乙酰肝素酶研究进展
乙酰肝素酶( heparanase, Hpa) 是近年发现的肿瘤重要功能酶, 是体内唯一能够降解糖氨聚糖中的硫酸乙酰肝素( heparan sulfat , HS) 链的内切糖苷酶,特异识别HS 侧链上的特异性位点, 可以在特
定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在各种蛋白聚糖中最
具生物活性,它参与多级联细胞粘附反应过程,并与粘附分子、细胞因子、细胞间信号分子等
相互作用,在影响细胞增殖、分化、迁移及形态等方面具有重要作用,在各种炎症损伤、缺血再灌注损伤、血栓形成及肿瘤转移等过程中具有重要功能。( heparan sulfate protoglycan,HSPG) , 将HS 裂解为10~ 20 个糖单位大小的短糖链, 并释放结合在HS 上的生长因子。乙酰肝素酶可促进细胞的浸润和转移, 还可以促进肿瘤细胞分裂、趋化、微血管形成。是目前在哺乳动物中发现的唯一一个可以剪切HSPGs 上HS 侧链的水解酶, 是抗肿瘤
的理想靶点。
细胞发生侵袭转移首先要穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障。该屏障主要有两种成分构成:一是结构蛋白, 包括胶原、层黏素、纤维结合素和玻璃体结合素等, 二是糖氨聚糖, 主要成分是HSPG,是
广泛存在于脊椎动物组织细胞外基质( extracellular matrix, ECM) 和细胞表面的复杂的生物大分子,是构成基底膜的主要成分。HSPG 主要由一个核心蛋白和数个与之共价连接的线性HS 侧链组成[ 1] ,HS 是由己糖醛酸和葡胺聚糖组成的重复单位构成。HSPG 能与细胞表面
及ECM 中的活性分子结合, 粘附于细胞表面, 是细胞外基质聚集和
稳定的基础, 拥有限制细胞迁移、粘附和选择性分子筛的重要作用, 还可以与多种生物活性分子结合并相互作用。
事实上HSPG 的降解是细胞侵袭前所必需的, 当HSPG 被乙酰肝
素酶降解后, 就会产生一系列生物学现象如妊娠形态发生、炎症反应、血管生成、肿瘤的侵袭和转移[ 2] 。
1 乙酰肝素酶分子特征
1. 1 乙酰肝素酶的主要结构
人类乙酰肝素酶基因约50kb, 定位于染色体4q 22, 与遗传标记
D4S400 相连, 包括14 个外显子和13 个内含子[ 3] 。通过不同的剪接, 此基因转录为5kb( HPSE1a) 和1. 7 kb ( HPSE1b ) 两种mRNA。HPSE1a 含有14 个外显子和13 个内含子, 而在HPSE 1b 中第1 个和
第14 个外显子被剪切掉了[ 4] 。1b 和1a 含有相同的开放性阅读框, 均编码含有543个氨基酸的蛋白质。Hpa cDNA 全长3 726 bp, 包含1 632 bp 开放读码框架, 乙酰肝素酶蛋白前体相对分子质量为65 @ 103 。在乙酰肝素酶的分子结构中, 有6 个可能的糖基化位点。糖链的作用可能是在蛋白转运过程和酶的分泌过程中承担动力学上的功能。
McKenzie 等研究报道了一个新的肝素酶亚型Hpa2, 其基因由乳
腺dDNA 文库克隆而来, 定位于10q23~ 24 上, 与Hpal 之间有高度
的同源性, 又分Hpa2a、Hpa2b、Hpa2c, 各自编码480、534、592 个
氨基酸残基[ 5] 。目前, 研究者认为, 很可能存在着一个乙酰肝素
酶蛋白家族, 它们有着不同的底物特性和许多潜在功能。
HPa1 基因mRNA 在脾脏, 淋巴结, 胸腺, 外周血白细胞, 骨髓
及胎盘等免疫组织中均可检测到, 而在胎盘之外的成熟非免疫组织
中均不表达, 但在转移的恶性肿瘤细胞中普遍存在[ 6] 。Hpa2 的cDNA主要在脑、乳腺、前列腺、睾丸和子宫中较高。HPa2在胰腺癌中有较高表达, 而其在正常胰腺组织中几乎无表达, 由于Hpa1 与Hpa2 分布不同, 推测两者可能有不同的功能。
关于乙酰肝素酶的两种剪切形式Ia 和Ib 受什么因素控制, 特别是在肿瘤细胞中, 这种控制因素是否被修饰或升高, 从而造成1a 向1b 剪切转变是值得研究的课题。
2 乙酰肝素酶的定位及活性调节
研究发现乙酰肝素酶主要定位于溶酶体, 乙酰肝素酶蛋白前体经翻译后最初表达在质膜, 与HSPGs 相互作用后, 被溶酶体摄入, 经过溶酶体蛋白水解酶加工最终形成的有活性乙酰肝素酶。多数学者认为, 在翻译后加工的过程中, N 端信号肽被切除, 形成乙酰肝素酶酶原前体, 在酶原激活的过程中, 特异性的蛋白水解酶将第110~ 157 位氨基酸组成的6 000 的肽链从前体蛋白中切割下来, 余下N端的8 000 多肽链与C 端的50 000 蛋白非共价结合成异源二聚体, 成为有活性的成熟的蛋白。大小两亚基之间的6 000 的连接片段的作用可能是通过封闭活性中心抑制了酶的活性。
Goldshmidt 等[ 7] 发现乙酰肝素酶定位于溶酶体和高尔基体, 故推测乙酰肝素酶合成后被转运至高尔基体, 随后以稳定的形式聚集于溶酶体。溶酶体作为乙酰肝素酶在细胞内的场所,限制了它的分泌,一旦失控, 可能与肿瘤的转移、炎症细胞渗出、内皮细胞血管增生等恶性过程发生。乙酰肝素酶的调控机制以及它的影响因素尚未明
了, 研究表明, 在正常生理条件下,肝素酶基因, 甚至酶蛋白本身
也同样存在, 只是表达量较低, 或者酶活性极低。
2. 1 乙酰肝素酶基因表达调控
乙酰肝素酶启动基因的去甲基化可以启动整个转录和翻译程序, 造成癌症发生、发展、转移等恶性表现。
Jiang 等[ 8] 和Lu 等[ 9] 的研究表明, Ets 启动子家族参与了肝素酶mRNA 在癌细胞中的表达。Lu发现Ets1、Ets2 有顺式激活恶性乳腺癌细胞系肝素酶基因的功能。Jiang 等强调Ets 成员之一GA 结合蛋白( GABP) 需要和Sp1 结合, 共同调控甲状腺肿瘤细胞系肝
素酶转录。应用反义寡核苷酸技术阻抑结肠癌细胞LS- 174T 中的eIF- 4E 基因表达, 结果显示乙酰肝素酶蛋白表达水平显著下降,
这表明eIF- 4E参与结肠癌细胞LS- 174T 中乙酰肝素酶的调控。Mest re 等[ 10] 发现早期生长反应基因- 1 ( EGR1)能影响乙酰肝素酶的表达和活性, 且在不同类型肿瘤中上调或下调乙酰肝素酶的机制
不同。Og ishima 等[ 11] 用EGR1 siRNA 转染T24 膀胱癌细胞后与对照组相比明显下调乙酰肝素酶表达。Ogishima等[ 12] 对髓母细胞瘤体外侵袭实验的研究表明, P75 神经营养因子受体( P75NT R) 和trk 受体家族成员( TrkC) 经由神经营养因子- 3( NT - 3) 激活后能增加乙酰肝素酶活性, 从而使细胞侵袭能力提高。还有Shteper 等[ 13] 报告高糖可以通过增强启动子活性来调整HPa- 1 基因的表达。
