枯草芽孢杆菌发酵培养基优化
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摘要 (1)
ABSTRACT (2)
第一章绪论 (3)
1.1枯草芽孢杆菌简介 (3)
1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3)
1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3)
1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3)
1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4)
1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4)
1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4)
1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材
料 (5)
1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5)
1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6)
1.4研究的思路、目的及意义 (7)
第二章材料与方法 (7)
2.1实验材料 (7)
2.1.1 菌株鉴定 (7)
2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8)
2.2 培养基的优化 (9)
2.2.1 培养方法 (9)
2.2.2实验流程 (9)
2.2.3实验方法 (10)
2.2.4正交试验 (11)
第三章结果和分析 (11)
3.1 鉴定结果如下 (11)
3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16)
3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19)
3.4 实验总结 (25)
致谢 (27)
摘要
枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
ABSTRACT
Bacillus subtilis is the main feed probiotic strains, in this thesis, G18 and G21 to twoB acillus subtilis culture lag phase and doubling time for the evaluation and shaking cultur e flask, an the two factors and three levels orthogonaltest, the main components ofthe fe rmentationmedium, soybean meal processing protease plus the amount of 2u / gsoybean meal, 5u / g, soybean meal, 10u / g of soybean meal and corn syrup added0.5%, 1.0%, 1. 5% do two factorsthe three-level orthogonal experiments, studies show that: G18, bes t medium: 0.5% glucose, starch 3%, soybean meal 3%, corn steep liquor1.0% yeast 0.5% , 0.2% disodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate 0.1%, manganese sulfate 0.01 %, a common amylase 2u / g, starch, protease added 10u / g,soybean meal. G21 the bes t medium: glucose 0.5%, 3% starch, 3% soybean meal, corn steep liquor 1.5%, 0.5% of t he Yeast, disodium hydrogen phosphate 0.2%, magnesium sulfate 0.1% and 0.01%, man ganese sulfate, common a amylase 2u / g starch, proteaseadded 5u / g soybean meal.. [Keywords] Bacillus subtilis Medium optimization Orthogonal test
第一章绪论
1.1枯草芽孢杆菌简介
枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等。
1.2枯草芽孢杆菌的应用
1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用
工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。
1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用
枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、
灰霉病等病害。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。
1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用
枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。如，研究发现猪采食含107CFU／g枯草芽孢杆菌制剂的饲粮3周后，粪中双歧杆菌数量显著上升，而链球菌和梭菌的数量则显著下降，且这种趋势仔猪较母猪更明显；猪饲料中添加枯草芽孢杆菌不仅可以提高饲料转化率和氮利用率，而且可以减少氨的产生。此外，枯草芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等特性，在饲料加工中保存良好，有利于推广应用。1996年，枯草芽孢杆菌作为我国农业部正式批准的6种生物兽药之一已投入工厂化生产。
1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用
国家级一类新药白天鹅气雾剂以枯草芽孢杆菌作为有效成分，主要用于治疗和预防烧伤和各种外伤引起的各种细菌感染，其作用机理是通过枯草芽孢杆菌活菌在创面上定殖、增殖而发挥生物拮抗作用，达到抗感染、促进刨面愈合的作用。
1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用
在水产上运用的芽孢杆菌主要是枯草芽孢杆菌。在水体或饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂，可以有效抑制或杀灭水体中或养殖生物体内的某些有害致病菌，并且能增强有益菌的群落，而达到防治水产疾病的目的。芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，可降解饲料中的某些抗营养因子，饲料转化率提高8％以上，促进鱼类生长。芽孢杆菌可以降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，从而起到改善水质的作用。芽孢杆菌还可以通过消灭病原体或减少病原体的影响来改善水质。
