硫酸乙酰肝素的序列与生物活性关系探究
蛋白聚糖是一类普遍存在于哺乳动物细胞表面和细胞外基质的大分子。蛋白聚糖一般是由一个或多个糖胺聚糖链共价连接在核心蛋白上组成的。
糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)是一类线性的长链碳水化合物,由于
硫酸基团和羧基基团的存在因此带有大量的负电荷。天然存在的糖胺聚糖主要分为四类包括硫酸乙酰肝素(Heparansulfate,HS)/肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。
其中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖构成主要一类具有重要生物学活性的蛋白聚糖组。肝素是一种细胞内的糖胺聚糖,主要存在于肥大细胞中。
肝素与HS具有相似的结构组成都是由糖醛酸(葡萄糖醛酸和艾杜糖醛
酸,Glucronic acid(GlcA)和 Iduronicacid(IdoA))和葡萄糖胺(Glucosamine,GlcN)通过 1-4 糖苷键形成的二糖单元(-HexAα/β1,4-GlcNα1,4-)组成,在其合成过程中IdoA的2-位或GlcA的2-位以及GlcN的N-位、6-
位或3-位会发生不同程度的硫酸化修饰,肝素的硫酸化程度要高于HS。肝素/HS 与蛋白配体的结合主要是通过糖链的高负电荷与蛋白的正电荷之间的静电相互
作用进行的。
通常认为肝素/HS与蛋白配体的相互作用主要依赖于糖链中羧基和硫酸取
代基团的数目以及硫酸取代基团在糖链中的分布。自二十世纪三十年代以来,肝素已被成功用作注射用抗凝血药物用于预防和治疗血栓性疾病。
肝素与抗凝血酶(Antithrombin,ATⅢ)的相互作用是目前研究最明确的肝素-蛋白配体结合实例。肝素与ATⅢ的结合被称为“锁-钥”结合模式,主要依赖于肝素糖链中含有特殊3-O-硫酸化GlcN的戊糖序列
(-GlcNS(orAc)6S-GlcA-GlcNS3S±6S-IdoA2S-GlcNS6S-)。
肝素中的特殊戊糖序列与ATⅢ结合,通过改变ATⅢ构象增加其对凝血因子(FactorXa,FXa)和凝血酶(Thrombin,FⅡa)的抑制活性,从而达到抗凝血作用。低分子肝素(Low molecularweightheparins,LMWHs)是由肝素通过不同的降解条件包括酶降解和化学降解制备得到的,具有和母体肝素相同的单糖组成、硫酸和乙酰基团取代形式以及寡糖序列的一类具有较低分子量的抗凝血药物。
与肝素相比,LMWHs不具有肝素作为抗凝血药物表现出的药代动力学限制,
例如LMWHs具有半衰期长、可预测的抗凝血反应和较低的不良反应效率如肝素诱导的血小板减少症(Heparin-induced thrombocytopenia,HIT)等特点。LMWHs作为碳水化合物类药物与传统的小分子药物和生物大分子药物相比具有独特的结构特征。
LMWHs是由具有不同链长、单糖组成、硫酸和乙酰取代形式和序列的寡糖混合物组成。直到2008年全球肝素污染事件发生,肝素和LMWHs结构表征的重要性才受到重视。
传统的分析方法包括凝胶渗透色谱分析得到的分子量(Molecularweight,MW)信息以及单糖组成分析和生物活性分析都不足以反映该多糖药物的精细结构并确保其安全性和有效性。2010年美国食品和药物管理局(Food and drug administration,FDA)批准了第一个LMWHs 仿制药依诺肝素钠,为了保证LMWHs 仿制药与原研药结构一致性和药物安全性,迫切需要开发LMWHs精细结构的分析方法用来比较原研药和仿制药。
LMWHs的异质性可以从以下五个方面进行全面表征:(1)理化性质;(2)高分
辨完整糖链分析;(3)寡糖片段分布;(4)二糖和基本组成单元分析和(5)寡糖序列
分析。传统的分析方法包括液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)、凝胶电泳、毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)和核磁共振波谱(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)分析不能提供每种寡糖的精细结构信息。
质谱技术,特别是与HPLC和CE在线联用的电喷雾质谱(Electrospray ionizsation mass spectrometry,ESI-MS)技术(LC/CE-ESI-MS)已经成为全面表征LMWHs的主要分析工具。类似于蛋白组学分析的两种策略包括“自上而下”和“自下而上”已经广泛用于LMWHs的结构表征。
“自上而下”和“自下而上”两种策略应用LC-MS分析LMWHs可以提供LMWHs 基本组成信息包括完整糖链分布、寡糖片段分布和基本组成单元,同时每种寡糖得到的结构信息包括糖醛酸(Uronicacid,HexA)和GlcN的数目、寡糖末端结构、硫酸和乙酰基取代数目。HS和肝素的生物活性很大程度上取决于其糖链中特殊的寡糖序列提供的能与多种蛋白配体相互作用的特殊结合位点。
这些特殊结构的序列分析对于了解GAG-蛋白相互作用机制是必不可少的。目前研究最明确的肝素-蛋白相互作用的例子是肝素中特殊的戊糖序列与ATⅢ
的特异性结合。
近些年来,对成纤维生长因子-2(Fibroblast growth factor-2,FGF-2)的研究表明 HS 中 IdoA2S 和 GlcNS是识别FGF-2所必须的,同时FGF-2的激活也需要HS中6-O-硫酸基团的存在。HS/肝素与其他生长因子的结合如FGF-1、FGF-4、肝细胞生长因子和血管细胞生长因子也被证明是依赖于HS/肝素独特的结构特征,进一步证明了 HS/肝素糖链中存在与蛋白相互作用的特殊结合位点。
此外,在LMWHs制备过程中,经过化学或酶降解后的肝素,糖链中主要的ATⅢ
结合的戊糖序列被保留,而更长的FIIa因子结合区域可能已经被破坏。肝素诱导的副作用,HIT,也证明与肝素糖链中的寡糖序列密切相关。
以上两个方面包括GAGs-蛋白配体相互作用机制研究和LMWHs抗凝血药物的安全性和有效性都需要对糖链中特殊的寡糖序列进行序列表征。然而,由于目前缺乏GAGs精确结构的分析方法使得对HS/肝素中与蛋白配体相互作用的确切的结构信息知之甚少。
本论文的目标之一就是以低分子肝素达肝素钠作为研究对象,开发分析方法表征达肝素钠中较短寡糖的序列结构,为进一步探究肝素/HS与目标蛋白相互作用的特殊寡糖序列的表征提供研究基础。天然来源分离得到的HS和肝素是高度异质性的混合物,主要由不同链长及不同硫酸取代形式的寡糖组成。
从HS和肝素的寡糖混合物中分离得到结构确定的寡糖组分具有很大的挑战性。获得结构确定的HS和肝素寡糖对于研究特定的硫酸化寡糖序列对其生物功能的影响以及开发下一代基于HS的抗凝药物是至关重要的。
HS寡糖已经应用纯化学方法进行合成,然而,由于需要使用复杂的基团保护和去保护作用步骤使化学合成具有一定的难度。在化学合成方面的发展已经成功的合成了一种具有抗凝血活性的戊糖磺达肝癸钠(Arixtra),然而由于碳水化合物化学合成存在的困难和挑战,通过化学方法合成平均由40个糖单元组成的肝素是不现实的,因为合成中需要准备大量的前体化合物。