2. 2 乙酰肝素酶生物活性调控
乙酰肝素酶受pH 调控, 在pH 4. 0-7. 5 时, 表现有活性[ 14] 。
最佳内切糖苷酶活性是在pH 5. 5-5. 8 的之间, pH 值越高其活性越低; 炎症发生部位、血管闭锁引起缺血及肿瘤中心部位血管缺乏都将为乙酰肝素酶提供一个适宜的酸性环境, 使其发挥酶的最大降解活性。如果pH 大于8. 0 就会失去活性, 但却拥有黏附作用。失活的乙酰肝素酶和细胞外基质中的硫酸乙酰肝素结合, 被结合的肝素酶可以作为内切葡糖苷酸酶的储库, 以便炎症时能马上降解细胞外基质和血管基底膜, 便于白细胞向血管外和基质中游走。因此, 局部组织的pH 能够调节乙酰肝素酶的活性及存在形式。
细胞表面的HSPG 还具备肝素酶活性调节剂的功能。体外培养的细胞一定通过细胞表面的HSPG 将刚刚分泌的酶原迅速内吞活化成为具有活性的肝素酶, 而不是直接在胞内在蛋白水解酶的作用下活化。
3 内源因子调控
体外细胞培养研究表明, 在培养基中加入TNF-A、IL-1B可以使内皮细胞分泌肝素酶蛋白增加2-10倍, 而VEGF却可使肝素酶分泌降低。脂肪酸可以促进肝素酶mRNA 和蛋白质的分泌[15] 。雌激素( est rogen)可以诱导具有雌激素受体的乳腺癌细胞( MCF- 7) 肝素酶mRNA 的表达, 而在不具有雌激素受体的乳腺癌细胞系中则观察不到这一现象[ 16] 。表明: 内因子可以刺激细胞分泌肝素酶, 这种刺激其实也使细胞获得在可溶性ECM中游走的能力。
Temkin 等报道[ 17] ,嗜曙红细胞碱性蛋白( MBP)是一种肝素酶天然抑制蛋白, 嗜曙红细胞虽然分泌肝素酶, 但是由于MBP 的存在, 嗜曙红细胞内都检测不到肝素酶的活性。此外乙酰肝素酶可逐
渐被一些蛋白酶, 如胰蛋白酶和尿激酶等灭活[ 18]。
4 乙酰肝素酶的生物学作用
乙酰肝素酶作为HSPG 降解酶, 参与多种生理病理过程, 它具有以下生物学活性: 1通过降解细胞外基质和血管基底膜促进癌细胞
的侵袭和转移。o诱导血管生成, 通过促进细胞分裂、趋化, 胶原纤维降解等, 恢复凋亡细胞活力。也可直接促进血管内皮细胞的芽生和侵袭性生长通过促使HSPG 释放和活化肝素结合型的生长因子( 如bFGF, VEGF等) 诱导血管生成; 乙酰肝素酶还能加强蛋白激酶B/ Akt 信号转导途径, 激活邻近的内皮细胞, 刺激磷脂酰肌醇( - 3) 激酶依赖的内皮细胞的侵袭和转移,为血管生成创造条件[ 19] 。Imada T[ 20] 等通过对侵袭性乳腺癌研究表明, 肝素酶还可能通过COX- 2途径来促进血管生成。乙酰肝素酶还可增强脂质代谢, 促进血管的胆固醇化[ 21] 。?对HSPG 的降解产物, 可以抑制活化T 淋巴细胞的生物学功能引起免疫抑制。?释放结合在HS 中含有尿激酶型纤溶酶原激活物( uPA) 和组织纤溶酶原激活物( tPA) , 溶解基质网状结构。活化表皮生长因子( EGF) , 激活细胞外基质中的金属蛋白质酶( MMPs ) , 促进细胞的增殖和转移。?由于乙酰肝素酶对HSPG 的降解可促进平滑肌细胞增生, 因而可促进动脉粥样硬化的形成。?乙酰肝素酶对HS 和肝素的降解, 解除了拓扑异构酶?导致的解螺旋
抑制效应, 从而促进DNA 复制, 细胞增殖和转移。
4. 1 乙酰肝素酶促进肿瘤侵移机制
乙酰肝素酶的表达水平与肿瘤的转移有很大的相关性, 归纳如
下: 1、破坏限制肿瘤生长转移的屏障ECM 和BM;乙酰肝素酶降解HSPG, 与其他基质降解酶( 如MMPs、丝氨酸蛋白酶) 协同破坏、降解ECM 和BM 屏障, 促进释放内皮下u- PA 及t -PA, 激活纤溶酶原, 活化MMPs, 裂解ECM、BM 中结构蛋白。u- PA 和t- PA 还可通过活化表皮生长因子( EGF) , 激活细胞外基质中的蛋白酶联反应,使酶的屏障功能减退。2、介导细胞黏附: 表达于细胞表面的HPA 可介导细胞对ECM 及血管基底膜的黏附, 引起细胞在基质中的扩散以及促进BM 的重塑, 帮助肿瘤细胞侵入血管[ 22] 。3、增加癌细胞的侵移能力:裂解HSPG 后产生的HS 片段可激活HS的受体CD44v3( CD44 variantexon 3) , 发出细胞内迁移信号, 促使细胞变形、运动, 从而促进肿瘤细胞的扩散与转移[ 23] 。4、降解HSPG 后的产物可以抑制活化的T 淋巴细胞的生物学功能, 从而引起免疫抑制, 使肿瘤转移更容易。5、影响细胞分化:Nobuhisa T 等[ 24] 将肝素酶转导入人类乳腺上皮癌细胞内, 肝素酶被转运至核内, 发现核内肝素酶的表达会导致细胞
分化, 出现脂滴, 证实了肝素酶在对上皮细胞的分化方面的作用。此外肝素酶还可以诱导血管内皮细胞和肿瘤细胞组织因子( Tissue Factor,TF) 的表达[ 25] 。?还可能促进组织特异性生长因子的释放, 以选择特异性转移组织器官[ 26] 。总之,乙酰肝素酶通过降解ECM 和BM 中的HSPG, 破坏限制肿瘤转移的屏障, 增强肿瘤细胞的运动能力, 促进肿瘤转移, 这是肿瘤进展的重要机制之一。
4. 2 在胚胎和组织发育中的作用
胎盘组织是一种细胞滋养层侵入子宫内膜后形成的特殊结构,
滋养层细胞有很强的浸润能力。在人类胎盘中, 乙酰肝素酶的两种转录子都呈现高表达, 免疫组化发现, 在绒毛外滋养层细胞和合体滋养层中可以检测到乙酰肝素酶的表达。在绒毛内可以见到胎儿动脉和毛细血管内皮层的线型着色[ 27] 。
在滋养层细胞溶解物和此类细胞侵袭的ECM 中乙酰肝素酶活性很高, 可能是促进滋养层细胞侵袭基底膜和血管新生的重要因素[ 28] 。Wang[ 29] 等通过封闭胚泡细胞表面的乙酰肝素酶后, 观察大鼠胚泡滋养层分裂速度明显减弱, 这是由于乙酰肝素酶活性作用降低, 乙酰肝素降解产物减少, 结合在乙酰肝素上的各种活性物质的作用受到抑制, 滋养层细胞的分裂减速, 植入也受到影响。通过这些机制, 乙酰肝素酶对血管生成产生影响, 为胚胎组织的植入、生长、滋养层细胞的浸润和胎盘血管的形成奠定物质基础。
综上所述, 乙酰肝素酶的活性及表达水平与肿瘤的浸润、转移, 以及肿瘤细胞分裂、趋化、微血管形成有很大的相关性。对乙酰肝素酶的深入研究为肿瘤疾病的诊治开辟了新的途径。但尚有许多问题有待于解决: 1肿瘤细胞发生乙酰肝素酶基因表达的调控机制是什么? 它与正常组织表达乙酰肝素酶之间有什么区别? 2 既然乙酰肝素酶最初定位于细胞内, 那么只要乙酰肝素酶被限制在细胞内, 其促血管和转移活性就可被限制, 如何实现这一途径? 乙酰肝素酶正常和异常分泌的调节机制是什么? 3 还需联合其他各种蛋白水解酶的综合研究, 以寻找出一条能完全控制肿瘤发展的途径。乙酰肝素酶抑制剂对生理和病理过程如胚胎的发育、形态的发生及组织的修复、炎症
