酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)
1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。
四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理
科学探究之专题：实验方案的设计与评价 ⑴提出问题⑵猜想(假设) 设计实验【⑶制定计划、⑷进行实验、⑸收集证据】⑹解释与结论⑺反思与评价⑻表达与交流(迁移与知识的拓展) 。作为探究题，一般并不需要完全具备以上八个步骤，通常因题目的需要而选择其中重要的步骤呈现。 2. 3. ⑴不要答非所问：一般而言，最终的结论与开始的猜想与假设有一致性，至少也是有关系的。同时，探究过程方案的设 计，也是与探究目的紧密相关的。 ⑵注意猜想或假设的合理性：虽然猜想和假设有很多可能，但是我们的猜想与假设，不能脱离题目给出的条件，否则就 是无源之水。 ⑶正确选择实验用品：首先要弄清实验原理；设计实验方案，要紧扣假设，正确选择仪器和药品，正确选择装置。
知识点二：实验方案的设计 1.实验方案的设计原则： ⑴科学性：指实验原理、实验操作程序和方法要正确； ⑵可行性：切实可行，所选用的药品、仪器、设备和方法等在中学现有的实验条件下能够得到满足； ⑶安全性：实验设计时，应尽量避免使用有毒药品和进行有一定危险性的实验操作； ⑷简约性：要尽可能简单易行，应选用简单的实验装置、用较少的实验步骤和实验用品，并能短时间内完成实验； ⑸创造性：有创新意识。 2.实验方案的内容： ⑴一个比较完整的化学实验设计方案，一般包括以下几个内容： ①实验目的；②实验原理；③实验用品（包括仪器和药品等）及规格；④实验装置、实验步骤；操作方法及注意事项； ⑤实验现象及结论；⑥问题与讨论。 ⑵对于给出实验目的，要求设计实验方案的题一般可以按以下思维程序进行： ①根据实验目的，确定实验原理（或假设）； ②根据实验原理（或假设），选择需要的仪器和药品（或实验装置图）； ③写出实验操作步骤及注意事项； ④记录实验现象，分析实验结果，得出正确结论。 ⑶实验设计要科学合理，安全可靠，操作简便、现象明显、结论可信、绿色环保。 3.实验方案的设计思路： 4.实验方案设计的分类： ⑴气体的制取、净化&性质的综合设计：发生装置→净化装置→干燥装置→收集装置→尾气处理装置 气体实验装置的连接顺序设计 ⑴原则： ①制取干燥纯净的气体应遵循“先除杂，后干燥”的原则。 ②尾气处理：有毒气体常采用溶液（或固体）吸收或将之点燃，无毒气体直接排空。 ③接口的连接：总体上遵循装置的排列顺序，但对于吸收装置应“长进短出”；干燥管应“大进小出”。 ④制气实验：装置选择与连接→气密性检查→装固体药品→加液体药品→开始实验（按程序）→拆卸仪 器→其它处理等（制气体的实验，在实验前均应进行气密性检查，气体在点燃之前一般应进行纯度的检验）。 ⑤加热操作：加热前一般应先通原料气赶走空气后再点燃酒精灯。其目的是：一是防止爆炸（如氢气还原氧化 铜、CO还原Fe2O3等）；二是保证产品纯度。熄灭酒精灯时，一般是“先撤后灭”的原则。 ⑵还应该考虑以下因素: ①熄灭酒精灯时要防止液体倒吸； ②进行易爆、易燃实验时要防止爆炸（如氢气还原氧化铜应该下通氢气，气体点燃前应该先验纯等）； ③防氧化（如H2还原CuO后要“先灭灯，再停氢”，白磷的切割要在水中进行等）； ④防吸水（如实验取用制取易吸水、潮解的物质必须采取有效措施）。 ①性质实验方案设计的思路 物质组成或结构 充分了解二者关系 物质的性质验证或探索物质性质 反复推敲、深挖细找 ②探索性实验与验证性实验 性质探索性实验方案：根据物质的结构特点或所属类型的典型代表物去推测物质可能具有的一系列性质，而后据此分别设计出合理的实验方案，去探究该物质可能具有的性质。程序：物质→实验事实→科学抽象→结论。 性质验证性实验方案：对物质具备的性质去求证，关键在于设计出简捷的实验方案，操作简单，现象明显，且安全可行。程序：物质→性质推测→实验事实→科学抽象→结论。 ⑶物质的检验、鉴别&提纯 ⑷混合物中某成分的验证
实验十、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选 ——培养基配制及样品采集 一、实验目的 学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握芽孢杆菌筛选的特异性培养基配制方法。 二、实验原理 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三实验材料 1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、 记号笔等。 2. 筛选培养基：肉汤琼脂培养基 四、操作步骤 1. 采样： 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。给牛皮纸袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 （注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，
※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml 水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定 试验 一、实验目的 1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。 4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养