因此,HS寡糖的化学合成仅由熟练的合成化学家在少数高度专业化的实验室中完成。在最近几年,化学酶合成方法利用HS生物合成酶包括糖基转移酶、差向异构酶和硫酸转移酶的高度区域选择性合成HS寡糖已经成为高效合成HS寡糖的主要方法。
化学酶合成方法模拟HS体内生物合成途径合成具有所需生物活性的多种HS 寡糖结构。然而,由于缺乏对HS合成过程中使用的各种硫酸修饰酶底物特异性的了解使得应用化学酶合成具有特定序列的HS寡糖具有一定的难度。
本论文的另一个重要目标是研究HS生物合成过程中3-O-硫酸转移酶的底物特异性(3-OSTs),包括3-OST-1和3-OST-3,并对其修饰合成的底物的生物学活性进行研究。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一种离线的SAX-ESI-MS/MS分析达肝素钠较短寡糖序列方法我们将离线的强阴离子交换色谱(Strong anion exchange chromatography,SAX-HPLC)与高分辨率高灵敏度的ESI-MS/MS结合分析复杂的达肝素钠较短寡糖混合物。
首先我们通过尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC)低分辨分离得到达肝素钠较短寡糖然后再应用SAX进行高分辨分离得到每个较短寡糖组分,最后应用ESI-MS/MS对每个寡糖进行序列测定。应用本实验室开发的快速MS/MS解谱软件对达肝素钠较短寡糖从四糖到八糖的18种代表性组分进行了序列解析。
在本研究中通过ESI-MS/MS分析达肝素钠较短寡糖时发现了一种新型的寡糖结构,即含有2,3-0-硫酸化糖醛酸的达肝素钠六糖。同时应用肝素酶完全降解和LC-MS/MS分析进一步验证了该新型结构的存在。
本研究方法为LMWHs的结构和肝素降解的反应机制提供了直接和深入的见解,并为进一步表征与蛋白配体相互作用的HS寡糖序列奠定基础。2.研究3-0-硫酸转移酶(3-OST-1和3-OST-3)的底物特异性并应用化学酶法合成新型的3-O-硫酸化修饰的HS寡糖作为HS寡糖中的一种罕见修饰,3-O-硫酸化的HS寡糖的可获得性是非常受限的。
在本研究中,我们应用结构确定的化学酶合成的HS寡糖作为底物研究
3-OST-1和3-OST-3的底物特异性。我们根据3-OST-1和3-OST-3的底物特异性差异,重新排列酶促反应修饰顺序合成6种新型的3-O-硫酸化的寡糖,包括3种六糖和3种八糖,并对合成的HS寡糖通过HPLC、MS和NMR进行结构验证。
该研究中我们还应用合成的3-O-硫酸化的HS寡糖进一步研究了 3-O-硫酸基团对IdoA2S构象的影响,为了解HS与蛋白配体相互作用的分子机制提供基础。本方法根据3-OST-1和3-OST-3的底物特异性的差异设计化学酶合成策略进一步扩大3-O-硫酸基团修饰的HS寡糖库,同时对IdoA2S构象变化(1C4和%o)可以调控HS对潜在结合蛋白的选择性进行了深入研究。
3.对3-OST-3修饰合成的HS寡糖进行生物活性研究通过体外和体内生物学实验对3-OST-3修饰合成的寡糖进行生物活性研究。我们应用Lewis大鼠作为研究对象,分别注射阳性对照磺达肝癸钠(FDA批准的具有抗凝血活性的戊糖)、合成的3-O-硫酸修饰的HS寡糖和阴性对照生理盐水,然后在特定的时间点抽取实验大鼠血液进行抗-FXa活性分析。
同时我们也对合成的3-O-硫酸修饰的HS寡糖进行体外抗-FXa活性测定。根据生物学活性研究我们发现了一种新型的具有抗凝血活性的3-OST-3修饰合成的八糖,该研究结论与之前报道的3-OST-1修饰的HS寡糖才具有抗凝血活性的结论是矛盾的。
同时我们评价用药Lewis大鼠体内寡糖的清除速率,研究结果表明在大鼠模型中,3-OST-3修饰的具有抗凝血活性的HS八糖在体内显示出比磺达肝癸钠更快的清除率,使得该八糖成为可能降低出血风险的潜在的短效抗凝血药物候选物。获得一系列重要的3-O-硫酸化寡糖为研究HS与蛋白配体相互作用机制提供了理
论基础,同时为开发新的基于HS的治疗剂提供了可能性。
72 食品与药品 Food and Drug 2013年第15卷第1期 肝素和硫酸乙酰肝素的功能 Rabenstein D L 内源肝素在肥大细胞内，是肥大细胞分泌颗粒的主要组成成分。内源肝素在医学上作为抗凝血剂使用，并在预防和治疗血栓栓塞疾病中被作为首选药物。硫酸乙酰肝素（HS ）在动物组织中广泛存在并且结构多样，同样也具有多种生物活性和功能，包括细胞黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程和血液凝固、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、血管发生、病毒入侵和肿瘤转移。HS 同样保护蛋白质不被降解，调控蛋白质通过基底膜转移，介导蛋白质内置。研究发现细胞表面的HS 蛋白聚糖（HSPG ）是动态的，它能快速向细胞表面转移并快速返回（t ?1-4 h ），并通过细胞变化改变HS 的结构以应答细胞外信号因子，例如，生长因子。肝素和HS 的作用机制涉及它们与蛋白质的非共价结合，以在蛋白质构象中发挥变化，促进蛋白质-蛋白质相互作用，使蛋白质在细胞表面分离并作为生长因子的复合受体发挥作用。因为肝素和HS 在调节生物活性方面的作用，在综述一些肝素和HS 的功能之前，本文将探讨蛋白质-肝素相互作用的一些重要特点。1 与蛋白的相互作用 HSPG 的HS 链及肝素与蛋白质的结合主要是静电的，涉及阳离子铵盐基、胍盐以及与肝素或HS 的阴离子部位相互作用的多肽或蛋白质的咪唑侧链功能基团。数百种与肝素结合的蛋白质已经被确认，且肝素结合性质经常被应用于它们的分离和纯化，即使用肝素亲和色谱。在很多情况下，涉及到阳离子肝素-结合域与高负电荷肝素之间的非选择性相互作用，这导致通过HS 的蛋白质结合是相对非特异性的。但是，研究者逐步认识到经设计的HS 的NS 和NA/NS 域中的特异序列可与特定蛋白质选择性相互作用，这种相互作用可用于调控蛋白质活性。结合的选择性可以通过一种“稀有”成分的使用来得到，例如，在肝素抗凝血酶结合戊糖序列中存在的GlcNS(3，6S)残基，它对于抗凝血活性是必需的。一种独特的结合表位也可以基于N -取代基模式，N -和O -取代基的特异性结合，或是NS （N -硫酸化域）、NA （N-乙酰化域）和NA/NS 域的长度和相对位置。其它已知的蛋白质结合序列是由常见的二糖组成。典型地，蛋白质结合涉及3～9个二糖单位，虽然包围在蛋白质低聚体表面的更长的序列也会被涉及。 肝素结合域已经在大量蛋白质中被确认。它们典型地含有相当多的碱性残基赖氨酸和精氨酸，且在某些情况下有组氨酸。除此之外，前文图所示六糖与FGF-2结合形成的复合体的X-线结构显示，某些其它氨基酸侧链的功能基团 ?知识介绍? 也可以与肝素相互作用，例如，谷氨酰胺的酰胺侧链。共有序列组成碱性残基簇，包括序列XBB-BXXBX, XBBXBX 和XBBBXXBBBXXBBX ，其中B 和X 分别为碱性氨基酸残基和其他氨基酸残基，上述序列被认为是蛋白质的肝素/HS 结合域。这些序列可以采用二级结构，在这种二级结构中碱性氨基酸沿着多肽链的一面对齐，X 氨基酸指向蛋白核心。 由于肝素和HS 的高负电荷密度，它们都是聚电解质，通过结合反离子中和部分负电荷。所以，结合反应是一个离子交换过程，结合多肽或蛋白质的阳离子部位即为反离子。反离子结合模型显示水溶液中的肝素钠的Na +部分被结合，为每一个负电荷是0.59；已经报道了0.58和0.63的实验值。