自身免疫的影响如何? 相关课题的研究有待深入开展。
72 食品与药品 Food and Drug 2013年第15卷第1期 肝素和硫酸乙酰肝素的功能 Rabenstein D L 内源肝素在肥大细胞内，是肥大细胞分泌颗粒的主要组成成分。内源肝素在医学上作为抗凝血剂使用，并在预防和治疗血栓栓塞疾病中被作为首选药物。硫酸乙酰肝素（HS ）在动物组织中广泛存在并且结构多样，同样也具有多种生物活性和功能，包括细胞黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程和血液凝固、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、血管发生、病毒入侵和肿瘤转移。HS 同样保护蛋白质不被降解，调控蛋白质通过基底膜转移，介导蛋白质内置。研究发现细胞表面的HS 蛋白聚糖（HSPG ）是动态的，它能快速向细胞表面转移并快速返回（t ?1-4 h ），并通过细胞变化改变HS 的结构以应答细胞外信号因子，例如，生长因子。肝素和HS 的作用机制涉及它们与蛋白质的非共价结合，以在蛋白质构象中发挥变化，促进蛋白质-蛋白质相互作用，使蛋白质在细胞表面分离并作为生长因子的复合受体发挥作用。因为肝素和HS 在调节生物活性方面的作用，在综述一些肝素和HS 的功能之前，本文将探讨蛋白质-肝素相互作用的一些重要特点。1 与蛋白的相互作用 HSPG 的HS 链及肝素与蛋白质的结合主要是静电的，涉及阳离子铵盐基、胍盐以及与肝素或HS 的阴离子部位相互作用的多肽或蛋白质的咪唑侧链功能基团。数百种与肝素结合的蛋白质已经被确认，且肝素结合性质经常被应用于它们的分离和纯化，即使用肝素亲和色谱。在很多情况下，涉及到阳离子肝素-结合域与高负电荷肝素之间的非选择性相互作用，这导致通过HS 的蛋白质结合是相对非特异性的。但是，研究者逐步认识到经设计的HS 的NS 和NA/NS 域中的特异序列可与特定蛋白质选择性相互作用，这种相互作用可用于调控蛋白质活性。结合的选择性可以通过一种“稀有”成分的使用来得到，例如，在肝素抗凝血酶结合戊糖序列中存在的GlcNS(3，6S)残基，它对于抗凝血活性是必需的。一种独特的结合表位也可以基于N -取代基模式，N -和O -取代基的特异性结合，或是NS （N -硫酸化域）、NA （N-乙酰化域）和NA/NS 域的长度和相对位置。其它已知的蛋白质结合序列是由常见的二糖组成。典型地，蛋白质结合涉及3～9个二糖单位，虽然包围在蛋白质低聚体表面的更长的序列也会被涉及。 肝素结合域已经在大量蛋白质中被确认。它们典型地含有相当多的碱性残基赖氨酸和精氨酸，且在某些情况下有组氨酸。除此之外，前文图所示六糖与FGF-2结合形成的复合体的X-线结构显示，某些其它氨基酸侧链的功能基团 ?知识介绍? 也可以与肝素相互作用，例如，谷氨酰胺的酰胺侧链。共有序列组成碱性残基簇，包括序列XBB-BXXBX, XBBXBX 和XBBBXXBBBXXBBX ，其中B 和X 分别为碱性氨基酸残基和其他氨基酸残基，上述序列被认为是蛋白质的肝素/HS 结合域。这些序列可以采用二级结构，在这种二级结构中碱性氨基酸沿着多肽链的一面对齐，X 氨基酸指向蛋白核心。 由于肝素和HS 的高负电荷密度，它们都是聚电解质，通过结合反离子中和部分负电荷。所以，结合反应是一个离子交换过程，结合多肽或蛋白质的阳离子部位即为反离子。反离子结合模型显示水溶液中的肝素钠的Na +部分被结合，为每一个负电荷是0.59；已经报道了0.58和0.63的实验值。聚电解质理论提示大部分结合自由能来自多糖Na +反离子熵的有利释放。离子交换机制的一个重要结果是随着NaCl 浓度增大结合程度降低。例如，组氨酸的双质子形式与肝素的相互作用结合常数从1.5×106（Na +浓度为0.001 mol/L ）降至7.7×102（Na +浓度为0.1 mol/L ）。通过相互作用Na +离子被取代的数目已经从结合常数对离子强度的相关性得到，该相关性通过23Na NMR 测得。2 肥大细胞中的肝素 肝素和组胺、肥大细胞蛋白酶及其它调控因子一起被储存在肥大细胞的分泌颗粒中。实验已阐明肥大细胞肝素的生理意义。通过敲除大鼠N -脱酰酶/N -磺基转移酶的基因，“正常”即硫酸化肝素的生物合成被阻止。这使得分泌颗粒中其它生物活性调控因子的数目改变，其中最显著的是一些小鼠肥大细胞蛋白酶的水平。可得出一个结论，肝素对于在肥大细胞内特殊颗粒蛋白酶的储存是必要的。 肝素与带有正电荷的肥大细胞蛋白酶之间相互作用的细节尚不清楚，一般认为这种相互作用导致只有正确折叠的蛋白酶才能被定向到分泌颗粒中。 组胺水平在异常肥大细胞中也同样下降，表明肝素对肥大细胞颗粒内组胺的储存发挥了作用。当肥大细胞颗粒的pH 值为5.2~6.0时，组胺以双质子形式（H 2A 2+）存在，这表明组胺在肥大细胞颗粒内通过与高负电荷肝素的静电相互作用储存。腹膜肥大细胞颗粒的体积和组胺含量随着年龄增大。2~7月龄大鼠腹膜肥大细胞中组胺的浓度估计为0.4 mol/L ，这足够用于直接在完整肥大细胞分泌颗粒和肥大细胞颗粒中通过1H-NMR 研究组胺。通过观察到的肥大细胞颗粒内的组胺的相对尖锐的1H 共振峰，研究者确认颗粒内的组胺是流动的。
类肝素酶与肿瘤微环境 作者：罗荣城， 杨洋， 崔瑶 作者单位：南方医科大学南方医院 本文读者也读过(10条) 1.陈丽.李军民肿瘤微环境——慢性淋巴细胞白血病治疗新方向[期刊论文]-国际输血及血液学杂志2008,31(3) 2.赵坡.钟梅.宋欣.吕亚利.王殿军.顾峥.陈乐真肝素酶基因表达与肺癌转移活性的初步研究[期刊论文]-中国肺癌杂志2001,4(2) 3.段学燕.龙金华.肖静.曾柱肿瘤微环境对树突细胞功能状态的影响[期刊论文]-贵阳医学院学报2004,29(5) 4.张伟MT1-MMP、MMP-2及HPSE与胰腺癌神经浸润、转移及预后关系的研究[学位论文]2007 5.范平生.汪瑛.冯克海.FAN Ping-sheng.WANG Ying.FENG Ke-hai肿瘤微环境对肿瘤免疫的影响[期刊论文]-安徽医药2005,9(9) 6.陈礼平.王敏肿瘤微环境树突细胞诱导免疫耐受产生的机制及相关治疗策略[期刊论文]-国际输血及血液学杂志2007,30(2) 7.谢启超.王玲俐.陈正堂.XIE Qi-chao.WANG Ling-li.CHEN Zheng-tang肿瘤微环境内免疫耐受机制研究进展[期刊论文]-现代肿瘤医学2008,16(5) 8.王吉刚.陈幸华血液系统肿瘤微环境与耐药关系的研究进展[期刊论文]-国际输血及血液学杂志2008,31(5) 9.黄桂春.陈龙邦.Huang Guichun.Chen Longbang重组人内皮抑素对荷人肺腺癌裸鼠肿瘤微环境的调节作用[期刊论文]-癌症进展2009,7(5) 10.莫姝.于洁基因修饰的骨髓基质细胞的研究现状[期刊论文]-国外医学（输血及血液学分册）2005,28(4) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/a56441512.html,/Conference_6438123.aspx