明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。 5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 二、实验材料 1、土壤样品 实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、药品 可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸 3、试剂： （1）配制稀碘液： 原碘液：称取碘和碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液，加入碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 （2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。（溶液现配现用） （3）磷酸缓冲液（pH=）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用
实验方案的设计与评价 一、实验方案的设计 （一）、一个相对完整的化学实验方案一般应包括的内容有：实验名称、实验目的、实验原理、实验用品和实验步骤、实验现象记录，及结果处理、问题和讨论等。 （二）、实验方案设计的基本要求 1、科学性 （1）、当制备具有还原性的物质时，不能用强氧化性酸，如： ①、制氢气不能用HNO3、浓H2SO4，宜用稀H2SO4等。另外，宜用粗锌（利用原电池原 理加快反应速率），不宜用纯锌（反应速率慢）。 ②、同理，制H2S、HBr、HI等气体时，皆不宜用浓H2SO4。前者宜用稀盐酸，后两者宜 用浓磷酸。 FeS + 2HCl = FeCl2 + H2S↑H3PO4 + NaBr NaH2PO4+ HBr↑（制HI用NaI） （2）、与反应进行、停滞有关的问题 用CaCO3制CO2，不宜用H2SO4。生成的微溶物CaSO4会覆盖在CaCO3表面，阻止反应进 一步进行。 （3）、MnO2和浓盐酸在加热条件下反应，制备的Cl2中含HCl气体和水蒸气较多；若用KMnO4代替MnO2进行反应，由于反应不需加热，使制得的Cl2中含HCl气体和水蒸气极少。 （4）、酸性废气可用碱石灰或强碱溶液吸收，不用石灰水，因为Ca（OH）2属于微溶物质，石灰水中Ca（OH）2的含量少。 （5）、检查多个连续装置的气密性，一般不用手悟法，因为手掌热量有限。 （6）、用排水法测量气体体积时，一定要注意装置内外压强应相同。 （7）、实验室制备Al（OH）3的反应原理有两个：由Al3+制Al（OH）3，需加氨水；由AlO2-制Al（OH）3，需通CO2气体。 （8）、装置顺序中，应先除杂后干燥。如实验室制取Cl2的装置中，应先用饱和食盐水除去HCl气体，后用浓H2SO4吸收水蒸气。 2、可行性 （1）、在制备Fe（OH）2时，宜将NaOH溶液煮沸，以除去NaOH溶液中溶解的O2；其次在新制的FeSO4溶液中加一层苯，可以隔离空气中的O2，防止生成的Fe（OH）2被氧化。（2）、实验室一般不宜采用高压、低压和低温（低于0℃）等条件。 （3）、在急用时：宜将浓氨水滴入碱石灰中制取NH3，不宜用NH4Cl与Ca（OH）2反应制取NH3；又如，宜将浓HCl滴入固体KMnO4中制备Cl2；还有将H2O2滴入MnO2中制O2，或将H2O滴入固体Na2O2中制备O2等。 （4）、收集气体的方法可因气体性质和所提供的装置而异。 （5）、尾气处理时可采用多种防倒吸的装置。 3、安全性 实验设计应尽量避免使用有毒的药品和一些有危险性的实验操作，当必须使用时，应注意有毒药品的回收处理，要牢记操作中应注意的事项，以防造成环境污染和人身伤害。（1）、制备可燃性气体，在点燃前务必认真验纯，以防爆炸！ （2）、易溶于水的气体，用溶液吸收时应使用防倒吸装置。 （3）、对强氧化剂（如KClO3等）及它与强还原剂的混合物，千万不能随意研磨，以防止
根际土壤细菌分离纯化及鉴定实验方案 一、方法： 稀释涂布分离法 二、培养基： 1、GPM 培养基(Glucose Peptone Meat extract Agar) 2、牛肉膏蛋白胨培养基（NB ） 3、金氏培养基B （King ） 4、CSEA 培养基(Cold extracted soil extract agar) 5、YG 6、NA 7、无氮培养基 8、分解纤维素菌筛选培养基 9、TSA 培养基 三、实验流程 梯度稀释 涂板分离 挑取不同的单菌落于斜面培养 液体培养及液体保种 提取DNA PCR 扩增 酶切带型分型确定操作单元 连接转化 克隆子挑选及PCR 鉴定 测序 序列拼接 建树 采集根际土壤样品
四、具体实验方案 1、采集根际土壤样品：将植株根系及附着的根际土壤一同装入无菌袋带回实验室。 2、土壤样品稀释及选择合适浓度梯度进行涂板分离：梯度稀释土壤样品，取10-1、10-2、10- 3、10- 4、10- 5、10-6六个梯度涂板，每个浓度梯度涂3个平行，过后放于37℃培养箱中培养1-2d观察菌落生长情况。选择合适的浓度平板，根据形态、大小、颜色，挑取不同菌株的典型单个菌落，达到分离纯化的目的。 3、挑取不同单菌落于斜面保种：通过上述的分离纯化步骤，可筛选得到不同的菌株，对筛选到的菌株接种于斜面放于37℃培养箱中培养。最后斜面放于4℃冰箱保存，备用。 4、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于相应的液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min，37℃）培养。