谢生物工程的各位同学，与他们的交流使我受益颇多。最后要感谢我的家人以及我的朋友们对我的理解、支持、鼓励和帮助，正是因为有了他们，我所做的一切才更有意义；也正是因为有了他们，我才有了追求进步的勇气和信心。
在此向他们表示我由衷的谢意，并祝所有的老师培养出越来越多的优秀人才，桃李满天下！
枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物10-2 姓名：姜霞
摘要 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一,其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等 关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
芽孢杆菌常用培养基配方 （按理说，该实验的所有培养基都在这了，后红字更为清楚些。。。摘自百度） 一、肉汤琼脂培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏15g ，NACL15g ，蒸 馏水1000ml ，琼脂18g 。调节PH7.2,0.1MPA20min 灭菌。如果用液体做培养基，则去掉琼脂即可。100 mL/组，其中20 mL 液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 2、或是（J-琼脂培养基：胰蛋白胨5g,酵母膏15g,磷酸 氢二钾3g,葡萄糖2g, 琼脂20g, 蒸馏水1000ml。调节PH7.3 —7.5Mpa 30min灭菌。） 二、过氧化氢酶测定 1、试剂：3-10%过氧化氢 2、接种与培养：一般将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30度下 培养1-2天。 3、试验方法：取一干净载玻片，在上面加一滴3-10%的双氧水， 挑取1环1-2天的的菌苔，在双氧水溶液中涂抹，如有气泡出 现（O2），作为过氧化氢酶阳性，无泡为阴性。也可以将过氧 化氢液直接加入斜面上，观察气泡的产生。
三、需氧性测定 1、培养基：酪素水解物20g,葡萄糖 10g, ,NACL5g,HOCH2SO3Na1g,HSCH2COONa2g,琼脂15g,蒸馏水1L。调节PH7.2，分装试管，0.06Mpa，30min灭菌，培养基不摆斜面。 2、接种与观察：用一小环的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中 （穿刺管底），一般与30 度培养3-7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿穿刺线生长则为厌氧菌。四、酪素水解（用于检测不同种类的芽孢杆菌是否具有分解酪素的 特点） 1、培养基 （1）脱脂牛奶制备取新鲜牛奶，煮沸后去掉上层油脂，再经离心脱脂（3000r/min,10min）,除去上层油脂，即为脱脂牛奶。（2）牛奶平板的制备取50ml的脱脂牛奶放入一只三角瓶中，另外称1.5g琼脂置于含有50ml蒸馏水的另外3只三角瓶中，然后将两液分开灭菌，0.06Mpa-20min，带冷至45-50摄氏度时， 速将两液混匀倒平板，即为牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥。 2、接种与观察
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务
目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)
摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
蛹虫草固体一级菌种培养基及液体菌种培养基的制作 一．实验目的 学习并掌握蛹虫草固体一级菌种培养基、液体菌种培养基的制作方法 二．实验原理 蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北冬虫夏虫，属于子囊菌门中的大型真菌，自然界中生长于昆虫的蛹体上，为虫生真菌。20世纪30年代，有学者用昆虫蛹接种获得了具有成熟子囊壳的蛹虫草，之后人们用米饭培养基培养除了蛹虫草，用家蚕和柞蚕接种蛹虫草菌种培养出了批量的蛹虫草子实体。 蛹虫草作为一种食药用真菌，其生长所需要的营养物质包括碳源、氮源、维生素、矿物质元素等。其各种培养基质的配置原则都要包含以上几种营养物质。试验表明：适宜蛹虫草的碳源有蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等；氮源有牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物、各种蚕蛹粉以及硝酸盐、铵盐等无机氮；维生素有维生素B1；矿物质盐有磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸氢二钠等。 三．仪器设备与实验材料 1.主要仪器设备：电子台秤，高压蒸汽灭菌锅、电热炉等。 2.实验材料与试剂：玻璃棒，、脱脂棉、纱布、烧杯，漏斗，漏斗架，去皮刀，牛皮纸，量筒，马铃薯，葡萄糖，琼脂，水，蛋白胨，维生素B1，磷酸二氢钾等。 四．实验方法与步骤 1.固体一级培养基的制作 （1）配方一：改良PDA培养基：1000ml培养基包括200g马铃薯、20g葡萄糖、15-20g琼脂，2g蛋白胨、1g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁 操作流程： 马铃薯去皮→切块（长宽高近1cm）→煮沸→过滤→加琼脂融化→加葡萄糖→加蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁→分装→加棉塞→包扎→灭菌→摆斜面 （2）配方二：大米培养基 大米50g，磷酸二氢钾0.05g，葡萄糖10g，维生素B1 0.5g，水50ml 操作方法： 大米用清水浸泡5至6小时，沥水。 