1.2.6 枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料
枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。目前国际上在遗传工程中使用的芽孢宿主菌几乎全部来自Spizien及其学生建立的枯草芽孢杆菌169菌株转化系统，它同另一种常用大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可以将转入目的基因表达出的产物分泌到细胞体外，这就降低了进一步收集、分离和纯化基因表达产物的成本和工作量。枯草芽孢杆菌能够在生长过程中产生有用代谢产物，且大部分直接分泌到培养基中，这在简化生产工艺的同时，也存在菌株自身分泌的降解性蛋白酶会影响表达产物的稳定性甚至会破坏表达产物的缺点。近年来有人构建的双蛋白酶和三蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌DB104和DB403菌株将有助于提高目的基因表达蛋白的稳定性。这些都为枯草芽孢杆菌的广泛应用奠定了基础。
1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用
尹文林等不同养殖水体用20亿／g枯草芽孢杆菌B115株0.5 mg／L后，对养殖水体的溶氧和pH无明显的影响；氨氮最大降解值出现在使用后的第3~4天，平均降低(45.40±5.06)％；亚硝酸盐氮的最大降解值出现在使用后第3天，平均降低率为(16.03±3.82)％；硫化物的最大降解值出现在使用后第 3.4天，平均降低率为(23.01±7.27)％。与对照组相比有明显差异(P >0.1)，对总大肠茵群也有明显的抑制作用。胡咏梅等以5种模拟的污染水样对枯草芽孢杆菌FY99-01菌株的净水作用进行了研究。结果表明，该菌株能迅速降解有机物，在不同处理条件下水样的COD值都有明显的下降，48 h COD的去除率达67%以上，96 h厌氧条件下反硝化强度为50.2%，好氧条件下为28.6%，144h总残渣、过滤性残渣的降解率分别为61.3%和24.1%，96h 降解硫化物达100%。此外，枯草芽孢杆菌在降解多环芳烃和乐果方面也有较好的应用前景。李丽等从长期受多环芳烃污染的土壤中分离出1株菲降解菌—菌Ⅱ，经生理生化及16SrDNA析鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌。在单基质菲、芘反应体系中，该菌株具有较强的降解能力。菌不但可以在高浓度的多环芳烃存在下生长良好而且对高浓度多环芳烃有较高的降解能力。马丽娜等筛选出的一株枯草芽孢杆菌在乐果浓度为1000mg／L时，48h的降解率l8.1％。
1.3 国内外的研究现状与发展趋势
国外对枯草芽孢杆菌的研究起步比较早，1945年Johnson等报道，枯草芽孢杆菌具有防治植物病害的作用。此后，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究成为国内外研究的热点。1980年Papavizas G C报道，枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害。1992年Hwang等报道，用枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的Rhizoctoni根腐病。20世纪90年代后，国外已有多种枯草芽孢杆菌制剂投放市场。美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)QST 713菌株和QST 2808菌株分别开发出活菌杀菌剂Serenade TM和Souata AS，已在美国登记使用，叶面施用可防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病[9][10]等细菌和真菌病害。GBO3(商品名为Kodiak)和MBI 600(商品名为Subtilex)分别由美国Gustafson公司和Microbio Ltd公司开发，根部施用或拌种可防治镰刀菌(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)和丝核菌属(Rhizoctonia spp.)引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害。2001年Gustafson 将解淀粉枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂，称为BioYield。解淀粉枯草芽孢杆菌变种(B.subtilis var.amyloliquefaciens FZB24)作为植物促长剂被Taensa公司商品化生产，商品名Taegro TM。施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部，可防治由镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病。俄罗斯全俄植保所开发了枯草芽孢杆菌可湿性粉剂Alifine-B，可用于防治多种作物真菌(Fusarium，Rhizoctonia，Ascohyta，Colletotrichum，Sclerotinia，Botrytis，etc)病害，田间防效高达60％~95％，增产达25％~35％；另一枯草芽孢杆菌产品Gamair由活菌和代谢物组成，主要防治由Clavibacter michiganense subsp.Michiganense，Erwinia caratovota subsp.Caratovola和Pseudomonas corrugata引起的番茄细菌病害。韩国Bio公司将枯草芽孢杆菌与链霉菌抗生素、植物抗真菌多糖混合制成生物杀菌剂Mildewcide，叶面喷施可防治蔬菜和葡萄霜霉病、白粉病，也可防治花卉、水果和水稻真菌病害。
尽管当前化学杀菌剂在农药产业仍占主导地位。但枯草芽孢杆菌杀菌剂具有对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，因而更符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治(IPM)的要求。枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究已经积累了丰富的资料，具有重要的理论意义和指导生产价值。现代生物技术的广泛应用、基因组学和蛋白组学的发展以及先进的仪器设备的应用必将为枯草芽孢杆菌植物病害生防研究开发带来新的发展机遇。
1.4研究的思路、目的及意义
为了提高枯草芽孢杆菌的产量，而又降低工业生产的成本，在前人研究的基础上，我们以豆粕、玉米浆为主要原料的培养基作为枯草芽孢杆菌的发酵培养基，并对培养基中的蛋白酶添加量和玉米浆添加量作研究，研究它们对枯草芽孢杆菌生长的影响，然后做两因素三水平的正交实验，从而确定在工业生产中的最佳培养基。
第二章材料与方法
2.1实验材料
2.1.1 菌株鉴定
鉴定所用菌株是否为枯草芽孢杆菌，是否具有强的产蛋白酶能力。
2.1.2 培养基
LB液体培养基：1.0 g 胰蛋白胨, 0. 5 g 酵母粉, 1.0 g NaCl, 溶于100 mL 去离子水，121 ℃灭菌30min，4℃保存。
营养琼脂培养基：19.8g营养琼脂粉溶于600 mL去离子水，121 ℃灭菌30min。
供试发酵培养基：
1号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆0.5mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g 于10mL蒸馏水中，混匀，取12uL，100mL蒸馏水。