酶工程的研究进展及前景展望 摘要：概述了21 世纪国际上酶工程研究的新进展和新趋势。本文意在阐述近年来酶工程在分子水平的研究进展,并对其未来前景进行了展望。简单介绍了酶工程研究的进展, 对酶工程的发展前景进行了探讨。介绍了酶工程的应用现状，并对酶工程的作用和发展做出了展望。 关键词: 酶工程; 抗体酶；酶的固定化；开发研究; 进展； Abstract:An overview of the enzyme engineering in the 21st century international research progress and new trends. This paper aims to elaborate in recent years, progress in enzyme engineering research at the molecular level, and its future prospects. Briefly introduced the progress of the study of enzyme engineering, discussed the prospects for the development of enzyme engineering. Introduced the application status of the enzyme works , and the role and development of enzyme engineering to make the outlook. Keywords:Enzyme Engineering; Antibody enzyme; Immobilization; Research and development;Progress 1 前言 跨入21 世纪,人们在20 世纪认识生命本质高度一致性的基础上,迎来了后基因组时代,将有可能从整个基因组及其全套蛋白质产物的结构- 功能机理的角度,进一步阐明生命现象的核心和本质, 并系统整合生物学的全部知识,建立起真
一．肝素酶的作用及来源 肝素酶（heparinase）是指一类能够特异性地裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，可以清除血液中的肝素，并常用于测定肝素的结构以及抗肿瘤等方面的研究。乙酰肝素酶在肿瘤转移、血管生成、组织发生等过程中起重要作用，其羧基端大亚基蛋白是该酶的重要组成部分，但由于此蛋白在体内含量少，易降解，很难直接从组织内得到一定数量的蛋白。肝素酶最初从肝素黄杆菌中发现并分离，后来发现其他一些微生物或动物组织中也存在[4]。肝素酶除了通过降解硫酸类肝素蛋白聚糖（HSPG），破坏ECM和BM促进肿瘤侵袭、转移外，还可通过促进HS结合性生长因子或细胞因子释放，间接促进肿瘤转移。 二. 肝素酶的特性 2.1 酶的最适催化条件为：温度45℃，pH 6.4~7.0，离子强度150 mmol/L。酶在35℃以上极易失活，在pH 7~11之间基本稳定。该酶的最大紫外吸收位于280 nm。 2．2分子生物学特性 1979年Klein等首次报道了人胎盘肝素酶，之后在许多正常和恶性肿瘤细胞中也发现了该酶的存在。Vlodavsky等首先纯化了肝素酶，1999年Vlodavsky以及Hulett等三个研究小组几乎同时分离到了肝素酶基因。现已明确肝素酶基因（～50kb）位于人染色体4q21.3，通过选择性剪接形成5kb和1.7kb的两种mRNA。肝素酶cDNA编码543氨基酸的61.2kD的多肽，经加工后变成具有肝素酶活性的分子质为50kD的多肽。 肝素酶前体结合到细胞表面的HS上，进而转化成为具有高度催化活性的50kD的形式，加工后通过入胞作用进入细胞。Pikas认为肝素酶结合的底物至少含有2－O－硫酸基。HS链接并聚集到细胞外基质蛋白上，在细胞－细胞间及细胞－基质间发挥重要作用，此外，由于HS链具有结合多种蛋白的特殊能力，使许多具有生物活性分子（如生长因子、趋化因子、脂蛋白以及酶等）结合到细胞及细胞外基质上，因此在形态发生、组织修复、神经突生长、炎症、自身免疫及肿瘤转移和血管生成等生理和病理过程中发挥调控作用。 三. 肝素酶的提取、纯化工艺 1.2.1分离乙酰肝素酶蛋白编码基因和测序鉴定以人胎盘cDNA文库为模板，进行PCR. 上游引物5′ATGCTGCTGCGCTCG AAGCCTGCGCT3′，下游引物5′TCAGATGCAAGCAGCAA CTTTGGCAT3′.PCR条件为：95℃ 5 min，变性进入循环；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环后72℃继续延伸5 min. 8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，直接克隆入pGEMT载体，测定基因序列. 1.2.2构建载体PGEX2TK50 ku HPA根据测定的乙酰肝素酶核苷酸序列，设计了如下一对引物扩增乙酰肝素酶50 ku大亚基基因片段：5′CGGGATCCAAAAAGTTCAAGAACAGCAC 3′，其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，5′CGGAATTCTCAGATGCAAGCAG CAACTTTGG 3′,其中GAATTC为EcoRⅠ酶切位点. PCR条件为：95℃ 5 min 变性进入循环；94℃ 30 s，60℃ 30 s, 72℃ 30 s，30个循环后72℃继续延伸5 min. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物. 将扩增出来的乙酰肝素酶基因大亚基的基因产物纯化，酶切，与质粒载体连接，克隆入PGEX2TK原核表达载体，构建载体PGEX2TK50 ku HPA，转化DH5α. 测序鉴定表达载体的序列和阅读框架.