将0.05g磷酸二氢钾，10g葡萄糖，维生素B1 溶于50ml水中。 ●将配置好的水溶液和大米共同装入罐头瓶中，瓶口用聚丙烯薄膜扎封。 ?高压灭菌1h 2.液体菌种培养基制作 培养基配方：1000ml液体培养基磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，葡萄糖30g，蛋白胨3g，维生素B1 50mg，马铃薯20g 操作流程： 马铃薯去皮→切块（长宽高近1cm）→煮沸→过滤→加葡萄糖→加蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、生素B1 50mg→分装→加棉塞→包扎→灭菌 注：250ml摇瓶中中加入液体培养基120ml 五．实验注意事项。 1.灭菌锅操作时务必先将高压锅内的冷空气排干净。 2.注意避免培养基黏附在试管塞上，造成污染。 六．思考题 1.如果高压锅内冷空气排放不彻底，会对灭菌效果有什么影响，为什么？ 2.为什么摆斜面时试管上面盖纱布可以避免试管里面产生冷凝水？
菌株MY 02发酵培养基的优化设计 Ξ 刘 秋,闫建芳,艾 勇,于基成,杨宝灵,范圣第 (大连民族学院生物工程研究中心,大连116600) 摘 要:以龟裂链霉菌MY 02菌株为试材,采用单因子试验与均匀试验相结合的方法,通过二次多项式回归分析,筛选出活性组分S N06最佳发酵培养基配方,并建立了多元二次回归数学模型。菌株MY 02优化发酵培养基的最佳配方:淀粉质量分数为2169%,花生饼粉质量分数为1139%,(NH 4)2S O 4质量分数为0118%,CaC O 3质量分数为0114%,NaCl 质量分数为0116%。根据回归模型计算出S N06理论效价与实测效价相比较,二者非常接近,拟合误差小。 关键词:龟裂链霉菌;农用抗生素;均匀设计试验;发酵条件 中图分类号:Q932335 文献标识码:A 文章编号:100025684(2006)0420361204 Optimization of Fermentation Culture Medium of Isolate MY02 LI U Qiu ,Y AN Jian 2fang ,AI Y ong ,Y U Ji 2cheng ,Y ANG Bao 2ling ,FAN Sheng 2di (Research Center o f Biotechnology ,Dalian Nationalities Univer sity ,Dalian 116600,China ) Abstract :Active com ponents S N06in fermentation of Streptomyces rimosus MY 02show antag onism a 2gainst pathogen 1It is a basic im plementation for production of S N06that screens medium ingredients and corresponding dosage 1In this study ,the optimum medium ingredients and dosage of Streptomyces rimosus MY 02were determined using uniform design combined with regression analysis 1A regression m odel was developed 1The optimum medium was starch 2169%,peanut steep powder 1139%,(NH 4)2S O 40118%,CaC O 30114%and NaCl 0116%1The regression m odel was tested with titre of S N06.The tested result fitted well with those calculated with the m odel 1The results confirmed the applicability of uniform design for screening the best medium ingredients for S N061 K ey words :Streptomgces rimosus ;agricultural antibiotic ;uniform design experiment ;fermentation con 2 dition 新型农用抗生素S N06是由龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus )MY 02菌株产生的一种多烯大环内酯类抗生素[1]。该抗生素对多种蔬菜真菌病害(如番茄叶霉病、灰霉病、黄瓜枯萎病、茄子黄萎病等)都有较好的防治效果[2]。目前对龟裂链霉菌报道较多的是其能够产生抑制各种细菌生长的重要抗生素———土霉素,但土霉素对真菌的生长没有抑制作用。目前关于龟裂链霉菌能够产生抑制植物病原真菌生长的代谢产物的报道较少[3]。筛选龟裂链霉菌产生的抗真菌活性组分S N06的优化发酵培养基是高效、大量生产S N06 的基础。本试验拟通过单因子及均匀试验对S N06的摇瓶发酵条件进行优化,为进一步的中试 放大及大规模生产提供必要的前提。 1 材料与方法 111 菌种 试验用菌株为大连民族学院微生物工程实验 室自番茄保护地分离的1株链霉菌菌株,经鉴定为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus )MY 02菌株。活性检测指示菌为番茄叶霉病菌(Fulvia f ulva )。 Ξ基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(20022085),辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(2004F079) 作者简介:刘 秋(19692),女,博士,副教授,主要从事植物病原微生物研究。收稿日期:2005207207 修回日期:2005212210 第28卷第4期吉 林 农 业 大 学 学 报V ol 128N o 14 2006年8月Journal of Jilin Agricultural University August 2006