2号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.0mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g 于10mL蒸馏水中，混匀，取12uL，100mL蒸馏水。
3号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.5mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g
于10mL蒸馏水中，混匀，取12uL，100mL蒸馏水。
4号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆0.5mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g 于10mL蒸馏水中，混匀，取30uL，100mL蒸馏水。
5号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.0mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g 于10mL蒸馏水中，混匀，取30uL，100mL蒸馏水。
6号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.5mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g 于10mL蒸馏水中，混匀，取30uL，100mL蒸馏水。
7号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆0.5mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g 于10mL蒸馏水中，混匀，取60uL，100mL蒸馏水。
8号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.0mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取60uL，100mL蒸馏水。
9号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.5mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取60uL，100mL蒸馏水。
2.1.3 主要设备
仪器型号生产厂家
722型可见分光光度计070411060039上海精密科学仪器有限公
司
数显恒温水浴锅HH-4金坛市科析仪器有限公司电子天平JJ200型常熟市双杰测试仪器厂
电子万用炉DL-1北京市永光明医疗仪器厂立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-75SII上海博讯实业有限公司
pH计PHS-3C上海精科
隔水式恒温培养箱GSP-9160MBE上海博讯实业有限公司
恒温振荡培养箱TZ-2DH河北霸业长城医用设备厂双人单面净化工作台SW-CJ-1C 型苏州净化设备有限公司
光学显微镜XS—212南京江南永新光学有限公
司
冰箱展示柜冰箱展示柜澳柯玛
2.2 培养基的优化
2.2.1 培养方法
因为用的不同菌种但是实验操作都一样，在这里以G21为例。先用接种环接种1环试管菌种到LB液体培养基中，200r/min，37℃培养24h，进行扩大培养和活化，然后再取1mL液体种接种到供试发酵培养基中，37℃培养一段时间。
2.2.2实验流程
取出供试菌种→扩增菌种→摇床培养→倒入供试培养基中→摇床培养→定时测pH，镜检→画出pH曲线→找出延滞期、对数生长期→取对数期的两个时间平板计数
→算出倍增时间
2.2.3实验方法
pH的检测：用5mL移液枪吸取4mL发酵0h后的发酵液于5mL离心管中，测其pH，然后每隔两小时测一次，记录数据。
延滞期的判断: 画出枯草芽孢杆菌pH的变化曲线，在其达到最低点时大致可以判断结束延滞期。
对数期的检测：取一滴发酵到4h后的发酵液滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用结晶紫染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，观察画面中的杆数和对生数，判断是否进入对数期。在油镜下观察枯草芽孢杆菌的形状如下图。
图2.1油镜下的枯草芽孢杆菌
平板计数：用1mL移液枪吸取1mL到9mL无菌水中，摇匀得101 ，依次这样稀释到一个适当的稀释度，取0.1mL稀释液到无菌营养琼脂固体培养基中并涂匀，37℃培养24h，然后数培养皿上的菌落数。
倍增时间的计算：G =( T
2 –T
1
) /3.322(㏒X
2
-㏒X
1
)
T 1、T
2
——对数期的任意两个时间 X
1、
X
2——
与T
1、
T
2
对应的活菌数
2.2.4正交试验
以蛋白酶添加量﹑玉米浆添加量作为考虑因素进行条件筛选，设计3个因素水平，以倍增时间作为第一指标，延滞期为第二指标，设计L9（32）正交实验，因素水平表见表2-1。
表2-1 因素水平表
Table1The factor - level table
水平level
因素
蛋白酶添加量(u/g
豆粕)
玉米浆添加量
（%）
1 2 0.5
2 5 1.0
3 10 1.5
通过正交实验，可以得到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基的最佳条件。
第三章结果和分析
3.1 鉴定结果如下
1.G18 GGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCT GATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTG GGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGT TCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATT AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGA GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCG TGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTA
CCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAAC TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATT GGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGC TCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGA GTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGT GGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGG AGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAG TGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA CAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGG TCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGT GACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTA AGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCA TGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCA GCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCA GTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATG CCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA GTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAG GTGGACAGATGA