过后吸取菌液与灭过菌的甘油按7:3的比例于1.5ml灭过菌的EP管中放于-20℃保种。剩下的菌液用于以下实验。 5、提取DNA（CTAB法）： （1）取1.5ml菌液于1.5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。 （2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。 （3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），混匀，于55℃温育1h。 （4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。 （6）冷却后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP 管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。 （7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。 （8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。 （9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
实验方案的设计与评价-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
实验方案的设计与评价 一、实验方案的设计 （一）、一个相对完整的化学实验方案一般应包括的内容有：实验名称、实验目的、实验原理、实验用品和实验步骤、实验现象记录，及结果处理、问题和讨论等。 （二）、实验方案设计的基本要求 1、科学性 （1）、当制备具有还原性的物质时，不能用强氧化性酸，如： ①、制氢气不能用HNO3、浓H2SO4，宜用稀H2SO4等。另外，宜用粗锌（利用 原电池原 理加快反应速率），不宜用纯锌（反应速率慢）。 ②、同理，制H2S、HBr、HI等气体时，皆不宜用浓H2SO4。前者宜用稀盐酸， 后两者宜 用浓磷酸。 FeS + 2HCl = FeCl2 + H2S↑ H3PO4 + NaBr NaH2PO4+ HBr↑（制HI用NaI）（2）、与反应进行、停滞有关的问题 用CaCO3制CO2，不宜用H2SO4。生成的微溶物CaSO4会覆盖在CaCO3表面，阻 止反应进 一步进行。 （3）、MnO2和浓盐酸在加热条件下反应，制备的Cl2中含HCl气体和水蒸气较 多；若用 KMnO4代替MnO2进行反应，由于反应不需加热，使制得的Cl2中含HCl气体和 水蒸气极 少。 （4）、酸性废气可用碱石灰或强碱溶液吸收，不用石灰水，因为Ca（OH）2属于微溶物质，石灰水中Ca（OH）2的含量少。 （5）、检查多个连续装置的气密性，一般不用手悟法，因为手掌热量有限。（6）、用排水法测量气体体积时，一定要注意装置内外压强应相同。
（7）、实验室制备Al（OH）3的反应原理有两个：由Al3+制Al（OH）3，需加氨水；由AlO2-制Al（OH）3，需通CO2气体。 （8）、装置顺序中，应先除杂后干燥。如实验室制取Cl2的装置中，应先用饱和食盐水除去HCl气体，后用浓H2SO4吸收水蒸气。 2、可行性 （1）、在制备Fe（OH）2时，宜将NaOH溶液煮沸，以除去NaOH溶液中溶解的O2；其次在新制的FeSO4溶液中加一层苯，可以隔离空气中的O2，防止生成的Fe（OH）2被氧化。 （2）、实验室一般不宜采用高压、低压和低温（低于0℃）等条件。 （3）、在急用时：宜将浓氨水滴入碱石灰中制取NH3，不宜用NH4Cl与Ca （OH）2反应制取NH3；又如，宜将浓HCl滴入固体KMnO4中制备Cl2；还有将H2O2滴入MnO2中制O2，或将H2O滴入固体Na2O2中制备O2等。 （4）、收集气体的方法可因气体性质和所提供的装置而异。 （5）、尾气处理时可采用多种防倒吸的装置。 3、安全性 实验设计应尽量避免使用有毒的药品和一些有危险性的实验操作，当必须使用时，应注意 有毒药品的回收处理，要牢记操作中应注意的事项，以防造成环境污染和人身伤害。 （1）、制备可燃性气体，在点燃前务必认真验纯，以防爆炸！ （2）、易溶于水的气体，用溶液吸收时应使用防倒吸装置。 （3）、对强氧化剂（如KClO3等）及它与强还原剂的混合物，千万不能随意研 磨，以防止 发生剧烈的氧化还原反应，引起人身伤害等事故。 （4）、有毒气体的制备或性质实验均应在通风橱或密闭系统中进行，尾气一般 采用吸收或燃 烧的处理方法。 （5）、混合或稀释时，应将密度大的液体缓慢加到密度小的液体中，以防液体 飞溅。如浓硫
酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 （1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二）酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