cati on(DREA M )trial 1J 21D i atet es Care ,2008;31(5):1007-14119 K j el d sen SE ,J a m erson KA,Bak ri s GL,et al 1Avoiding card i ovascular e -ven ts t h rough comb i nati on therapy i n patients li vi ng w it h syst oli c hyper -tens i on i nvesti gators 1Pred ictors of blood p ressure res pon se to i nten sified and fi xed co mb i nati on treat m en t of treat m en t of hypertens i on:t he AC -COM PL I SH study 1J 21B lood Press ,2008;17(1):7-171 20 W ang J G,Staessen J A,L i Y ,et a l 1C aroti d i n ti m a -m ed i a th i ckn ess and an ti hypertens i ve treat m ent :a m eta -anal ys i s of rando m i zed contro ll ed tr-i als 1J 21Stroke ,2006;37(7):1933-401 21 M arti na B ,W einb acher M,Dre w e J ,et a l 1E ffects of l osartan titrated to l os art an /hydroch l oroth i az i de and am l od i p i ne on blood press u re and pe -ri pheral cap illary m icroci rcu l ation i n pati en ts w it h m il d -to -m oderate hy -pertens i on 1J 21J H um H ypertens ,1998;17(7):473-81 22 C al houn DA,J on es D ,Tex t or S ,et a l 1Resistant hyperten si on :d i agnos i s , eval uation,and treat m en t :a sci en tific state m en t fro m t h eAm eri can H eart Associati on Profes s i on al Educati on Co mm ittee of the C ouncil f or H igh B lood Press ure Res earch 1J 21H yp ertension ,2008;51(6):1403-19123 The ALL HAT offi cers and coord i n ators f or t h eALL HAT coll ab orati ve re -searc h group 1M aj or outco m es i n h i gh ri sk hyp ertens i ve patients rando m-i zed t o ACE i nh i b it or a ca l ci um channel B l ocker vs D i u retic-The ant-i hypert en sive and lipid -lo w ering treat m en t t o preven t heart attack trial (ALL HAT )1J 21J A M A,2002;288(23):2981-971 24 B erl T ,Hun sicker LG ,Le w i s JB ,et al 1Irb esartan D iabetic Neph ropathy T ri al 1Collaborative S t udy G roup 1C ard i ovascu l ar ou tco m es i n the Irbe -sartan DiabeticN ephropathy Trial of pati en ts w i th t ype 2diabetes and o -vert nephropat hy 1J 21Ann I n tern M ed ,2003;138(7):542-91 12010-07-21收稿 2010-09-06修回2 (编辑 曲 莉) 肝素及其衍生物的抗肿瘤作用研究进展 陈小军 孙丽华 (南京医科大学附属南京市第一医院呼吸科,江苏 南京 210006) 1关键词2 肝素;低分子量肝素;血管内皮细胞;细胞外基质;血管平滑肌 1中图分类号2 R73 1文献标识码2 A 1文章编号2 1005-9202(2010)22-3425-03 第一作者:陈小军(1973-),男,博士,主治医师,主要从事呼吸系统肿瘤 研究。 未分级肝素(UFH )和低分子量肝素(LMWH )已被广泛用于各种情况下的抗凝治疗。U FH 和L MWH 通过激活生理性的凝血抑制剂抗凝血酶,抵消许多参与凝血的丝氨酸蛋白酶,尤其是活化的凝血因子X 和凝血酶发挥其抗凝血作用。U FH 和L WMH 还有其他广泛的生物学活性,如抗肿瘤、抗血管生成及抗炎作用。 1 U FH 和L MWH 在肿瘤治疗领域的积极作用 111 肝素及其衍生物治疗肿瘤的积极效果 临床观察发现,抗凝治疗能改善小细胞肺癌(SCLC )的预后。第一个双盲的随机对照评价LMW H 在进展期恶性疾病治疗上的作用的试验是1995年开展的针对385例进展期的实体瘤患者的FAM OU S 研究,试验组患者给予L MWH 达肝素钠(D a ltepar i n),对照组给予生理盐水注射,观察时间为1年。最终结果表明,皮下注射D a ltepa ri n 1年后患者生存率增加5%;L MWH 治疗的积极效应随时间推移逐渐显现,在17~48个月期间最明显;患者中位生存率由对照组2413个月增加到试验组的4315个月112;预计的2年生存率试验组为27%,对照组为18%;3年生存率试验组为21%,对照组为12%。K l erk 等 122 进行的M ALT 研究是在具 有恶性肿瘤但没有静脉血栓栓塞的302例患者身上进行的另外一项试验。试验组和对照组分别给予6w 的LMWH N ad -rapari n 和安慰剂。M ALT 的基本结果与FAM OU S 研究类似,并且发现LMWH 在原先有较好预后的患者上有更为突出 的作用。 112 UFH 和LMWH 的化疗增敏作用 A lti nbas 等将84例SCLC 患者随机分为2组,对照组给予CEV (卡铂、依托泊甙、长春新碱)方案化疗,试验组在进行CE V 方案化疗的同时,给予L MWH 。试验组和对照组相比,总体的肿瘤反应率分别为6912%和4215%;CEV 方案化疗和LMWH 的结合在不同的疾病阶段对病情的改善是相同的132。Icli 等的研究提示L MWH 能提高CG (顺铂、吉西他滨)方案对进展期胰腺的化疗效果142。D i N iso 等同样在进展期的恶性肿瘤患者观察到了L MWH 的增强化疗效果的作用152。进一步的研究发现,对肿瘤患者在给予维生素K 后,虽能取得与U FH 或其衍生物同样的抗凝效果,但对生存率无影响。因此,肝素及其衍生物在肿瘤治疗上表现出的良好作用不只与其抗凝作用有关。 2 U FH 和L MWH 抑制肿瘤生长及进展的机制211 UFH 和L MWH 与血管形成 21111 U FH 和LMWH 对血管内皮细胞的影响 1UFH 和L MWH 抑制微血管内皮细胞(MV ECs)的激活,肿瘤新生血管的形成是由MV ECs 驱动的。MV ECs 的激活使得基底膜降解,内皮细胞进入间质基质,最后增殖并形成毛细血管样管状结构。oU F H 影响M VEC s 和其所侵及的基质的相互作用,肿瘤能释放多种生长因子,如血管内皮生长因子(V EGF )、碱性成纤维生长因子(bFG F )、分散因子等。这些血管生长因子可以与内皮细胞表面的具有高亲合性受体相结合,并与其他的细胞因子相协调,刺激血管的形成。 U F H 和硫酸乙酰肝素调节生长因子与其受体的结合,影响 # 3425#陈小军等 肝素及其衍生物的抗肿瘤作用研究进展 第22期