HM486416.1 Bacillus subtilis strain SFA6 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2678 2678 100% 0.0 99%
JF412545.1 Bacillus subtilis strain TUL322 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
2678 2678 100% 0.0 99%
CP002468.1 Bacillus subtilis BSn5, complete genome 2678 2.687e+04 100% 0.0 99%
HM027569.1 Bacillus subtilis strain zj2008 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2678 2678 100% 0.0 99%
GU250454.1 Bacillus subtilis strain BFE 5320 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
2678 2678 100% 0.0 99%
2.G21 GGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCT GATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTG GGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTNTGAACCGCATGGT
TCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATT AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCNACGATGCGTAGCCGACCTGA GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCG TGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTG CCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAA CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTAT TGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGG CTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAG AGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGG GAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA GTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC CTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAG GTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAG TGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCT AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATC ATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCA GCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCA GTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATG CCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA GTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAG GTGGACAGATGA
AY172513.1
Bacillus subtilis isolate BS-2 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
2673 2673 99% 0.0 99%
JF309257.1 Bacillus sp. 3639ABRRJ 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence 2671 2671 100% 0.0 99%
FR823399.1 Bacillus sp. ITCr07 partial 16S rRNA gene,
isolate ITCr07 2671 2671 100% 0.0 99%
HQ727971.1 Bacillus subtilis strain Aj080718IA-25 16S 2671 2671 100% 0.0 99%
ribosomal RNA gene, partial sequence
由上可知两菌株为枯草芽孢杆菌G18，G21。
G18和G21功能鉴定结果（与现生产菌株G18b比较）1.耐热性
芽孢耐热存活率（%）G18B G18 G21（纳豆芽孢杆
菌）
温度/时间菌存活率（%）
75℃（20min）96.43±0.89 83.21±1.06 85.58±0.97 80℃(10min) 69.34±1.73 79.79±1.38 70.79±1.38 100℃(5min) 42.03±0.73 52.06±2.60 30.13±0.02 2. 蛋白酶照片（培养48h后）
G21(纳豆芽孢杆菌)
平行一平行二
G21各平行光圈直径（mm）
光圈直
径（mm）
28 27.5 28 28 27.5 27.5 26 27
平均值
（mm）
27.44
G21-G18-G18B(1-2-3)
平行一平行二
平行三
1.G21
2.G18
3.G18B
各平行光圈直径（mm）
名称平行一平行二平行三平均值（mm）
G21 27.5 26 26.5 26.67
G18 30.5 30 30 30.17
G18B 29.5 26 28 27.83
总结光圈比较 G18>G18B>G21
通过以上照片及光圈直径比较可以看出，G21所产生的透明光圈在单独培养及与
G18,G18B混合培养中，其光圈直径基本一致，相差不大,可以确定其在混合培养中的直径在允许的范围之内；G18产蛋白酶的能力比其它两菌产酶能力强，G21与G18B 的光圈直径基本差不多（测量也存在一定的误差），可见其产蛋白酶的能力相差不大。