聚电解质理论提示大部分结合自由能来自多糖Na +反离子熵的有利释放。离子交换机制的一个重要结果是随着NaCl 浓度增大结合程度降低。例如，组氨酸的双质子形式与肝素的相互作用结合常数从1.5×106（Na +浓度为0.001 mol/L ）降至7.7×102（Na +浓度为0.1 mol/L ）。通过相互作用Na +离子被取代的数目已经从结合常数对离子强度的相关性得到，该相关性通过23Na NMR 测得。2 肥大细胞中的肝素 肝素和组胺、肥大细胞蛋白酶及其它调控因子一起被储存在肥大细胞的分泌颗粒中。实验已阐明肥大细胞肝素的生理意义。通过敲除大鼠N -脱酰酶/N -磺基转移酶的基因，“正常”即硫酸化肝素的生物合成被阻止。这使得分泌颗粒中其它生物活性调控因子的数目改变，其中最显著的是一些小鼠肥大细胞蛋白酶的水平。可得出一个结论，肝素对于在肥大细胞内特殊颗粒蛋白酶的储存是必要的。 肝素与带有正电荷的肥大细胞蛋白酶之间相互作用的细节尚不清楚，一般认为这种相互作用导致只有正确折叠的蛋白酶才能被定向到分泌颗粒中。 组胺水平在异常肥大细胞中也同样下降，表明肝素对肥大细胞颗粒内组胺的储存发挥了作用。当肥大细胞颗粒的pH 值为5.2~6.0时，组胺以双质子形式（H 2A 2+）存在，这表明组胺在肥大细胞颗粒内通过与高负电荷肝素的静电相互作用储存。腹膜肥大细胞颗粒的体积和组胺含量随着年龄增大。2~7月龄大鼠腹膜肥大细胞中组胺的浓度估计为0.4 mol/L ，这足够用于直接在完整肥大细胞分泌颗粒和肥大细胞颗粒中通过1H-NMR 研究组胺。通过观察到的肥大细胞颗粒内的组胺的相对尖锐的1H 共振峰，研究者确认颗粒内的组胺是流动的。
类肝素酶与肿瘤微环境 作者：罗荣城， 杨洋， 崔瑶 作者单位：南方医科大学南方医院 本文读者也读过(10条) 1.陈丽.李军民肿瘤微环境——慢性淋巴细胞白血病治疗新方向[期刊论文]-国际输血及血液学杂志2008,31(3) 2.赵坡.钟梅.宋欣.吕亚利.王殿军.顾峥.陈乐真肝素酶基因表达与肺癌转移活性的初步研究[期刊论文]-中国肺癌杂志2001,4(2) 3.段学燕.龙金华.肖静.曾柱肿瘤微环境对树突细胞功能状态的影响[期刊论文]-贵阳医学院学报2004,29(5) 4.张伟MT1-MMP、MMP-2及HPSE与胰腺癌神经浸润、转移及预后关系的研究[学位论文]2007 5.范平生.汪瑛.冯克海.FAN Ping-sheng.WANG Ying.FENG Ke-hai肿瘤微环境对肿瘤免疫的影响[期刊论文]-安徽医药2005,9(9) 6.陈礼平.王敏肿瘤微环境树突细胞诱导免疫耐受产生的机制及相关治疗策略[期刊论文]-国际输血及血液学杂志2007,30(2) 7.谢启超.王玲俐.陈正堂.XIE Qi-chao.WANG Ling-li.CHEN Zheng-tang肿瘤微环境内免疫耐受机制研究进展[期刊论文]-现代肿瘤医学2008,16(5) 8.王吉刚.陈幸华血液系统肿瘤微环境与耐药关系的研究进展[期刊论文]-国际输血及血液学杂志2008,31(5) 9.黄桂春.陈龙邦.Huang Guichun.Chen Longbang重组人内皮抑素对荷人肺腺癌裸鼠肿瘤微环境的调节作用[期刊论文]-癌症进展2009,7(5) 10.莫姝.于洁基因修饰的骨髓基质细胞的研究现状[期刊论文]-国外医学（输血及血液学分册）2005,28(4) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/8016783578.html,/Conference_6438123.aspx
一．肝素酶的作用及来源 肝素酶（heparinase）是指一类能够特异性地裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，可以清除血液中的肝素，并常用于测定肝素的结构以及抗肿瘤等方面的研究。乙酰肝素酶在肿瘤转移、血管生成、组织发生等过程中起重要作用，其羧基端大亚基蛋白是该酶的重要组成部分，但由于此蛋白在体内含量少，易降解，很难直接从组织内得到一定数量的蛋白。肝素酶最初从肝素黄杆菌中发现并分离，后来发现其他一些微生物或动物组织中也存在[4]。肝素酶除了通过降解硫酸类肝素蛋白聚糖（HSPG），破坏ECM和BM促进肿瘤侵袭、转移外，还可通过促进HS结合性生长因子或细胞因子释放，间接促进肿瘤转移。 二. 肝素酶的特性 2.1 酶的最适催化条件为：温度45℃，pH 6.4~7.0，离子强度150 mmol/L。酶在35℃以上极易失活，在pH 7~11之间基本稳定。该酶的最大紫外吸收位于280 nm。 2．2分子生物学特性 1979年Klein等首次报道了人胎盘肝素酶，之后在许多正常和恶性肿瘤细胞中也发现了该酶的存在。Vlodavsky等首先纯化了肝素酶，1999年Vlodavsky以及Hulett等三个研究小组几乎同时分离到了肝素酶基因。现已明确肝素酶基因（～50kb）位于人染色体4q21.3，通过选择性剪接形成5kb和1.7kb的两种mRNA。肝素酶cDNA编码543氨基酸的61.2kD的多肽，经加工后变成具有肝素酶活性的分子质为50kD的多肽。 肝素酶前体结合到细胞表面的HS上，进而转化成为具有高度催化活性的50kD的形式，加工后通过入胞作用进入细胞。Pikas认为肝素酶结合的底物至少含有2－O－硫酸基。HS链接并聚集到细胞外基质蛋白上，在细胞－细胞间及细胞－基质间发挥重要作用，此外，由于HS链具有结合多种蛋白的特殊能力，使许多具有生物活性分子（如生长因子、趋化因子、脂蛋白以及酶等）结合到细胞及细胞外基质上，因此在形态发生、组织修复、神经突生长、炎症、自身免疫及肿瘤转移和血管生成等生理和病理过程中发挥调控作用。 三. 肝素酶的提取、纯化工艺 1.2.1分离乙酰肝素酶蛋白编码基因和测序鉴定以人胎盘cDNA文库为模板，进行PCR. 上游引物5′ATGCTGCTGCGCTCG AAGCCTGCGCT3′，下游引物5′TCAGATGCAAGCAGCAA CTTTGGCAT3′.PCR条件为：95℃ 5 min，变性进入循环；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环后72℃继续延伸5 min. 8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，直接克隆入pGEMT载体，测定基因序列. 1.2.2构建载体PGEX2TK50 ku HPA根据测定的乙酰肝素酶核苷酸序列，设计了如下一对引物扩增乙酰肝素酶50 ku大亚基基因片段：5′CGGGATCCAAAAAGTTCAAGAACAGCAC 3′，其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，5′CGGAATTCTCAGATGCAAGCAG CAACTTTGG 3′,其中GAATTC为EcoRⅠ酶切位点. PCR条件为：95℃ 5 min 变性进入循环；94℃ 30 s，60℃ 30 s, 72℃ 30 s，30个循环后72℃继续延伸5 min. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物. 将扩增出来的乙酰肝素酶基因大亚基的基因产物纯化，酶切，与质粒载体连接，克隆入PGEX2TK原核表达载体，构建载体PGEX2TK50 ku HPA，转化DH5α. 测序鉴定表达载体的序列和阅读框架.