HPSE(Heparanase) is also named as HEP, HPA, HPA1, HPR1, HPSE1, HSE1 and belongs to the glycosyl hydrolase 79 family. It is a endoglycosidase that cleaves heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) into heparan sulfate side chains and core proteoglycans. HPSE is essential in the disassembly of the extracellular matrix (ECM) by invading cells. It has 3 isoforms produced by alternative splicing with the molecular weight of 61 kDa, 55 kDa and 53 kDa. The full length protein has six glycosylation sites. The cleavage of the 65 kDa form leads to the generation of a linker peptide, and 8 kDa and 50 kDa products. The active form, the 8/50 kDa heterodimer, is resistant to degradation and glycosylation of the 50 kDa subunit appears to be essential for its solubility. 1.HPA酶分子量大小前体65kd 活性为50kd 2.qRT-PCR 3.引物证明吗 4.Hpse 与hpa 区别 5.盒子
?论文与综述? 纸浆酶改性的研究进展 李武光,李新平,杜 敏 (陕西科技大学造纸工程学院,陕西西安710021) [摘 要] 概述生物酶对纸浆改性研究进展。介绍了纤维素酶、半纤维素酶、漆酶在降低打浆能耗,改善纸张物理性能,助漂等方面的机理及其研究进展。 [关键词] 酶;纸浆;改性;纤维 近十几年来,人们对生物技术在制浆造纸工业中的应用进行了大量的研究,其研究内容几乎涉及到制浆造纸工业的各个方面。在这些研究中,有的处于实验室研究阶段,有的进行了中试,有的则已在生产中应用。 利用酶与纸浆纤维作用可以降低打浆能耗,改善成纸的某些性能,改善浆料的脱墨,助漂等。本文就纸浆的纤维素酶、半纤维素酶、漆酶的酶改性的研究进行了综述。 1 纤维素酶 纤维素酶由三类不同催化反应功能的酶组成,根据其催化功能的不同可分为:内切葡萄糖苷酶(endo21,42β2D2glucanase,EC3.2.1.4,来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen),该类酶能随机地在纤维素分子内部降解β21,4糖苷键;外切葡萄糖苷酶(exo21,42β2D2glucanase,EC3.2.1.91,来自真菌的简称CB H,来自细菌的简称Cex),它能从纤维素分子的还原或非还原端切割糖苷键,生成纤维二糖;纤维二糖酶(32D2gluco sidase,EC3. 2.1.21,简称B G),它把纤维二糖降解成单个的葡萄糖分子。 纤维素酶的作用机理:普遍接受的纤维素酶的降解机制是协同作用模型,见图1[1]。 在协同降解过程中,首先由Cx酶在纤维素聚合物的内部起作用,在纤维素的非结晶部位进行切 收稿日期:2009-07-02 作者简介:李武光(1984-),男,山东德州人,在读硕士研究生,陕西科技大学造纸工程学院,主要研究方向:纤维资源的制浆造纸特性与生物技术的应用 。 图1 协同作用模型 割,产生新的末端,然后再由C1酶以纤维二糖为单位,从末端进行水解,最后由B G酶将纤维二糖水解为葡萄糖。Wood在研究木霉(Trichoderma reesei)、青霉(Penicillium f uniculo sumde)的纤维素酶水解纤维素时,发现培养液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维素时具有协同作用。Fater2 stam也发现两种外切酶(CB HⅠ和CB HⅡ)具有协同作用。Kanda等还发现了对可溶性纤维素进攻方式不同的两种内切葡萄糖酶在微晶纤维素的水解过程中也具有协同作用。通过机理研究发现,纤维素的酶解是一个复杂的多相反应,其作用过程是:纤维素酶首先吸附到纤维表面,在纤维表面发生酶解反应,随着酶解反应进行,将纤维层层剥离[2]。酶解反应受纤维素的结构、纤维素酶的吸附、产物的抑制效应和纤维素酶去活化等因素影响[3,4]。 1.1 降低打浆能耗,促进打浆 酶促打浆是利用高活性的半纤维素酶和较低活性的纤维素酶对打浆前的纸浆进行预处理,使纤维表面得到某种程度的活化和松弛,促进纤维的吸水润胀和细纤维化程度,从而使打浆性能得到改善,起到降低打浆能耗的作用。 Setliff[5]利用Ceriporiop sis subvermispora和 — 3 3 —
硫酸乙酰肝素的序列与生物活性关系探究 蛋白聚糖是一类普遍存在于哺乳动物细胞表面和细胞外基质的大分子。蛋白聚糖一般是由一个或多个糖胺聚糖链共价连接在核心蛋白上组成的。 糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)是一类线性的长链碳水化合物,由于 硫酸基团和羧基基团的存在因此带有大量的负电荷。天然存在的糖胺聚糖主要分为四类包括硫酸乙酰肝素(Heparansulfate,HS)/肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。 其中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖构成主要一类具有重要生物学活性的蛋白聚糖组。肝素是一种细胞内的糖胺聚糖,主要存在于肥大细胞中。 肝素与HS具有相似的结构组成都是由糖醛酸(葡萄糖醛酸和艾杜糖醛 酸,Glucronic acid(GlcA)和 Iduronicacid(IdoA))和葡萄糖胺(Glucosamine,GlcN)通过 1-4 糖苷键形成的二糖单元(-HexAα/β1,4-GlcNα1,4-)组成,在其合成过程中IdoA的2-位或GlcA的2-位以及GlcN的N-位、6- 位或3-位会发生不同程度的硫酸化修饰,肝素的硫酸化程度要高于HS。肝素/HS 与蛋白配体的结合主要是通过糖链的高负电荷与蛋白的正电荷之间的静电相互 作用进行的。 通常认为肝素/HS与蛋白配体的相互作用主要依赖于糖链中羧基和硫酸取 代基团的数目以及硫酸取代基团在糖链中的分布。自二十世纪三十年代以来,肝素已被成功用作注射用抗凝血药物用于预防和治疗血栓性疾病。 肝素与抗凝血酶(Antithrombin,ATⅢ)的相互作用是目前研究最明确的肝素-蛋白配体结合实例。肝素与ATⅢ的结合被称为“锁-钥”结合模式,主要依赖于肝素糖链中含有特殊3-O-硫酸化GlcN的戊糖序列
乙酰肝素酶研究进展 乙酰肝素酶( heparanase, Hpa) 是近年发现的肿瘤重要功能酶, 是体内唯一能够降解糖氨聚糖中的硫酸乙酰肝素( heparan sulfat , HS) 链的内切糖苷酶,特异识别HS 侧链上的特异性位点, 可以在特 定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在各种蛋白聚糖中最 具生物活性,它参与多级联细胞粘附反应过程,并与粘附分子、细胞因子、细胞间信号分子等 相互作用,在影响细胞增殖、分化、迁移及形态等方面具有重要作用,在各种炎症损伤、缺血再灌注损伤、血栓形成及肿瘤转移等过程中具有重要功能。( heparan sulfate protoglycan,HSPG) , 将HS 裂解为10~ 20 个糖单位大小的短糖链, 并释放结合在HS 上的生长因子。乙酰肝素酶可促进细胞的浸润和转移, 还可以促进肿瘤细胞分裂、趋化、微血管形成。是目前在哺乳动物中发现的唯一一个可以剪切HSPGs 上HS 侧链的水解酶, 是抗肿瘤 的理想靶点。 细胞发生侵袭转移首先要穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障。该屏障主要有两种成分构成:一是结构蛋白, 包括胶原、层黏素、纤维结合素和玻璃体结合素等, 二是糖氨聚糖, 主要成分是HSPG,是 广泛存在于脊椎动物组织细胞外基质( extracellular matrix, ECM) 和细胞表面的复杂的生物大分子,是构成基底膜的主要成分。HSPG 主要由一个核心蛋白和数个与之共价连接的线性HS 侧链组成[ 1] ,HS 是由己糖醛酸和葡胺聚糖组成的重复单位构成。HSPG 能与细胞表面 及ECM 中的活性分子结合, 粘附于细胞表面, 是细胞外基质聚集和 稳定的基础, 拥有限制细胞迁移、粘附和选择性分子筛的重要作用, 还可以与多种生物活性分子结合并相互作用。