3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果
通过设计的两因素三水平确定L9（32 ）正交实验，接枯草芽孢杆菌的液体种1mL，在37℃下培养8h和12h后分别检测它们的活菌数，结果如下表。
表3-1 G21的活菌计数
蛋白酶添加量（u/g豆粕）玉米浆添加
量（%）
项
目
发酵8h后的活菌数
（105个/mL）
发酵12h后的活菌数
（107个/mL）
2 0.5 1 259 30 2 1.0 2 13
3 3.1 2 1.5 3 268 55 5 0.5
4 60 34
5 1.0 5 90 74 5 1.5
6 33 60 10 0.5
7 30 44 10 1.0
8 100 73 10 1.5
9 130 85
表3-2 G18的活菌计数
蛋白酶添加量（u/g豆粕）玉米浆添加
量（%）
项
目
发酵8h后的活菌数
（107个/mL）
发酵12h后的活菌数
（107个/mL）
2 0.5 1 75 136 2 1.0 2 27 55 2 1.5
3 2.6 1
4
5 0.5 4 20 98 5 1.0 5 11 80 5 1.5
6 70 156 10 0.5
7 52 175 10 1.0
8 16.2 75 10 1.5
9 12 40
算出倍增时间，结果如下
表3-3 枯草芽孢杆菌G21正交实验结果
项目蛋白酶添加量（u/g豆
粕）
玉米浆添加量
（%）
倍增
时间
1 2 0.5 1.31 2
2 2 1.0
3. 212
3 2 1.5 0.91 8
4 5 0.5 0.68 7
5 5 1.0 0.62 9
6 5 1.5 0.53 3
7 10 0.5 0.55 6
8 10 1.0 0.64 6
9 10 1.5 0.66 3
K
1
1.814 0.852
K
2
0.616 1.496
K
3
0.622 0.705
R 1.198 0.791
从正交试验的检测结果极差分析可以看出，影响试验效果的主要因素排序为蛋白酶添加量>玉米浆添加量。工业生产枯草芽孢杆菌G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务
目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)
摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
菌株MY 02发酵培养基的优化设计 Ξ 刘 秋,闫建芳,艾 勇,于基成,杨宝灵,范圣第 (大连民族学院生物工程研究中心,大连116600) 摘 要:以龟裂链霉菌MY 02菌株为试材,采用单因子试验与均匀试验相结合的方法,通过二次多项式回归分析,筛选出活性组分S N06最佳发酵培养基配方,并建立了多元二次回归数学模型。菌株MY 02优化发酵培养基的最佳配方:淀粉质量分数为2169%,花生饼粉质量分数为1139%,(NH 4)2S O 4质量分数为0118%,CaC O 3质量分数为0114%,NaCl 质量分数为0116%。根据回归模型计算出S N06理论效价与实测效价相比较,二者非常接近,拟合误差小。 关键词:龟裂链霉菌;农用抗生素;均匀设计试验;发酵条件 中图分类号:Q932335 文献标识码:A 文章编号:100025684(2006)0420361204 Optimization of Fermentation Culture Medium of Isolate MY02 LI U Qiu ,Y AN Jian 2fang ,AI Y ong ,Y U Ji 2cheng ,Y ANG Bao 2ling ,FAN Sheng 2di (Research Center o f Biotechnology ,Dalian Nationalities Univer sity ,Dalian 116600,China ) Abstract :Active com ponents S N06in fermentation of Streptomyces rimosus MY 02show antag onism a 2gainst pathogen 1It is a basic im plementation for production of S N06that screens medium ingredients and corresponding dosage 1In this study ,the optimum medium ingredients and dosage of Streptomyces rimosus MY 02were determined using uniform design combined with regression analysis 1A regression m odel was developed 1The optimum medium was starch 2169%,peanut steep powder 1139%,(NH 4)2S O 40118%,CaC O 30114%and NaCl 0116%1The regression m odel was tested with titre of S N06.The tested result fitted well with those calculated with the m odel 1The results confirmed the applicability of uniform design for screening the best medium ingredients for S N061 K ey words :Streptomgces rimosus ;agricultural antibiotic ;uniform design experiment ;fermentation con 2 dition 新型农用抗生素S N06是由龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus )MY 02菌株产生的一种多烯大环内酯类抗生素[1]。该抗生素对多种蔬菜真菌病害(如番茄叶霉病、灰霉病、黄瓜枯萎病、茄子黄萎病等)都有较好的防治效果[2]。目前对龟裂链霉菌报道较多的是其能够产生抑制各种细菌生长的重要抗生素———土霉素,但土霉素对真菌的生长没有抑制作用。目前关于龟裂链霉菌能够产生抑制植物病原真菌生长的代谢产物的报道较少[3]。筛选龟裂链霉菌产生的抗真菌活性组分S N06的优化发酵培养基是高效、大量生产S N06 的基础。本试验拟通过单因子及均匀试验对S N06的摇瓶发酵条件进行优化,为进一步的中试 放大及大规模生产提供必要的前提。 1 材料与方法 111 菌种 试验用菌株为大连民族学院微生物工程实验 室自番茄保护地分离的1株链霉菌菌株,经鉴定为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus )MY 02菌株。活性检测指示菌为番茄叶霉病菌(Fulvia f ulva )。 Ξ基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(20022085),辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(2004F079) 作者简介:刘 秋(19692),女,博士,副教授,主要从事植物病原微生物研究。收稿日期:2005207207 修回日期:2005212210 第28卷第4期吉 林 农 业 大 学 学 报V ol 128N o 14 2006年8月Journal of Jilin Agricultural University August 2006