常见食用菌液体菌种培养基配方大全 大家对食用菌的培养基配方都非常熟悉，但是却没有将培养基配方统一归纳出来，在此跟大家一起分享常见的10种食用菌液体菌种培养基配方。 (1)平菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸30克，蛋白胨1.5克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁0.75克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (2)金针菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (3)白灵菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (4)香菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (5)杏鲍菇培养基配方
马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (6)鸡腿菇培养基配方 马铃薯100克，红糖12克，葡萄糖12克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (7)黑木耳培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (8)猴头菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸45克，蛋白胨2.5克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (9)双孢菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸50克，蛋白胨2.0克，酵母膏1.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH 值自然; (10)灰树花培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖15克，麦麸45克，蛋白胨3.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然;
枯草芽孢杆菌表达载体 产品信息和说明 2005年11月
目录 1.简介 (3) 2. pHT 载体 (3) 2.1. pHT01载体图谱 (4) 2.2. pHT43载体图谱 (5) 2.3. pHT01衍生物中标签的定位 (5) 3. 实验方案 (6) 4. 参考文献 (6) 5. 订单信息，运输和存储 (6) 本载体系统由德国拜罗伊特大学遗传研究所的沃尔夫冈·舒曼实验室 开发。 仅用于科研！ 本手册由wy135033405翻译百度文库首发任何意见请PM
枯草芽孢杆菌表达载体 通过质粒在枯草芽孢杆菌中高效表达胞内/胞外重组蛋白 1.简介 革兰氏阳性菌因其在农业，医疗和食品生物技术和重组蛋白生产等方面的贡献而广为人知。在所有革兰氏阳性菌中，枯草芽孢杆菌载体因下列原因尤为引人瞩目。（一）无致病性，且一般认为安全的有机体；（二）无明显的密码子偏好性；（三）可直接将功能性胞外蛋白分泌到培养基中（目前，大约60％的市售酶由芽孢杆菌生产）；（四）具备包含转录，翻译，蛋白质折叠、分泌机制，遗传操作和大规模发酵的大信息量机体。 但是下述两个障碍减少了枯草芽孢杆菌的使用：（一）产生一定数目的识别并降解外源蛋白的胞外蛋白酶；（二）载体质粒稳定性。第一个障碍已因蛋白酶缺失株的构建而基本解决。第二个因引入使用θ-复制模式质粒被完全克服，如由天然质粒pAMβ1和pBS72衍生的一些质粒（Jannière等，1990；Titok等，2003）。 最近，基于大肠杆菌 - 枯草杆菌穿梭质粒pMTLBS72的四种不同表达载体的构建和使用展示出全面的结构稳定性，业已出版（Nguyen等，2005）。 两个新的载体pHT01和pHT43允许在细胞质中高水平表达重组蛋白，其中pHT43载体引导重组蛋白到培养基。这两个载体基于强σA-依赖性启动子的枯草杆菌gro E操纵子通过添加lac操纵子改造成为一种高效可控的（IPTG诱导的）启动子。pHT01衍生载体可与8×His 标签（pHT08），链球菌标签（pHT9）或C - Myc的标签（pHT10）相结合。 2. pHT 载体 所有在枯草芽孢杆菌的gro ESL操纵子之前使强启动子与lac操纵子融合的载体都可通过加入IPTG进行诱导。尽管当未添加诱导物时表达组件的背景表达水平很低，还是成功从约1300种诱导因子中筛选出一种来使用bga B报道基因（Phan等，2005）。当分别将htp G 和pbp E基因融合到gro E启动子时，加入IPTG后，表达的重组蛋白可能分别占细胞总蛋白的10%和13%（Phan等，2005）。热纤梭菌的amyQα-淀粉酶和纤维素酶A、B的高水平表达实验证实。该载体还插入了一个高效SD序列以及一个多克隆位点（BamH I, Xba I, Aat II, Sma I）。编码α-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域与pHT01的SD序列融合，构成了pHT43，以此获得分泌的重组蛋白。