转化酶研究进展 摘要转化酶是生物体内糖代谢的关键酶,综述了转化酶多态性及其活性表达调控、转化酶基因等方面的研究;用分子生物学手段研究了转化酶基因对植物糖分积累的直接作用;研究了逆境下转化酶多态性表达及生理调节、调控。 关键词转化酶;多态性;糖代谢;基因;活性 ResearchAdvanceonPlantInvertase GAO Yun (Pingliang Medical College,Pingliang Gansu 744000) AbstractInvertase plays an important role during the sugar metabolism in higher plant. The varieties,distribution,invertase expression,gene expression of the invertase in higher plant were introduced in this paper. The research on the direct function about invertase gene to plant sugar accumulation by molecule biology means and the research on invertase expression,physiological regulation under adversity stress were summarized. Key wordsinvertase;polymorphism;sugar metabolism;gene;activity 转化酶(invertase),又称蔗糖酶或β-D-呋喃果糖苷酶,是生物体内糖代谢的关键酶,在蔗糖代谢中催化如下反应:蔗糖+H2O→果糖+葡萄糖。由于糖代谢是生物体内物质代谢的中心,蔗糖是高等植物光合作用的主要产物,是碳运输、“库代谢”、糖积累、果实品质形成中的重要因子,还是细胞代谢的调节因子,可能通过影响基因表达发挥作用。因此,与蔗糖代谢和积累密切相关的转化酶是近年来生理生化、生理生态及分子生物学研究的热点之一。 1转化酶的多态性及在蔗糖代谢中的作用 转化酶是高度多态的,包括酸性转化酶(Acid Invertase,AI)、中性转化酶(Neutral Invertase,NI)和碱性转化酶。许多报道将中性转化酶和碱性转化酶看作同一种转化酶。酸性转化酶主要存在于液泡或束缚于细胞壁上,其最适pH值在3.0~5.0;中性和碱性酶位于细胞质中,最适pH值在7.0左右。报道的转化酶的分子量大小为50~80 kD,为单体或二聚体。生殖器官中均有液泡转化酶表达。栽培番茄、野生番茄及转基因番茄研究表明,在果实成熟后期,液泡转化酶的表达与否决定着果实可溶性糖的组分[1]。原位杂交研究表明,胞壁转化酶可能存在于维管束
一、肝素的药理作用 1．抗凝、抗栓和促纤溶作用：普通肝素能够催化抗凝血酶III（AT-III活凝血酶（IIa）以及凝血因子Xa、IXa、XIa、XIIa,从而发挥抗凝和抗栓作用。然而，不同分子量肝素组分催化AT-III灭活IIa以及Xa的强度是不同的。高分子量肝素主要催Iia的灭活，，LMWH 主要催化Xa的灭活。如果定义普通肝素抗IIa/Xa比率为1：1，则LMWH的抗Iia/Xa比率为1：2-1：4。另外，肝素还有不领带于AT-II的抗凝和抗栓作用，如：中和内皮细胞的电荷，催化肝素辅助因子II灭活凝血酶，抑制脂多糖、干扰素-r诱导的单核细胞组织因子、VIIa、Xa以及白细胞介导的促凝活性。肝素还有促进纤溶的作用，有人认为肝素的促纤溶作用与肝素血浆形成的纤维蛋白凝块相对比较松散，因而对组织型纤溶酶原激活物（t-PA）介导的纤溶更加敏感有关；也有人发现肝素可以增加尿激酶介导的纤溶活性。肝素的抗凝、抗栓和促纤溶药理作用对于治疗肾小球疾病可能具有重要的意义。肝素不但可以通过其抗栓作用预防肾小球内微血栓栓塞所致的缺血性损伤，而且可能通过防止凝血酶和纤维蛋白产生、抑制凝血酶的活性阻断凝血酶和纤维蛋白直接介导的细胞增殖和活化。肝素促进纤溶的活性不仅对治疗肾小球内微血栓有益，而且可能通过激活细胞外基质降解酶活性减轻细胞外基质的过度积聚。 2．抗炎作用：肝素在体内能防止多形核白细胞（PMNS）和淋巴细胞移出血管至炎症处，从而抑制迟发型高敏反应，所以肝素可用于控制移排斥反应和自向免疫反应性疾病如变态反应性及脑脊髓膜炎。过去认为肝素的这种作用可以用肝素抑PMNS和血小板分泌的乙酰肝素酶以及T淋巴细胞分泌的葡萄糖苷转移酶活性解释。然而最近的实验发现，肝素抑制白细胞贴壁是因为干扰了白细胞通过L-选择素与血管壁内皮细胞表面的粘蛋白和P-选择素连接。肝素的抗补体活性也可能与其抗炎症效应有关。因为补体能上调内皮细胞表达粘附分子。同时，肝素能降低炎细胞的活性，比如能与单核细胞结合，诱导细胞表型转化、降低单核细胞介导的的细胞促凝活性；能抑PMNS产生超氧阴离子，抑制中性粒细胞酶如组织蛋白酶（cathepsin）G、N-乙酰葡萄糖苷酶和弹性蛋白酶；LMWH能阻抑肥大细胞产生肿瘤坏死因子（TNFA）、白细胞介素-4（IL-4），肝素被肝素酶I降解疾病硫酶二糖也可以抑制巨噬细胞产生TNFa。肝素还抑制系膜细胞分泌白细胞介素6（IL-6），促进内皮细胞释放超氧化物歧化酶，抑制内皮细胞细胞表达单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）。另外，普通肝素LMWH还可能直接影响免疫复全物肾炎的发生机制。普通肝素、反应性核小体原-抗体复合物相互作用，阻止这些免疫复合物与肾小球基底膜结合，并延缓和减轻Lpr/Lpr狼疮小鼠肾脏病变的进展，防止发生蛋白尿。肝素还能部分清除慢性血清病性肾小球肾炎模型动物肾小球内沉积的抗原。 3．调节细胞增殖作用：肝素还有调节细胞增殖的作用。小剂量肝素（中位有效剂量2-5ug/ml）抑制系胞膜细胞的血管平滑肌细胞增殖，促进内皮细胞和成纤维细胞增殖，大剂量肝素（中位有效剂量200-500ug/ml）也能抑制内皮细胞的增殖。肝素对细胞增殖的不同影响可能与下列因素有关：（1）促进转化生长因子（TGFβ）从无活性的复合物中释放出来，后者促进成纤维细胞增殖并抑制其他类型细胞增殖；（2）促进碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的内皮细胞增殖，抑制bFGF介导的动脉平滑肌细胞增殖；（3）阻抑血小板源性生长因子（PDGF）和内皮素（ET-1）的释放。肝素对不同细胞的不同调节作用对于促进创伤修复、防止过度增殖和硬化可能具有重要意义。肝素对细胞增殖的影响与下列细胞内信息传导途径有关；抑制细胞内钙离子动员、阻断钠/氢离子交换、阻断磷脂酰肌醇代谢、抑制蛋白激酶C和丝裂原活化蛋白激酶、阻断细胞周期、抑c-fos、c-myc、sgk基因表达。 4．扩张血管与降压作用：肝素具有扩张血管和降低血压的作用，其机制为，
固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：