毕业论文文献综述 生物工程 高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化进展 1 前言 淀粉酶( amylase，EC 3. 2. 1. 1)以淀粉或糖原为底物,是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称。它能从分子内部水解α- 1, 4- 糖苷键, 广泛存在于动物、植物和微生物中。如今淀粉酶在酶市场销售中占据了约25％的比例，应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织、石油开采等行业。由于该酶是一种有内切活性的淀粉酶, 可在中性pH 条件下将淀粉水解为糊精、寡糖、麦芽糖和葡萄糖等, 从而使黏稠的淀粉糊很快失去黏性而液化, 碘的呈色反应很快消失, 故又称为淀粉液化酶[1，2]。此外它也可作为促消化剂运用于食品[3]、医药工业．淀粉酶的巨大潜力使其在当今社会中需求量日益提高．因此，如何获得高产量、高活性的淀粉酶显得至关重要。 2 淀粉酶生产菌株的筛选 2.1 初筛 将在土壤中收集得到的菌株划线接种在淀粉培养基平皿上培养2～4 d，采用革兰氏碘液染色，在菌落周围有透明圈产生证明为产淀粉酶。用游标卡尺分别测量透明圈直径和菌落直径，根据两者比值大小初步确定酶活性的高低。[4] 但应保存所有产淀粉酶的菌株以用来复筛，因为同一菌株在不同的培养基以及不同的培养条件下产酶的情况可能不同。在平皿上生长和在发酵液中培养也可能会有很大的差别。 2.1 复筛 在淀粉酶生产菌株筛选的过程中，最关键的是其产物，也就是淀粉酶的酶活的检测。由于测定原理和底物性质的不同，淀粉酶的测定方法已经超过200种以上。[5]这些方法可以归纳为两类：天然淀粉底物方法和（分子组成）确定的底物方法。以天然淀粉底物为底物的测定方法，如淀粉分解法、糖化法和色素淀粉法等。由于天然淀粉分子结构的不确定，故不同植物来源的淀粉和不同批号的淀粉，其分子结构和化学性质不尽相同，因此难以达到方法学标准化，测定误差较大。[6]目前除碘·淀粉法和DNS外，这类方法已被淘汰。使用（分子组成）确定的淀粉酶底物和辅助酶与指示酶组成的淀粉酶测定系统，可以改进酶反应的化学计
课程设计说明书 课程名称：新编生物工艺学 设计题目: 培养基优化设计 院系：生物与食品工程学院 学生姓名： 学号：200806040035 专业班级：08生物技术 指导教师：关现军 2011 年6月3 日
课程设计任务书
目录 1.摘要··页码 2.关键字··页码 3.设计背景·页码 3.1培养基简介··页码 3.2培养基优化设计的重用意义··页码 4 设计方案·页码 4.1原材料制备··页码 4.2菌种的选择··页码 4.3营养因子的比例设··页码 4.4理化条件控制··页码 4.5总工艺流程列叙··页码 5 预期结果··页码 6 方案实施时可能出现的问题与对策·页码 7 设计感受··页码 7.1 关于本方案··页码 7.2 关于自我··页码 8参考文献··页码 .
1 摘要 以改良ＭＲＳ发酵培养基为墓础，选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、际蛋白陈等７个营养因子增菌培养乳酸菌进行优化。利用Ｌ8（２的7次方）正交实验，优化出培养墓营养因子最佳组成是：玉米浆３％、牛肉膏１％、乳糖１％。研究结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的ＭＲＳ培养基发酵液中，３７℃培养２０ｈ，菌落数均高于原ＭＲＳ培养基发酵液的菌落数，达到１护ｃｕｍＬ以上，乳酸菌发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约４0％，同时使菌种数量达到最大。 2 关键字 乳酸菌，营养因子，优化培养，最大产菌 3. 设计背景 3.1乳酸菌培养基简介 乳酸菌工业产品为菌体本身细胞，因而设计出能增菌的培养基在工业上具有重要意义。设计选用工业上佳美低廉的原料，便于降低成本，也有利于降低菌种的适应期，利于增值。 乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂,影响生长的因素多,在实际工作中还应做其他条件的优化,如增菌液氧化还原电势、pH值、温度等,因工作量大而时间有限,只能对配方作初步的优化设计。为了降低生产成本,在工业应用时可选用乳清和脱脂乳经蛋白酶水解,用以提高增菌效果,再加入乳糖、啤酒酵母的自溶水解物,在发酵罐内完成乳酸
培养基的设计与优化 原料：碳源,氮源 十大元素: 碳, 氢, 氧, 氮, 磷, 钾, 硫, 钙, 镁 微量元素: 硼, 锰, 锌, 钼, 钴, 碘, 铜, 等 生长因子、前体和产物促进剂 生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子，生长因子对发酵的调控起到重要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。 前体 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接为微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。产物促进剂 指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。其提高产量的机制还不完全清楚，其原因可能是多方面的，主要包括：有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。 水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 培养基的设计与优化 目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。 培养基设计的基本步骤是： 1.根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分. 2.通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分。 3.当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。这些实验往往基于多因子实验，包含均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。
方法一： LB培养基、平板保存的工程菌HB101/pJJ－rhIFNα2B、Amp、酵母提取物、蛋白胨、 10×SAE、100×MgCl2、100×TES、Tris、HCl 10×SAE配方(1L)： KH2PO410g、K2HPO4·3H2O52.4g、NH4Cl10g、K2SO426g 100L 【步骤】 种子制备： 1、取100mLLB培养基加入到一无菌的500ml三角形中，同时加入100μl100mg/ml的Amp。 2、接种甘油管保存的工程菌HB101/pJJ/rhIFNα-2b100μl，使工程菌分散于培养液中。 3、盖好试管，在摇床上以220rpm的速度，于37℃培养至对数中期（约5小时） 上罐准备： 1、配置500ml10×SAE 2、配置发酵培养基(3L)