目录 第一章芽孢杆菌的简要介绍 (1) 第一节芽孢杆菌种类 (1) 第二节芽孢杆菌表达系统发展简史 (2) 第二章枯草芽孢杆菌的转化系统 (3) 第一种方法：电转化 (3) 第二种方法：Spizizen转化 (3) 第三种方法：原生质体法(Takashi) (4) 第四种方法：原生质体转化之二 (4) 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） (5) 第三章芽孢杆菌表达系统发展简史 (6) 第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） (7) 第二节芽孢杆菌的缺点 (7) 第三节助表达系统 (7) 第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点 (7) 第四章枯草芽孢杆菌转录翻译系统 (8) 第一节：转录系统 (9) 第二节：翻译系统 (9) 第五章芽孢杆菌常用的宿主和载体 (10) 第六章芽孢杆菌表达系统应用实例 (11) 1 中国 (11) 2 日本 (12) 3 加拿大 (12) 第七章芽孢杆菌其他产品 (13) 第一节核苷类产品 (13) 第二节核黄素 (13) 第三节微生物制剂/益生菌 (13) 第八章结语 (14) 附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 (14) 附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 (15) 致谢及参考文献 (15)
第一章芽孢杆菌的简要介绍 芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。 目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。 第一节芽孢杆菌种类 目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至2011年10月，在KEGG 上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有： 简称菌种名称测序时间测序链接 bsu Bacillus subtilis1997RefSeq bss Bacillus subtilis subsp. spizizenii W232010RefSeq bst Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-102011 RefSeq bsn Bacillus subtilis BSn52011RefSeq bha Bacillus halodurans2000RefSeq ban Bacillus anthracis Ames2003RefSeq bar Bacillus anthracis Ames 05812004RefSeq bat Bacillus anthracis Sterne2004 RefSeq bah Bacillus anthracis CDC 6842009 RefSeq bai Bacillus anthracis A02482009 RefSeq bal Bacillus cereus biovar anthracis CI2010RefSeq bce Bacillus cereus ATCC 145792003RefSeq bca Bacillus cereus ATCC 109872004RefSeq bcz Bacillus cereus ZK2004RefSeq bcr Bacillus cereus AH1872008 RefSeq bcb Bacillus cereus B42642008 RefSeq bcu Bacillus cereus AH8202009 RefSeq bcg Bacillus cereus G9******* RefSeq bcq Bacillus cereus Q12009RefSeq
液体菌种的几种接种方法 刘益清(415900) 湖南忠食农业有限公司 液体菌种具有方便快捷菌龄短而一致纯度高活力强等优点，越来越受科研工作者和广大食用菌生产者的重视，但如何正确使用液体菌种尚未见系统报道．液体菌种培养好后接种方法直接影响液体菌种优势的发挥，甚至关系到生产的成败．我们在规模应用液体菌种接种中使用过多种接种方法，各有特点，下面就几种成功的方法介绍给大家． 一料表面接种法：这是目前采用比较多的方法,采用这种接种方法时多为瓶装或袋装培养料，上端有一定的空间，如生产金针菇茶薪菇黑木耳杏鲍菇菌包以及生产香菇鸡腿菇平菇等各种菌种，接种时尽量将料表面喷淋上菌种，液种萌发生长快，封面早杂菌污染的机会很小，除破袋外菌袋污染的机会极低，甚至以万袋计算可以达到零污染．这种方法的菌球处于氧气充足的条件下生长很好． 二表面加枪头插入式接种法：因表面接种法接种时菌球易被培养料的过滤作用阻滞在料的上半部分，菌丝生长需要从上往下生长，不能在料内上下同时生长．如果将接种枪枪头做成管状插入料内接种，菌球在料内同时生长，可以缩短发菌时间一半左右，甚至更多．这种方法一要注意料内氧气的供应（不适应扎口袋），二要注意接种环境的无菌要求，避免菌种不萌发或枪头带入杂菌造成污染，成品率在98-100%,比固体菌种袋口接种缩短时间一半以上. 三袋表面扎孔接种法：长菌棒从两端接种不能缩短养菌时间，从袋的表面一面或两面）用枪头扎入３－５cm深并同时接种，扎孔间隔根据需要确定，如香菇每棒扎３－５个孔，这种方法调节接种量和孔间距离可以达到缩短养菌时间和减少杂菌污染的目的，缺点是用种量大，每个孔的接种量不少于１０ml,接种后不封口的应达到每孔２０ml以上．这种方法2007年大量生产香菇出菇菌棒,成品率高达99%以上 四袋壁内喷射接种法：长菌棒还可以采取从两端一则用枪头分别扎入到袋薄膜内，从料与塑料薄膜之间喷射菌种（要求液体压力达到１kg/cm２以上），喷射后用手按压分散菌种，使菌棒一则布满菌种，待菌丝生长１－３cm后可以扎孔增氧．