低分子肝素与普通肝素的 抗凝对比 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
低分子肝素是20世纪70年代发展起来的一种新型抗凝血药物,是普通肝素经过化学分离方法制备的一种短链制剂。 与普通肝素相比,其特点在于:1.对Xa和XIIa因子的抑制作用比对IIa因子的抑制作用强，对血小板的影响小；2.抗凝作用强，普通肝素常会受血小板因子4的抑制，而低分子肝素不会；3.半衰期长，生物利用度高。其半衰期长为200到300分钟，是普通肝素的2到4倍;4.所引起的出血并发症少，一般无需监测抗凝活性。我个人觉得最后一点最重要，最实用：我所在的肾内科应用低分子肝素的时候很多，比如透析插管，应用低分子肝素可以防止插管部位血栓形成，同时又不用太担心出血的危险，所以只要病人经济允许（低分子肝素比普通肝素贵），就推荐使用海普宁、立迈青等低分子肝素制剂。 肝素是由葡萄糖胺和葡萄糖醛酸交联而成的粘多糖酯，分子量为O.5~3万。由于其生物活性不一，仅低分子的1/3部分有较强的抗凝作用，高分子部分易致出血、血小板减少、脂质代谢异常等不良反应，临床范围应用受限。为此，近年国内外致力于低分子肝素的开发，将肝素经化学或酶解聚后生成平均分子量在4000~6500间的肝素片段。因分子量较小，不易被在血栓形成中血小板释血的血小板第Ⅳ因子中和，抗凝效果和纤溶作用得以增强，而抗血小板、诱发出血的作用大为减弱，对脂质代谢的影响极小，加之生物利用度高达98%，量效关系明确、固定剂量时抗凝效果易于预测，血浆半衰期较普通肝素长2~3倍，不透过胎盘屏障，给药更为方便而禁忌症少，因而倍受临床青睐，目前广泛用于下列疾病：血液透析：普通肝素虽为透析时的常用抗凝剂，但抗凝效价欠稳定，易致血小板减少、出血危险性大，久用尚有骨质疏松和脂类代谢紊乱之虑。近年尝试低分子肝素，发现该药抗凝血作用良好，不发生出血和脂代谢紊乱。推荐为普通肝素的安全、有效替代品。 需要注意的是，该药各制品之间，因分子量、血浆清除率、剂量、用法及临床疗效和安全性各不相同，彼此间应视为明显不同的制剂，不可混用。
cati on(DREA M )trial 1J 21D i atet es Care ,2008;31(5):1007-14119 K j el d sen SE ,J a m erson KA,Bak ri s GL,et al 1Avoiding card i ovascular e -ven ts t h rough comb i nati on therapy i n patients li vi ng w it h syst oli c hyper -tens i on i nvesti gators 1Pred ictors of blood p ressure res pon se to i nten sified and fi xed co mb i nati on treat m en t of treat m en t of hypertens i on:t he AC -COM PL I SH study 1J 21B lood Press ,2008;17(1):7-171 20 W ang J G,Staessen J A,L i Y ,et a l 1C aroti d i n ti m a -m ed i a th i ckn ess and an ti hypertens i ve treat m ent :a m eta -anal ys i s of rando m i zed contro ll ed tr-i als 1J 21Stroke ,2006;37(7):1933-401 21 M arti na B ,W einb acher M,Dre w e J ,et a l 1E ffects of l osartan titrated to l os art an /hydroch l oroth i az i de and am l od i p i ne on blood press u re and pe -ri pheral cap illary m icroci rcu l ation i n pati en ts w it h m il d -to -m oderate hy -pertens i on 1J 21J H um H ypertens ,1998;17(7):473-81 22 C al houn DA,J on es D ,Tex t or S ,et a l 1Resistant hyperten si on :d i agnos i s , eval uation,and treat m en t :a sci en tific state m en t fro m t h eAm eri can H eart Associati on Profes s i on al Educati on Co mm ittee of the C ouncil f or H igh B lood Press ure Res earch 1J 21H yp ertension ,2008;51(6):1403-19123 The ALL HAT offi cers and coord i n ators f or t h eALL HAT coll ab orati ve re -searc h group 1M aj or outco m es i n h i gh ri sk hyp ertens i ve patients rando m-i zed t o ACE i nh i b it or a ca l ci um channel B l ocker vs D i u retic-The ant-i hypert en sive and lipid -lo w ering treat m en t t o preven t heart attack trial (ALL HAT )1J 21J A M A,2002;288(23):2981-971 24 B erl T ,Hun sicker LG ,Le w i s JB ,et al 1Irb esartan D iabetic Neph ropathy T ri al 1Collaborative S t udy G roup 1C ard i ovascu l ar ou tco m es i n the Irbe -sartan DiabeticN ephropathy Trial of pati en ts w i th t ype 2diabetes and o -vert nephropat hy 1J 21Ann I n tern M ed ,2003;138(7):542-91 12010-07-21收稿 2010-09-06修回2 (编辑 曲 莉) 肝素及其衍生物的抗肿瘤作用研究进展 陈小军 孙丽华 (南京医科大学附属南京市第一医院呼吸科,江苏 南京 210006) 1关键词2 肝素;低分子量肝素;血管内皮细胞;细胞外基质;血管平滑肌 1中图分类号2 R73 1文献标识码2 A 1文章编号2 1005-9202(2010)22-3425-03 第一作者:陈小军(1973-),男,博士,主治医师,主要从事呼吸系统肿瘤 研究。 