称取胰蛋白胨30g，酵母提取物90g，加入2.64L去离子水，搅拌溶解后加入300ml 10×SAE、30ml100×MgCl2、30ml100×TES。 3、将培养基加入到5L发酵罐，插入pH、溶氧电极和温度探头，装上空气过滤膜，包扎好后放入灭菌锅中，同时放入一瓶250ml30%磷酸（调pH用），于1.05kg/cm2高压下蒸汽灭菌30min。 4、待灭菌结束后，将发酵罐放在冷却底座上，开启发酵罐控制系统，联接好冷凝水、空气线路。 5、控制pH=7.4，在转速650r/m、通气量3L/min 定D.O.为100％于自动控制发酵罐上37℃发酵22小时。 6、当培养基温度冷却到37℃后，接入制备好的种子 7、从接种完时刻起，每两小时取适当量样品，其中取1ml用于测菌体浓度（A600nm）；另取1ml加入到一称过重ep管中，12000rpm离心，小心取出900μl上清用作测菌体浓度的空白，甩干后再次称重，计算菌体湿重，按每8.3mg菌体湿重加入300μL水重悬菌体，冻于-20℃备用。并记录发酵罐上溶氧、pH、温度等参数以了解工程菌的生长状态。 8、SDS－PAGE检测不同时间rhIFNα2B的表达情况。 9、发酵终了，收集发酵液，8000rpm离心10min，回收菌体。 10、用1.2L去离子水重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清 11、再用600mlTE重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清,得到菌体-20℃保存 方法二： 2.1种子培养基的配制 LBA：（Tryptone蛋白胨10g ＋Yeast Extr+acts酵母粉5g ＋NaCl 5g ＋双蒸水1L）∕L （NaOH调节PH至7.0）高压蒸气灭菌，压力：0.14Mpa 温度121℃时间：20min，用前加卡那霉素至50μg/ml。 LBA平板：加入2%琼脂粉，其余同上。 2.2生产菌种的制备 2.2.1琼脂培养基菌种的制备 从－80℃的冰箱中取出甘油种子管，在超净工作台中划LBA平板，37℃培养箱中培养过夜。2.2.2一级种子液制备 从LBA平板中挑取单菌落，在超净工作台上接种于约60ml LBA培养液中，与摇床上37℃，180rpm，生长16h，OD600值约为3.0。 2.2.3二级种子液制备 将60ml一级种子液接种于3L LBA 培养液中，于摇床上37℃，180rpm，生长12h，OD600值约为3.0。 3.发酵
一、绪论 1、发酵工程（Fermentation Engineering）：指在最适发酵条件下，在发酵罐中大大量培养细胞和生产代谢产物的技术。 2、发酵工程研究内容：发酵工艺主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件，如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。 3、发酵工程的特点：一个完整的发酵工程包括： （1）材料的预处理（即培养基的制备过程）； （2）生物催化剂的制备（要选高产、稳定、高效、容易培养的菌株作种子或利用固定化酶或固定化细胞）; （3）生化反应器及发酵条件的选择和监控（生物反应器是进行生物反应的核心设备）； 4、细胞融合技术：基因操作技术能定向的制造出新的有用的微生物。 5、发酵工程的最基本的问题是过程优化与放大。 二、菌种的选育 1、代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 3、自然界中有目的微生物分离的一般过程： 土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 采样时要注意的问题：气候、水分、空气，来源要广结合产品的特点，标签：地点、时间、气候等 3、目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 富集的三种方案： （1）定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养； （2）当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑； （3）不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法；定向培养的方法：物理方法：加热、膜过滤等，但主要是通过培养的方法 4、菌落的选出 （1）从产物角度出发：在培养时以产物的形成有目的的设计培养基，利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素； （2）从形态的角度：菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别； 5、菌种选育分子改造 目的：（1）防止菌种退化；（2）解决生产实际问题；（3）提高生产能力；（4）提高产品质量；（5）开发新产品； 方法：（1）基因突变：自然选育、诱变育种； （2）基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程； （3）基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法shuffling;
文献综述 发酵培养基的优化 申请学位：学士学位 院（系）：药学院 专业：生物技术 姓名：张永芳 学号：114080107 指导老师：张小华（讲师） 二O 一五年六月五日
文献综述： 发酵培养基的优化 张永芳：114080107 指导老师：刘向勇 【摘要】：发酵，这一门悠久的技艺，在古今中外的生产生活与科学研究中扮 演着不可或缺的角色。在实验室发酵过程中,经常需要通过试验来寻找研究对象的变化规律,这些对象包括培养基的设计、工艺参数等;而这些变化规律的寻找就要通过科学的试验设计与数据分析来实现。通过对规律的研究达到各种实用的目的,比如提高产量、降低消耗、提高产品质量等,特别对于新菌种、新产品的试验。本文对发酵培养基优化的基本方向进行了综述,并比较了常用的试验设计与数据分析方法。 【关键词】：发酵、发酵培养基、优化、最优组合、响应面法优化 【内容】： 在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。培养基优化，是指面对特定的微生物，通过实验手段配比和筛选找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。目前，对培养基优化实验进行数学统计的方法很多，下面介绍几种目前应用较多的优化方法： 响应曲面分析法:Box和Wilson提出了利用因子设计来优化微生物产物生产过程的全面方法，Box-Wilson方法即现在的响应曲面法（(Response Surface Methodolog，简称RSM）。RSM是一种有效的统计技术，它是利用实验数据，通过建立数学模型来解决受多种因素影响的最优组合问题。通过对RSM的研究表明，研究工作者和产品生产者可以在更广泛的范围内考虑因素的组合，以及对响应值的预测，而均比一次次的单因素分析方法更有效。现在利用SAS软件可以很轻松地进行响应面分析。 改进单纯形优化法:单纯形优化法(Modified simplex method)是近年来应用较多的一种多因素优化方法。它是一种动态调优的方法，不受因素数的限制。由于单纯形法必须要先确定考察的因素，而且要等一个配方实验完后才能根据计算的结果进行下一次实验，因此主要适用于实验周期较短的细菌或重组工程发酵培养基的优化，以及不能大量实施的发酵罐培养条件的优化。 遗传算法:Genetic algorithm法是一种基于自然群体遗传演化机制的高效探索算法，它是美国学者Holland于1975年首先提出来的。它摒弃了传统的搜索方式，模拟自然界生物进化过程，采用人工进化的方式对目标空间进行随机化搜索。它将问题域中的可能解看作是群体的一个个体或染色体，并将每一个体编码