低分子肝素制备方法研究进展 低分子肝素由于吸收性好、安全性及生物利用率高等优点，而逐渐取代肝素应用于临床。文章介绍了低分子肝素的基本概念，简述了其发展过程，重点综述了制备低分子肝素的化学降解法和酶解法，探讨了其发展趋势，为相关研究者提供参考。 标签：低分子肝素；LMWH；降解 低分子肝素（LMWH）是在普通肝素的基础上发展的新一代肝素类抗凝血药物，是使用合适方法将肝素分级或降解得到的具有较低分子量的肝素组分或片段。20世纪70年代中，在肝素研究史上取得了两大突破：一是发现肝素中仅有30%～50%的组分可以结合ATⅢ发挥抗凝血活性，这改变了“肝素的每一个分子都有抗凝血活性”的老观点；二是发现以往认为并无无活性的低分子肝素对Ⅱa 因子有强的抑制作用[1]。20世纪70年代末，低分子肝素进入临床使用。 低分子肝素的制备方法主要有物理制备法、化学降解法、酶解法和合成法。不同的制备方法可获得不同分子量和生物活性的LMWH，彼此不能代替使用。以下主要对化学降解法和酶解法进行综述。 1 化学降解法 化学法是指利用化学反应获取低分子量肝素的方法，使肝素糖环或糖苷键断裂，从而，大分子的肝素降解成低分子量的肝素及相应寡糖，主要的方法有亚硝酸降解、β-消除降解法、过氧化氧降解法、光化学降解法。 1.1 亚硝酸降解法 这是最经常使用的一种方法。酸性条件下，肝素中游离的氨基与亚硝酸发生重氮化反应，断裂在氨基葡萄糖的残基部位，最终生成低分子量肝素和氮气。此反应条件较温和，并且这种方法在低分子肝素的末端引入了新的缩环的甘露糖残基的还原基团。然而，亚硝酸降解法对N硫酸化的氨基葡萄糖殘基的保护作用不完全，又偏偏这些残基是抗凝血酶III结合所必需的片段。反应过程中，通过控制亚硝酸的量，酸碱度，反应温度和时间等，可控制生成的产物的分子量[2]。 1.2 β-消除降解法 β-消除降解法包括肝素季铵化、酯化和降解三个步骤[3]。在碱性条件下，肝素会发生β-消除反应，断裂在艾杜糖醛酸残基部位，从而生成低分子量肝素，但会引起多糖链结构的变化和多糖基上O-硫酸基团脱落，会丧失原有部分功能。酯化肝素中的糖醛酸可以增强α-H的酸度，非水相或水相介质条件下，肝素酯更容易与亲和基团发生β-消除反应。肝素的卤代苄基化合物和季铵盐在DMF或二氯甲烷中能够发生酯化反应，生成的酯在碱性条件下可以水解成LMWH。控制
卫生出版社,2002:256~261 6 蒋苏华 肺炎支原体感染所致中枢神经系统损害26例分析[J] 中国当代儿科杂志,2004,1:36~37 7 项 蓉,范永琛 小儿肺炎支原体感染的神经系统损害[J] 小儿 急救医学,2002,9(3):132~133 8 洪 虹,邝建明,江慧敏 肺炎支原体脑炎16例分析[J] 小儿急 救医学,2005,12(3):209 9 Kom atsu H,Kuroki S,S himizu Y,et al.M ycoplasma pneumoniae meningoencephaliti s and cerebelliti s w ith antiganglioside antibodi es[J]. Pediatr Neurol,1998,18(2):160~164 10 Kikuchi M,Tagawa Y,Iw amoto H,et al.Bickerstaff s brainstem en cephalitis associated w ith IgG anti GQIb antibody s ubsequent to my coplasma pneumoni ae i nfection:favorable response to immunoadsorp tion therapy[J].J Child Neurol,1997,12(6):403~405 11 俞志凌,袁 壮,刘春峰 肺炎支原体感染所致中枢神经系统损 害22例临床分析[J] 中国实用儿科杂志,2000,15(8):45912 王洪通,董宗祈 肺炎支原体肺炎的肺外表现[J] 实用儿科临床 杂志,2003,18(12):996~997 13 贺国平,金伯平,王晓明 1438例肺炎支原体肺炎患儿临床及肺 外并发症分析[J] 临床儿科杂志,2005,23(10):723~726 14 袁 壮 小儿肺炎支原体肺炎诊断治疗中的几个问题[J] 中国 实用儿科杂志,2002,17(8):449~557 15 孙 旭,李 革,刁敬军 小儿肺炎支原体脑炎(附3例报告)[J] 小儿急救医学,2002,9(3):160 16 王 华,赵继顺,于一兵,等 小儿肺炎支原体脑炎的临床表现与 头部磁共振成像的对比分析[J] 中华儿科杂志,2004,37(2):124 ~126 17 张晓波,王立波,张灵恩,等 儿童肺炎支原体感染肺外脏器受累 56例临床分析[J] 临床儿科杂志,2003,21(6):344~346 18 Cotter FE,Bai nbridge D,Newland AC.Neurological deficit associated with mycoplasma pneumoniae reversed by plasma exchange[J].Br M ed J,1998,286(1):21 AmpC酶的研究进展 广西玉林市第一人民医院 (玉林537000) 张勇昌 A mpC酶是由肠杆菌科细菌或/和铜绿假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类 内酰胺酶,属 内酰胺酶A mbler分子结构分类法中的C类和Bush Jacoby M edeiros功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素且不被克拉维酸所抑制的 内酰胺酶,故AmpC酶又称作头孢菌素酶[1]。 1 AmpC酶的分类 A mpC酶按其产生的方式分为三类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶[2]。(1)诱导高产酶:A mpC酶的合成往往与 内酰胺类抗菌素的存在有关。绝大部分肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌在正常条件下(即无 内酰胺类抗菌素存在的条件下)只产生少量的AmpC酶,而当有诱导作用的 内酰胺类抗菌素存在条件下,A mpC酶的产量明显增加,增加的范围在100~1000倍之间。(2)持续高产酶:有一部分产A mpC酶的菌株不论有无 内酰胺类抗菌素存在条件下均可持续高水平产生AmpC酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的A mpD酶基因发生突变,产生有缺陷的A mpD蛋白,不能与另一种调控蛋白A mpR蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。质粒介导的A mpC酶往往都属于此类AmpC酶。产生这种AmpC 酶的细菌对临床危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。 (3)持续低产酶:有极少部分产AmpC酶的菌株,不论有无 内酰胺类抗菌素存在条件下均持续低水平的产生A mpC酶,其原因可能是另一种调节基因ampR基因发生突变,产生有缺陷的A mpR蛋白,不能在无 内酰胺类抗菌素存在条件下起到抑制子作用,也不能在有 内酰胺类抗菌素存在条件下起到激活子的作用,故A mpC酶得以持续低水平表达。2 AmpC酶的诱导性 根据能否被 内酰胺类抗菌素诱导,AmpC酶以诱导酶和非诱导酶的形式存在于不同细菌中,诱导AmpC酶存在于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、不动杆菌属、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌中,在缺乏 内酰胺类抗菌素时,只产生少量的 内酰胺酶,当有诱导作用的 内酰胺类抗菌素存在时, 内酰胺酶的产量明显增加。非诱导性AmpC酶存在于大肠埃希菌、志贺菌属、克雷伯菌属。通常只产生低水平 内酰胺酶,出现此现象的原因可能是与细菌缺乏调节基因ampR有关,因此认为,AmpC酶的诱导性与菌种有关,此外还受细菌的生长条件和诱导剂的影响。研究发现[3],不同的培养基 内酰胺酶的诱导量不同:用头孢西丁作为诱导剂在M H肉汤中可使 内酰胺酶的活性从未诱导时的28 3增加到诱导后的2 666。在营养肉汤中可使酶活性由未诱导时的54增加到诱导后的5723。而在营养肉汤中加盐(1%N aCl)后,酶活性从32 2仅增加至285。此外,还发现不同的诱导剂对A mpC酶的诱导能力不同,通常对携带诱导性A mpC酶的所有菌株,亚胺培南、头孢西丁和头孢孟多都是最强的诱导剂[4,5]。 3 AmpC酶的检测 近年来,随着头孢菌素的广泛应用于临床,产AmpC酶的革兰阴性杆菌越来越多,尤其是出现了(去阻遏)持续高产AmpC酶和质粒介导的AmpC酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,检测AmpC酶有非常重要的临床意义。目前检测AmpC酶有多种方法,但是有的方法还不够成熟。 3 1 头孢西丁敏感试验[6] 利用产A mpC酶的菌株对头孢 332A nthology of M edicine,A p r 2006,V ol 25,N o 2