未分级肝素(UFH )和低分子量肝素(LMWH )已被广泛用于各种情况下的抗凝治疗。U FH 和L MWH 通过激活生理性的凝血抑制剂抗凝血酶,抵消许多参与凝血的丝氨酸蛋白酶,尤其是活化的凝血因子X 和凝血酶发挥其抗凝血作用。U FH 和L WMH 还有其他广泛的生物学活性,如抗肿瘤、抗血管生成及抗炎作用。 1 U FH 和L MWH 在肿瘤治疗领域的积极作用 111 肝素及其衍生物治疗肿瘤的积极效果 临床观察发现,抗凝治疗能改善小细胞肺癌(SCLC )的预后。第一个双盲的随机对照评价LMW H 在进展期恶性疾病治疗上的作用的试验是1995年开展的针对385例进展期的实体瘤患者的FAM OU S 研究,试验组患者给予L MWH 达肝素钠(D a ltepar i n),对照组给予生理盐水注射,观察时间为1年。最终结果表明,皮下注射D a ltepa ri n 1年后患者生存率增加5%;L MWH 治疗的积极效应随时间推移逐渐显现,在17~48个月期间最明显;患者中位生存率由对照组2413个月增加到试验组的4315个月112;预计的2年生存率试验组为27%,对照组为18%;3年生存率试验组为21%,对照组为12%。K l erk 等 122 进行的M ALT 研究是在具 有恶性肿瘤但没有静脉血栓栓塞的302例患者身上进行的另外一项试验。试验组和对照组分别给予6w 的LMWH N ad -rapari n 和安慰剂。M ALT 的基本结果与FAM OU S 研究类似,并且发现LMWH 在原先有较好预后的患者上有更为突出 的作用。 112 UFH 和LMWH 的化疗增敏作用 A lti nbas 等将84例SCLC 患者随机分为2组,对照组给予CEV (卡铂、依托泊甙、长春新碱)方案化疗,试验组在进行CE V 方案化疗的同时,给予L MWH 。试验组和对照组相比,总体的肿瘤反应率分别为6912%和4215%;CEV 方案化疗和LMWH 的结合在不同的疾病阶段对病情的改善是相同的132。Icli 等的研究提示L MWH 能提高CG (顺铂、吉西他滨)方案对进展期胰腺的化疗效果142。D i N iso 等同样在进展期的恶性肿瘤患者观察到了L MWH 的增强化疗效果的作用152。进一步的研究发现,对肿瘤患者在给予维生素K 后,虽能取得与U FH 或其衍生物同样的抗凝效果,但对生存率无影响。因此,肝素及其衍生物在肿瘤治疗上表现出的良好作用不只与其抗凝作用有关。 2 U FH 和L MWH 抑制肿瘤生长及进展的机制211 UFH 和L MWH 与血管形成 21111 U FH 和LMWH 对血管内皮细胞的影响 1UFH 和L MWH 抑制微血管内皮细胞(MV ECs)的激活,肿瘤新生血管的形成是由MV ECs 驱动的。MV ECs 的激活使得基底膜降解,内皮细胞进入间质基质,最后增殖并形成毛细血管样管状结构。oU F H 影响M VEC s 和其所侵及的基质的相互作用,肿瘤能释放多种生长因子,如血管内皮生长因子(V EGF )、碱性成纤维生长因子(bFG F )、分散因子等。这些血管生长因子可以与内皮细胞表面的具有高亲合性受体相结合,并与其他的细胞因子相协调,刺激血管的形成。 U F H 和硫酸乙酰肝素调节生长因子与其受体的结合,影响 # 3425#陈小军等 肝素及其衍生物的抗肿瘤作用研究进展 第22期
HPSE(Heparanase) is also named as HEP, HPA, HPA1, HPR1, HPSE1, HSE1 and belongs to the glycosyl hydrolase 79 family. It is a endoglycosidase that cleaves heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) into heparan sulfate side chains and core proteoglycans. HPSE is essential in the disassembly of the extracellular matrix (ECM) by invading cells. It has 3 isoforms produced by alternative splicing with the molecular weight of 61 kDa, 55 kDa and 53 kDa. The full length protein has six glycosylation sites. The cleavage of the 65 kDa form leads to the generation of a linker peptide, and 8 kDa and 50 kDa products. The active form, the 8/50 kDa heterodimer, is resistant to degradation and glycosylation of the 50 kDa subunit appears to be essential for its solubility. 1.HPA酶分子量大小前体65kd 活性为50kd 2.qRT-PCR 3.引物证明吗 4.Hpse 与hpa 区别 5.盒子
有区别的，首先分子组成上，肝素阴离子一个是结合一价的钠离子，另一个是结合二价的钙离子。在低分子肝素的应用上，二者的性质是不一样的，现在的医学发展的趋势是低分子肝素钙，是肝素钠的在加工产物。保证了肝素应用过程中的安全性。 低分子肝素前体是肝素，而肝素是从猪大肠提取的。肝素是一类物质。通过裂解得到了依诺肝素、那曲肝素、达肝素、国产低分子肝素（克赛的裂解方式是制造工艺是不能仿制的）。由于裂解方式有差别得到了不同分子量和抗xa 与抗iia的比值不同（克赛比值最大4:1），导致抗凝的效果不同。所以国内的靠离子区分（不严谨）。 注： 低分子肝素是生物制剂，生物制剂的仿制和传统意义上的仿制是不同的。 欧盟理事会、美国食品药品管理局以及美国和欧洲心脏病学会等权威机构的共识是： 不同的生物制剂产品之间是不能互换的。这提示在临床选择药物时，应牢记不能仅凭仿制产品声称具有与依诺肝素相同的分子量、抗因子Xa或抗因子Ⅱa活性，和/或抗Xa/抗Ⅱa比值，就认为两者具有相同的药理学活性、相同的疗效和安全性。 肝素(包括肝素钠、肝素钙、低分子肝素)、都是抗凝血药。 肝素分类 (1)普通(标准)肝素是由猪或羊黏膜提取，平均分子量为15000，相当稳定。 (2)通常把分子量小于6000的称为低分子肝素。低分子肝素与普通肝素比较，其半衰期较长，抗血栓效果好，而抗凝出血倾向较弱，有取代普通肝素的趋势。近年临床常用的有： 达肝素钠(法安明)、依诺肝素钠(克赛)、低分子肝素钙(速避凝、那屈肝素钙)。