微生物发酵培养基的优化方法 作者：余继叁中国热带农业科学院热带生物技术研究所 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步[2]。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）[7]。设计发酵培养基时还应时刻把工业应用的目的留在脑海里[22]。 1 发酵培养基的成分 现代分离的微生物绝大部分是异养型微生物，它需要碳水化合物、蛋白质和前体等物质提供能量和构成特定产物的需要[2]。其营养物质一般包括碳源、氮源（有机氮源、无机氮源）、无机盐及微量元素、生长因子、前体、产物促进和抑制剂等。另外，在设计培养基时还必须把经济问题和原材料的供应问题等因素一起考虑在内[6]。 此外，还要考虑所筛选的菌种来源的地点环境，比如本实验室长期从事红树林微生物的分离及其研究工作，红树林的环境处于海洋与陆地之间，所以配制培养基所用的水除了 一般的去离子水外还包括陈海水。 如果在知道产物结构或者产物合成途径的情况下，我们可以有意识地加入构成产物和合成途径中所需的特定结构物质。我们也可以结合某一菌株的特定代谢途径，加入阻遏或者促进物质，使目的产物过量合成。例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体α-氨基已二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激赖氨酸的合成。这是因为α-氨基已二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少α-氨基已二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。 ２发酵培养基的设计和优化 由于发酵培养基成份众多，且各因素常存在交互作用，很难建立理论模型；另外，由于测量数据常包含较大的误差，也影响了培养基优化过程的准确评估，因此培养基优化工作的量大且复杂[8]。许多实验技术和方法都在发酵培养基优化上得到应用，如：生物模型（Biologicalmimicry）、单次试验（One at a time）、全因子法（Full factorial）、部分因子法（Partialfactorial）、Plackett andBurman法等。但每一种实验设计都有它的优点和缺点，不可能只用一种试验设计来完成所有的工作[22]。 2.1 单次单因子法
课堂报告名称：高产微生物油脂菌株培养基及发酵条件优化方法 一、课堂报告依据的知识背景 1. 培养基及其分类 人类想要研究利用微生物，就必须先培养微生物。培养微生 物要有适合微生物生长繁殖的环境条件，还要适宜的营养条 件。由人工配置的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营 养基质，称作培养基。 ◆按用途分类：增殖培养基；选择培养基；鉴别培养基。 ◆按状态分类：液体培养基；固体培养基；半固体培养基。 ◆按化学成分分类：天然培养基；合成培养基；半合成培养基。 ◆按目的分类：种子培养基；发酵培养基。 1）. 培养基包含成分 a)水：水分是微生物重要组成部分，微生物不能脱离水而生 存，微生物所需的营养也只有溶于水才能很好地吸收，水 利于调节细胞温度，保持细胞生活环境的温度恒定。水分 为两种状态，自由水和结合水。前者以游离态存在，是细 胞内的溶剂；后者与细胞内其他成分结合，不易蒸发，不 冻结，不渗透，也不能作为溶剂。 b)碳源：提供为生物细胞组成和代谢产物中碳素来源的物质。 提供微生物生长繁殖所需的能量。 碳源分类很多，无机碳化合物有二氧化碳、碳酸盐等；有
机含碳化合物，如糖类、醇类、有机酸、蛋白质及其分解 产物。 c)氮源：可提供为生物细胞组成和代谢产物中氮素来源的物 质。氮源用来合成氨基酸和碱基进而合成蛋白质、核酸等 细胞成分以及含氮代谢产物。 氮源分类： 1.分子态氮，存在大气中，仅有少数微生物可以利用； 2.无机态氮，如铵盐、硝酸盐等，多数微生物可以利用； 3.有机态氮，蛋白质及各种分解产物、尿素、嘌呤碱、 嘧啶碱等。 d)能源：提供微生物生命活动过程中所需的能量来源的物质。 异养微生物能源为碳源；自养微生物能源是日光。 e)生长因子：微生物不能自行合成，但生命活动又不可缺少 的微量有机营养物质。 功能：构成细胞的组成成分，如嘌呤、嘧啶是核酸的组成 成分；调节代谢，维持正常的生命活动。 自养微生物不需要生长因子，能自行合成；异养微生物有三 种情况：有些异养微生物需要生长因子，如谷氨酸的短杆菌， 需要添加生物素才能使菌体生长良好；有些不需要生长因子； 有些不但不需要还能在自身积累某些维生素，如肠道微生物 分泌大量维生素供机体吸收利用，大肠杆菌合成维生素K。 f)无机盐类：微生物生长过程中不可缺少的营养物质。从量
第37卷第1期 2007年2月 工业微生物 Industrial Microbiology Vol.37No.1 Feb.2007 基金项目:厦门市科技计划资助项目(编号:3502Z20031079);作者简介:王颖(1983～),女,硕士研究生; 3通讯作者。Tel :86-592-2183088;Fax :86-592-2184822;E 2mail :ylu @https://www.doczj.com/doc/0e9431382.html, 酿酒酵母S.cerevisiae 高密度培养条件优化研究 王 颖, 何 宁, 李清彪, 邓 旭, 卢英华3 (厦门大学化学工程与生物工程系,厦门361005) 摘 要 考察了培养基组成和培养条件对酿酒酵母S accharom yces cerevisiae 发酵的影响。以TB 培养基为初始培养基,通过正交实验设计优化培养基组成,确定了影响酵母细胞产量最主要的 因素是葡萄糖,最适培养基组成为:酪蛋白胨15g/L ,酵母粉25g/L ,葡萄糖30g/L ,KH 2PO 42.4g/L ,K 2HPO 4?3H 2O 16.34g/L 。并确定了最佳培养条件:温度30℃,转速150r/min 。采用优化 培养基及培养条件下进行发酵,菌液最高OD 600值和细胞密度分别达15.82和2.03×108/mL ,比优化前分别提高24.2%和22.0%。 关键词:酿酒酵母; 培养基; 培养条件; 正交实验 近代基因技术的进步使人们可以利用微生物大量生产高价值的生物药物及其它重组蛋白。发酵产物的多少通常与细胞密度的高低关联,因此发酵过程的首要任务通常是研究如何尽可能地达到高的细胞密度,以便提高生产率、简化下游加工、减少废水排放量、降低培养容积、生产成本及设备投资,使目的产物产生良好的成本效益[1]。 优化培养基是一种提高细胞密度的有效方法。培养基分复合培养基、半合成培养基和合成培养基三种[2]。合成培养基成分和浓度已知且可以控制,常用来获得高细胞密度;复合培养基含有提取物(如蛋白胨,酵母提取物),营养物的成分和质量可能不同,故复合培养基进行发酵过程的重复性较差。然而,复合培养基和半合成培基对促进产物生成是必要的,而且在复合培养基和半合成培基中,细胞生长往往比在合成培基中快[3]。为使细胞生长达到高密度,有必要设计一种含必需成分的平衡性营养培养基,以维持细胞生长,同时避免生长的抑制。 酿酒酵母(S accharom yces cerevisiae )作为人类利用最早的微生物,其营养成分十分丰富,含有菌体蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪、食物纤维、矿物元素、微量元素及生理活性物质等[4]。由于其具有 安全、生长繁殖快、代谢周期短、容易进行大规模培养、菌体蛋白质丰富等优点,一直是基础和应用研究的主要对象,并被广泛应用于酿造、食品、医药、饲料工业等领域[5]。近年来,世界各国均在积极采用微生物发酵技术开发酵母菌市场。此外,酿酒酵母还是外源基因理想的真核生物表达系统,并与盘基网柄菌 D.discoi deum 一起,于2000年被N IH 选为 标准微生物模型系统(http ://https://www.doczj.com/doc/0e9431382.html,/sci 2ence/)。 国内外对酿酒酵母菌培养的实验研究已有了较多的报道。Raj 等采用合成培养基,可获得140g/L 的细胞干重[6]。Park 等在内置膜过滤反应器内连续培养酿酒酵母,得到13g/(L ?h )的细胞干重[7]。赵宝华等探讨了外加Ca 2+、La 3+对酿酒酵母生长的影响[8]。梅乐和等研究了酿酒酵母微囊化培养过程[9]。此外,也有不少研究集中在基因工程和固定化技术于酿酒酵母生产中的应用[10～12]。本文以TB 培养基(一种培养大肠杆菌的简单复合培养基)为基础,考察了培养基成分和浓度,以及培养条件等对酿酒酵母发酵培养的影响,并利用正交实验对培养基进行了优化,开发出了一个适合高密度培养酿酒酵母菌的简单复合培养基。