这种方法可以覆盖较大的料表面，发菌快袋面微孔污染小，缺点是用种量大，每喷射一次用种多在１００ml左右．而且在配料时就要注意减少培养料的含水量．这种方法在香菇生产上应用比较成功．是我们在第三种方法的基础上改进的方法,期望今后适应开放接种的需要. 五接种后摇动接种法：颗粒菌种培养基接液体菌种最能发挥快速发菌的优势，液体菌种接入玻璃瓶后旋转或摇动使液体流动粘到每粒颗粒上，在适合温度下三天即可长满菌丝，继续培养几天让菌丝深入颗粒内部后即可用于生产．这种方法可以在急需用种时使用．六接种机接种法：食用菌瓶栽工厂化企业使用的方法，接种速度一般7000-8000 瓶／小时，菌液喷射在料面及孔洞中。 液体菌种对不良环境的抵抗力不如固体菌种（如耐缺氧能力不强），采用发酵料，生料栽培或塑料袋熟料开放式拌料栽培往往不易成功.液体菌种生产技术与食用菌栽培技术的很好结合才能发挥液体菌种的优势
毕业设计(论文)课题名称枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究 2014 年5 月15 日
目录 摘要 (2) Abstract (3) 1 前言 (4) 2 材料与方法 (7) 2.1 实验试剂与材料 (7) 2.2 主要仪器与设备 (7) 2.3 试验方法 (8) 3 结果与分析 (8) 3.1枯草芽孢杆菌的标准曲 (9) 3.2单因素试验结果 (10) 3.3 正交试验结果分析 ···································错误！未定义书签。 4 结论和讨论 (15) 5参考文献 (16) 6致谢 (17)
枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究 摘要 本文通过单因素实验和正交试验研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的发酵条件（PH、温度、时间、接种量）对枯草芽孢杆菌生长量的影响。本实验的枯草芽孢杆菌在BPG液体培养基上培养，通过单因实验及正交试验得到最佳的发酵培养条件为：初始pH 7.0；温度35℃；时间20h；接种量为5%。在此培养条件下的活菌液量为 3.785×107CFU/ml，相比在LB培养基下培养时的活菌液量3.2×106CFU/ml提高了10倍左右。 关键字：枯草芽孢杆菌；正交试验；生长量
Optimization study of bacillus subtilis culture conditions Abstract In this paper, we study Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) fermentation conditions (PH, temperature, time, quantity of) the impact on the growth of Bacillus subtilis. The experiment of bacillus subtilis in combined cultivated in liquid medium, is obtained by single for experiment and the orthogonal experiment the best fermentation culture conditions as follows: the initial PH 7.0. Temperature 35 ℃; Time 20 h; Inoculation quantity was 5%. Under the condition of the cultivation of the best amount of bacterium fluid is 3.785 x 107 cfu/ml, compared to when cultured in LB medium under the microbial quantity: 3.231 x 107 cfu/ml by about 10 times. Key words: Bacillus subtilis; Culture conditions; increment
微生物技术综合实验 年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201 学号：1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：刘凤霞教授 日期：二零一三十月五号
目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3)
3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7) 6附录 (8)
枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅
(1)平菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸30克，蛋白胨1.5克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁0.75克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (2)金针菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (3)白灵菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (4)香菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (5)杏鲍菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (6)鸡腿菇培养基配方 马铃薯100克，红糖12克，葡萄糖12克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (7)黑木耳培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸40克，蛋白胨2.