(3)目前正在深入研究的肝素制剂中还有低抗凝活性肝素、改构型肝素、类肝素等,这些药物特点是具有低抗凝、高抗栓、作用时间长和出血作用少的优点，很有开发前途。 肝素钠： 本品系自猪的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐，属粘多糖类物质，通过激活抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)而发挥抗凝作用。它对凝血过程的三个阶段均有影响，在体内外均有抗凝作用，可延长凝血时间、凝血酶原时间和凝血酶时间。口服不吸收，皮下、肌肉或静脉给药均吸收良好。 肝素钙与肝素钠作用相似，但本品皮下注射后不减少细胞间毛细血管的钙胶质，也不改变血管通透性，基本上克服了肝素钠皮下注射易致出血的副作用。本品还有明显的抗肾素和抗醛固酮的活性
硫酸乙酰肝素的序列与生物活性关系探究 蛋白聚糖是一类普遍存在于哺乳动物细胞表面和细胞外基质的大分子。蛋白聚糖一般是由一个或多个糖胺聚糖链共价连接在核心蛋白上组成的。 糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)是一类线性的长链碳水化合物,由于 硫酸基团和羧基基团的存在因此带有大量的负电荷。天然存在的糖胺聚糖主要分为四类包括硫酸乙酰肝素(Heparansulfate,HS)/肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。 其中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖构成主要一类具有重要生物学活性的蛋白聚糖组。肝素是一种细胞内的糖胺聚糖,主要存在于肥大细胞中。 肝素与HS具有相似的结构组成都是由糖醛酸(葡萄糖醛酸和艾杜糖醛 酸,Glucronic acid(GlcA)和 Iduronicacid(IdoA))和葡萄糖胺(Glucosamine,GlcN)通过 1-4 糖苷键形成的二糖单元(-HexAα/β1,4-GlcNα1,4-)组成,在其合成过程中IdoA的2-位或GlcA的2-位以及GlcN的N-位、6- 位或3-位会发生不同程度的硫酸化修饰,肝素的硫酸化程度要高于HS。肝素/HS 与蛋白配体的结合主要是通过糖链的高负电荷与蛋白的正电荷之间的静电相互 作用进行的。 通常认为肝素/HS与蛋白配体的相互作用主要依赖于糖链中羧基和硫酸取 代基团的数目以及硫酸取代基团在糖链中的分布。自二十世纪三十年代以来,肝素已被成功用作注射用抗凝血药物用于预防和治疗血栓性疾病。 肝素与抗凝血酶(Antithrombin,ATⅢ)的相互作用是目前研究最明确的肝素-蛋白配体结合实例。肝素与ATⅢ的结合被称为“锁-钥”结合模式,主要依赖于肝素糖链中含有特殊3-O-硫酸化GlcN的戊糖序列
有区别的，首先分子组成上，肝素阴离子一个是结合一价的钠离子，另一个是结合二价的钙离子。在低分子肝素的应用上，二者的性质是不一样的，现在的医学发展的趋势是低分子肝素钙，是肝素钠的在加工产物。保证了肝素应用过程中的安全性。 低分子肝素前体是肝素，而肝素是从猪大肠提取的。肝素是一类物质。通过裂解得到了依诺肝素、那曲肝素、达肝素、国产低分子肝素（克赛的裂解方式是制造工艺是不能仿制的）。由于裂解方式有差别得到了不同分子量和抗xa与抗iia的比值不同（克赛比值最大4:1），导致抗凝的效果不同。所以国内的靠离子区分（不严谨）。 注：低分子肝素是生物制剂，生物制剂的仿制和传统意义上的仿制是不同的。欧盟理事会、美国食品药品管理局以及美国和欧洲心脏病学会等权威机构的共识是：不同的生物制剂产品之间是不能互换的。这提示在临床选择药物时，应牢记不能仅凭仿制产品声称具有与依诺肝素相同的分子量、抗因子Xa或抗因子Ⅱa 活性，和/或抗Xa/抗Ⅱa比值，就认为两者具有相同的药理学活性、相同的疗效和安全性。 肝素(包括肝素钠、肝素钙、低分子肝素)、都是抗凝血药。 肝素分类 (1) 普通(标准)肝素是由猪或羊黏膜提取，平均分子量为15000，相当稳定。 (2) 通常把分子量小于6000的称为低分子肝素。低分子肝素与普通肝素比较，其半衰期较长，抗血栓效果好，而抗凝出血倾向较弱，有取代普通肝素的趋势。近年临床常用的有：达肝素钠(法安明)、依诺肝素钠(克赛)、低分子肝素钙(速避凝、那屈肝素钙)。 (3) 目前正在深入研究的肝素制剂中还有低抗凝活性肝素、改构型肝素、类肝素等, 这些药物特点是具有低抗凝、高抗栓、作用时间长和出血作用少的优点，很有开发前途。 肝素钠：本品系自猪的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐，属粘多糖类物质，通过激活抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)而发挥抗凝作用。它对凝血过程的三个阶段均有影响，在体内外均有抗
乙酰肝素酶研究进展 乙酰肝素酶( heparanase, Hpa) 是近年发现的肿瘤重要功能酶, 是体内唯一能够降解糖氨聚糖中的硫酸乙酰肝素( heparan sulfat , HS) 链的内切糖苷酶,特异识别HS 侧链上的特异性位点, 可以在特 定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在各种蛋白聚糖中最 具生物活性,它参与多级联细胞粘附反应过程,并与粘附分子、细胞因子、细胞间信号分子等 相互作用,在影响细胞增殖、分化、迁移及形态等方面具有重要作用,在各种炎症损伤、缺血再灌注损伤、血栓形成及肿瘤转移等过程中具有重要功能。( heparan sulfate protoglycan,HSPG) , 将HS 裂解为10~ 20 个糖单位大小的短糖链, 并释放结合在HS 上的生长因子。乙酰肝素酶可促进细胞的浸润和转移, 还可以促进肿瘤细胞分裂、趋化、微血管形成。是目前在哺乳动物中发现的唯一一个可以剪切HSPGs 上HS 侧链的水解酶, 是抗肿瘤 的理想靶点。 细胞发生侵袭转移首先要穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障。该屏障主要有两种成分构成:一是结构蛋白, 包括胶原、层黏素、纤维结合素和玻璃体结合素等, 二是糖氨聚糖, 主要成分是HSPG,是 广泛存在于脊椎动物组织细胞外基质( extracellular matrix, ECM) 和细胞表面的复杂的生物大分子,是构成基底膜的主要成分。HSPG 主要由一个核心蛋白和数个与之共价连接的线性HS 侧链组成[ 1] ,HS 是由己糖醛酸和葡胺聚糖组成的重复单位构成。HSPG 能与细胞表面 及ECM 中的活性分子结合, 粘附于细胞表面, 是细胞外基质聚集和 稳定的基础, 拥有限制细胞迁移、粘附和选择性分子筛的重要作用, 还可以与多种生物活性分子结合并相互作用。