芽孢杆菌的分离与鉴定 实验器材：铲子（1）,盆（1）,电子天平（1），洗耳球(1)，接种勾和环（1）,1ml吸管（7）,玻璃涂棒（1）,平皿（12）,250ml带玻璃珠三角瓶（1）,双层纱布（1）,试管（7），标签纸（1）,恒温箱，显微镜（4）。 实验试剂：无菌水，1mol/L NaOH、1mol/L HCL、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、复红液、5%孔雀绿、沙黄、乙醚、吲哚试剂、40%NaOH、肌酸 牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏1g，蛋白胨2g，Nacl 1g，水200ml，ph7.2，琼脂3.0-4.0g；生孢培养基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%硫酸镁晶体（七水），0.02%硫酸铵，0.1%磷酸氢二钾（3水），1.5%琼脂； 一、土壤中芽孢杆菌的筛选 A.培养基配置步骤：（1）称量：按比例称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，共置于烧杯中； （2）溶解：先加入适量无菌水，加热使其溶解，再补足水至总量； （3）调pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调PH至7.6； （4）过滤：用滤纸过滤； （5）融化琼脂：加入3.5克琼脂，继续加热至完全溶解，补足因加热蒸发失去的水分； （6）分装与包扎：摆斜面 （7）灭菌：121℃，灭菌20min B.实验步骤： （一）采集土样: 每个采样点选取土壤较肥沃、有代表性的地块约0．2 cm2，五点法采集。取5～10cm深土壤，每一个土样约500 g。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4℃保存备用。 （二）土壤悬液制备：称取10g土样，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡摇晃20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，两层纱布过滤，然后将锥形瓶置于90℃水浴锅，加热20min，制备成土壤悬液。 （三）土壤悬液稀释：用一支1ml的无菌吸管从锥形瓶吸取过滤的土壤悬液1ml加入盛有9ml 无菌水的大试管中，震荡均匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一只盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、 10-2 、 10-3、 10-4、10-5、 10-6 不同的稀释度。 （四）倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，冷却至45-50度倒平板，每个梯度两个平行，共12个，每皿15ml左右。平皿凝固后，在平皿底部分别用记号笔用：10-1 、 10-1、10-2、 10-2 、 10-3、 10-3、10-4、 10-4、10-5、 10-5、10-6、10-6。 （五）涂布：用无菌吸管分别将10-1 、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各吸取0.2ml，将菌悬液小心的对号滴入已写好稀释度的平皿表面中央，再用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，倒置放置，待培养。 （六）培养：将接种好的平皿倒置于37℃温箱中培养，大约1-2天。 （七）平板划线分离纯化：将培养好的单个菌落分别挑取少许细胞接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养基上，置于37℃温箱中培养24小时左右，待长出菌苔，镜检其特征是否一致，有杂菌，需再一次分离纯化，直至获得纯培养。 (八)生孢培养：再分别挑取单个菌落划线接种于生孢培养基，于37度培养箱培养，直至长出单个菌落。 二、纯化菌株的鉴定： （一）观察菌落形态：观察平板菌落形态：菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，（二）观察菌体形态：
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。
第33讲化学实验方案的设计与评价 基础题组 1.(2017广东惠州第三次调研)下列实验设计能够成功的是() A.检验亚硫酸钠试样是否变质: 试样白色沉淀沉淀不溶解说明试样已变质B.除去粗盐中含有的硫酸钙杂质: 粗盐精盐 C.检验某溶液中是否含有Fe2+: 试样溶液颜色无变化溶液变为血红色溶液中含有Fe2+ D.证明酸性条件下H2O2的氧化性比I2强: NaI溶液溶液变蓝色氧化性:H2O2>I2 2.下列气体的制备和性质实验中,由现象得出的结论错误的是()
3.下列实验中,对应的现象以及结论都正确且两者具有因果关系的是()
4.(2017安徽江南十校3月联考)根据下列操作和现象所得到的结论正确的是()
5.(2017湖南郴州第三次质检)下列装置和试剂(尾气处理装置略去)能达到实验目的的是() 提升题组 6.(2017安徽马鞍山质检)下列实验装置或操作设计正确且能达到目的的是()
A.用甲装置制取氨气 B.用乙装置测定醋酸溶液浓度 C.用丙装置采集到的压强数据判断铁钉发生电化学腐蚀类型 D.用丁装置验证酸性:硝酸>碳酸>苯酚 7.(2017江西南昌一模)二氯二氢硅(SiH2Cl2)常用于外延法工艺中重要的硅源。易燃、有毒,与水接触易水解,沸点为8.2 ℃。在铜催化作用下,HCl与硅在 250~260 ℃反应可以制得SiH2Cl2。 (1)以浓硫酸、浓盐酸为原料,选用A装置制取HCl,利用了浓硫酸的 性。 (2)D装置中生成二氯二氢硅的化学方程式 为。 (3)按照气体从左到右的方向,制取SiH2Cl2的装置(h 处用止水夹夹好)连接次序为a→() →()→()→()→()→()→()(填仪器接口的字母,其中装置C用到2次)。