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (8)猴头菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸45克，蛋白胨2.5克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然; (9)双孢菇培养基配方 马铃薯100克，红糖15克，葡萄糖10克，麦麸50克，蛋白胨2.0克，酵母膏1.0克，磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B11片，聚氧丙稀甘油0.3毫升，pH值自然;
枯草芽孢杆菌常用培养基配方： 1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂 枯草芽孢杆菌原生质体的制备 1 培养枯草芽孢杆菌 取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。 2. 收集细胞 各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。 3. 总菌数测定 各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。 4. 脱壁 二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。 5. 剩余菌数测定 取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。 计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。
培养基的设计与优化 原料：碳源,氮源 十大元素: 碳, 氢, 氧, 氮, 磷, 钾, 硫, 钙, 镁 微量元素: 硼, 锰, 锌, 钼, 钴, 碘, 铜, 等 生长因子、前体和产物促进剂 生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子，生长因子对发酵的调控起到重要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。 前体 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接为微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。产物促进剂 指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。其提高产量的机制还不完全清楚，其原因可能是多方面的，主要包括：有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。 水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 培养基的设计与优化 目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。 培养基设计的基本步骤是： 1.根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分. 2.通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分。 3.当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。这些实验往往基于多因子实验，包含均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。
芽孢杆菌分离纯化及保种 一、实验目的：从海参池底泥中分离提纯芽孢杆菌并对其进行鉴定保种 二、实验材料：底泥样品，刺激芽抱生长培养基，芽抱菌分离培养基，琼脂培养基，斜面培养基，生理盐水等其他常见微生物实验常用器材 培养基配方： 1.刺激芽抱生长培养基：蛋白胨l0g，酵母膏3g，淀粉3g,MgS040.lg,KHZP04 1.5g,Na2HP042g，水1000mL，琼脂15g，pH7.8 2.芽抱菌分离培养基：蛋白胨3g,葡萄糖5g，酵母膏5g,KZHP044g, 3.08%MnS04 1mL，琼脂18g，水1000mL,pH自然(加热煮好后加3.08%MnS04) 3.琼脂培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g,NaCl5g，18g的琼脂，水1000mI,pH 7.2^-7.4 4.斜面培养基即琼脂培养基 三、实验步骤： 1、配制刺激芽孢杆菌生长的培养基、芽抱菌分离培养基、琼脂培养基、生理盐水 2、对各种实验所需仪器进行灭菌 3、将底泥样品1g放入9ml生理盐水中，震荡，充分混匀分散样品，最后取上清液1ml涂布于刺激芽孢杆菌生长的培养基（液体）上，30℃培养24h 4、将培养好的菌悬液置于80℃水浴锅中加热10---20min，杀死不能形成芽抱的其它菌体，平板涂布法接种于芽抱菌分离培养基，30℃培养24--48h，挑取疑似菌落，30℃培养24h后观察并记录 5、将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 四、实验结果： 芽孢杆菌菌落形态特征:菌落为圆形，直径多在3-10mm之间，淡黄色，中间颜色较深，表面平整不光滑，无光泽，边缘不整齐 配制刺激芽孢杆菌生长的培养基：芽抱菌分离培养基：