一、肝素的药理作用 1．抗凝、抗栓和促纤溶作用：普通肝素能够催化抗凝血酶III（AT-III活凝血酶（IIa）以及凝血因子Xa、IXa、XIa、XIIa,从而发挥抗凝和抗栓作用。然而，不同分子量肝素组分催化AT-III灭活IIa以及Xa的强度是不同的。高分子量肝素主要催Iia的灭活，，LMWH 主要催化Xa的灭活。如果定义普通肝素抗IIa/Xa比率为1：1，则LMWH的抗Iia/Xa比率为1：2-1：4。另外，肝素还有不领带于AT-II的抗凝和抗栓作用，如：中和内皮细胞的电荷，催化肝素辅助因子II灭活凝血酶，抑制脂多糖、干扰素-r诱导的单核细胞组织因子、VIIa、Xa以及白细胞介导的促凝活性。肝素还有促进纤溶的作用，有人认为肝素的促纤溶作用与肝素血浆形成的纤维蛋白凝块相对比较松散，因而对组织型纤溶酶原激活物（t-PA）介导的纤溶更加敏感有关；也有人发现肝素可以增加尿激酶介导的纤溶活性。肝素的抗凝、抗栓和促纤溶药理作用对于治疗肾小球疾病可能具有重要的意义。肝素不但可以通过其抗栓作用预防肾小球内微血栓栓塞所致的缺血性损伤，而且可能通过防止凝血酶和纤维蛋白产生、抑制凝血酶的活性阻断凝血酶和纤维蛋白直接介导的细胞增殖和活化。肝素促进纤溶的活性不仅对治疗肾小球内微血栓有益，而且可能通过激活细胞外基质降解酶活性减轻细胞外基质的过度积聚。 2．抗炎作用：肝素在体内能防止多形核白细胞（PMNS）和淋巴细胞移出血管至炎症处，从而抑制迟发型高敏反应，所以肝素可用于控制移排斥反应和自向免疫反应性疾病如变态反应性及脑脊髓膜炎。过去认为肝素的这种作用可以用肝素抑PMNS和血小板分泌的乙酰肝素酶以及T淋巴细胞分泌的葡萄糖苷转移酶活性解释。然而最近的实验发现，肝素抑制白细胞贴壁是因为干扰了白细胞通过L-选择素与血管壁内皮细胞表面的粘蛋白和P-选择素连接。肝素的抗补体活性也可能与其抗炎症效应有关。因为补体能上调内皮细胞表达粘附分子。同时，肝素能降低炎细胞的活性，比如能与单核细胞结合，诱导细胞表型转化、降低单核细胞介导的的细胞促凝活性；能抑PMNS产生超氧阴离子，抑制中性粒细胞酶如组织蛋白酶（cathepsin）G、N-乙酰葡萄糖苷酶和弹性蛋白酶；LMWH能阻抑肥大细胞产生肿瘤坏死因子（TNFA）、白细胞介素-4（IL-4），肝素被肝素酶I降解疾病硫酶二糖也可以抑制巨噬细胞产生TNFa。肝素还抑制系膜细胞分泌白细胞介素6（IL-6），促进内皮细胞释放超氧化物歧化酶，抑制内皮细胞细胞表达单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）。另外，普通肝素LMWH还可能直接影响免疫复全物肾炎的发生机制。普通肝素、反应性核小体原-抗体复合物相互作用，阻止这些免疫复合物与肾小球基底膜结合，并延缓和减轻Lpr/Lpr狼疮小鼠肾脏病变的进展，防止发生蛋白尿。肝素还能部分清除慢性血清病性肾小球肾炎模型动物肾小球内沉积的抗原。 3．调节细胞增殖作用：肝素还有调节细胞增殖的作用。小剂量肝素（中位有效剂量2-5ug/ml）抑制系胞膜细胞的血管平滑肌细胞增殖，促进内皮细胞和成纤维细胞增殖，大剂量肝素（中位有效剂量200-500ug/ml）也能抑制内皮细胞的增殖。肝素对细胞增殖的不同影响可能与下列因素有关：（1）促进转化生长因子（TGFβ）从无活性的复合物中释放出来，后者促进成纤维细胞增殖并抑制其他类型细胞增殖；（2）促进碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的内皮细胞增殖，抑制bFGF介导的动脉平滑肌细胞增殖；（3）阻抑血小板源性生长因子（PDGF）和内皮素（ET-1）的释放。肝素对不同细胞的不同调节作用对于促进创伤修复、防止过度增殖和硬化可能具有重要意义。肝素对细胞增殖的影响与下列细胞内信息传导途径有关；抑制细胞内钙离子动员、阻断钠/氢离子交换、阻断磷脂酰肌醇代谢、抑制蛋白激酶C和丝裂原活化蛋白激酶、阻断细胞周期、抑c-fos、c-myc、sgk基因表达。 4．扩张血管与降压作用：肝素具有扩张血管和降低血压的作用，其机制为，
5生物工程进展62000,Vol.20,No.2 研究 进展多糖抗病毒作用研究进展ò1硫酸多糖抗病毒作用 王长云管华诗 (青岛海洋大学海洋药物与食品研究所,青岛266003) 摘要硫酸多糖的抗病毒活性,包括抗艾滋病毒H IV-1活性,在近年得以阐明。本文综述了硫酸多糖的抗病毒作用、抗病毒机理及其构效关系。硫酸多糖具有广阔的临床应用前景,其抗病毒作用值得深入研究。 关键词硫酸多糖抗病毒活性综述 1硫酸多糖抗病毒活性 硫酸多糖是指糖羟基上带有硫酸根的多糖,是抗病毒多糖中研究最多的一类多糖。包括从植物中提取的各种硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸衍生物及人工合成的各种硫酸多糖,如:硫酸葡聚糖,硫酸戊聚糖,硫酸木聚糖,硫酸香菇多糖,岩藻依聚糖,卡拉胶等。硫酸多糖具有广泛的生物学性质,包括抗病毒、抗肿瘤、对免疫系统作用和抗凝活性。早在30年前就已知硫酸多糖的抗病毒性质。1964年Nahm ias等[1]报道过肝素对HSV有抑制作用,但没有引起人们的重视,当时认为这种作用是非特异性的。直到80年代末研究发现几种聚阴离子物质是H IV复制的有效抑制剂[2],才又引起对硫酸多糖抗病毒作用研究的兴趣。鉴于此,美国国家癌症研究所对海洋无脊椎动物筛选发现,其水相提取物显示了高百分率(23%)的抗H IV活性,而这些活性组分基本是硫酸多糖,而且许多提取物显示出类于硫酸葡聚糖和其他硫酸多糖的生物学特性[3]。近年来,随着对硫酸多糖的抗病毒活性研究的深入,这类多糖引起了人们的极大关注[4]。 硫酸多糖及某些多糖的硫酸化衍生物无论在体内还是在体外,都显示了不同程度的抗病毒活性。许多研究结果表明,硫酸葡聚糖和其他聚阴离子物质可干扰反转录病毒及其他病毒的吸附和侵入[5,6],有些表现出对各种反转录病毒的逆转录酶(RT S)的抑制活性[7-9]。有报道用硫酸葡聚糖和其他硫酸多糖,其剂量常低于细胞毒水平,可完全在体外抑制H IV-1复制[10,11]。Nakashima[7],Baba[10]和U eno[12]阐明了低分子量和高分子量硫酸葡聚糖,肝素,多聚硫酸木聚糖,核聚糖及甘草皂素对H IV-1细胞毒活性(CD4+T淋巴细胞)。H IV-1对CD4+淋巴细胞系MT-4感染几乎完全被硫酸葡聚糖(10-25L g/ml)抑制,HIV-1抗原阳性细胞在5L g/ml硫酸葡聚糖存在时,经12天培养可被消除[8]。 硫酸多糖,更一般地,聚硫酸化合物,不仅对H IV有抑制作用,还对其他被膜病毒具抑制作用,包括单纯疱疹病毒HSV,巨细胞病毒(cy-tomeg alovirus),流感A型病毒(influenza A virus),囊状胃炎病毒(vesicular stomatitis virus),反转录病毒(retroviruses)等[10,13-16]。硫酸多糖对许多组织培养中的动物病毒,包括疱疹病毒、微小RNA病毒、节肢介体病毒、粘液病毒等具有抑制作用。肝素,硫酸葡聚糖和其他聚阴离子可抑制劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus),鸟肉瘤病毒(avian sarcoma virus)和鼠Friend白血病病毒。肝素在同样浓度范围内,可抑制H IV-1阳性细胞形态,而低分子肝素的抑制活性则相当低[17]。M izumoto[11]和Bagas-ra[5]都用抑制H IV-l诱导的合胞体形成作为抗H IV-1活性试验的主要手段。 据报道,半合成硫酸多糖,如硫酸葡聚糖,多聚硫酸戊糖[18],硫酸香菇多糖[19]和硫酸呋喃核聚糖[20]等可在体外抑制H IV引起的细胞病作用。香菇多糖是一种B-1,3-连接并带有B-1,6-侧链的葡聚糖,本身虽无抗H IV活性,硫酸化后却可抑制H IV-1产生的细胞病变[4,21]。硫酸化烷基寡糖,如:硫酸化十八烷六麦芽糖,硫酸化十二烷五乳糖在体外0. 4-0.7L g/mL即可抑制H IV感染,而无烷基的硫酸化寡糖抗H IV活性则较低[22]。NCMCS(N-Car-boxymethylchitosan-N,O-Sulfate)-几丁质的硫酸衍生物能抑制H IV-1在CD4+T淋巴细胞中以及劳氏 3
低分子肝素和普通肝素治疗下肢深静脉血栓的临床观察 令狐文艳 【摘要】目的：比较低分子肝素（LMWH）和普通肝素（UFH）治疗下肢深静脉血栓（DVT）疗效和安全性。方法：85例DVT患者随机分为两组，低分子肝素组给予低分子肝素和华法令抗凝；肝素组给予普通肝素和华法令抗凝。比较治疗前后症状、体征和血管彩超检查情况。结果：UFH组总有效率达95.24%，LMWH组总有效率达93.02%，两组间治疗效果无显著差异；UFH组不良反应发生率为7.14%，LMWH组不良反应发生率为11.63%，两组间无显著差异。结论：低分子肝素和普通肝素治疗DVT均安全有效。 【关键词】低分子肝素普通肝素下肢深静脉血栓疗效下肢深静脉血栓（DVT）是常见的外周血管疾病，可造成下肢血流障碍和静脉瓣膜功能不全，且可能发生急性肺栓塞危及患者生命。治疗主要目的是减少肺栓塞，预防血栓后综合征和慢性血栓栓塞性肺动脉高压。抗凝治疗是DVT的主要治疗方法，能有效改善侧枝循环，防止再发血栓。本报告采用低分子肝素（LMWH）和普通肝素(UFH)治疗DVT，比较它们的疗效，以指导临床用药。 1 资料和方法
1.1 一般资料 选择我院2004年4月～2007年4月诊断为DVT的病例85例，普通肝素组42例，其中男18例，女24例，年龄24岁～70岁，平均年龄（50±14）岁。其中单纯DVT 12例，伴随2型糖尿病4例，骨折4例，妊娠4例，高血压病4例，剖宫产术后2例，脑梗死2例，脑出血2例，子宫切除术后2例，急性心肌梗死1例，急性闭塞性颅脑损伤1例，宫颈癌放疗术后1例，风湿性心脏瓣膜病1例，干燥综合征1例，合并肺栓塞1例。低分子肝素组43例，其中男20例，女23例，年龄27岁～75岁，平均年龄（51±12）岁，其中单纯DVT 14例，伴随骨折6例，2型糖尿病5例，高血压5例，妊娠3例，脑梗死2例，肺癌2例，乳腺癌2例，慢性肾功能不全2例，睡眠呼吸暂停1例，贫血1例。所选病例均经血管彩超明确诊断DVT。 1.2 诊断标准［１］ ①临床症状和体征：患肢肿胀、疼痛、发热、皮温增高，股三角区或小腿有明显压痛，Homan征阳性，肿胀严重者可导致肢体供血障碍而出现青肿等。排除急性动脉栓塞、急性淋巴管炎、小腿损伤性血肿等疾病。②肢围的测定：以髌骨上15 cm和髌骨下10 cm测量患肢及健侧肢围，求出肢围差，可作为观察治疗的标准之一。③血管彩超检查：下肢静脉彩超示病变的深静脉管腔内有实质性回声，部分或全部占据血管腔。
文章编号： １０００－１３３６（２０１０）02－0246-04 硫酸糖肽的生物活性及药理作用 汤日玲 王 涵 姬胜利 山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，济南 ２５００１２ 摘要：黏多糖类物质独特的生物活性已成为生物化学和医学领域的热点。硫糖肽作为黏多糖类的一种，具有广泛的抗炎、抗溃疡作用，尤其是预防和治疗溃疡方面的优势引起人们越来越多的关注，具有广阔的药物开发和应用前景。本文就硫糖肽的生物活性及其药理作用展开综述，并结合硫糖肽的市场需求和研究现状进行了展望。关键词：硫酸糖肽；抗溃疡；抗炎；溃疡愈合质量中图分类号：Ｑ５３ 收稿日期：２００９－１０－２８ 作者简介：汤日玲（１９８４－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｒｌ＠ｍａｉｌ．ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ； 王涵（１９８８－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：２８５００３９１７＠１６３．ｃｏｍ．ｃｎ； 姬胜利（１９６３－），男， 博士，教授，通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｇｌｉｊｉ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 硫酸糖肽（ｓｕｌｇｌｙｃｏｔｉｄｅ， ＳＧ）即糖肽硫酸酯，简称硫糖肽，是从猪的十二指肠或胃黏膜提取糖肽经过磺化处理得到的。ＳＧ属于黏多糖，理论上应具备这类物质的多种生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗动脉粥样硬化、抗炎及降血脂等［１］。研究表明ＳＧ对消化性溃疡（ｐｅｐｔｉｃ ｕｌｃｅｒ， ＰＵ）具有独特疗效，能显著提高溃疡愈合质量、降低长期用药的毒副作用［２－４］。由于ＳＧ疗效确切、副作用小，在近年来受到重视，尤因其抗消化性溃疡活性强而被广泛应用于临床。随着生活质量的提高，安全有效无复发的抗溃疡药物逐渐成为临床治疗ＰＵ的首选。目前ＳＧ原料紧缺，多数国家只能依靠进口，我国在这方面的研究也是刚刚起步。因此优化ＳＧ合成工艺、制定质量标准、分析糖链结构、测定氨基酸序列及探讨其作用机制等成为ＳＧ的重要研究方向。 １． ＳＧ的分布和化学组成 ＳＧ来源于猪胃黏膜或十二指肠的糖肽类物质，因此其分布受糖肽多样性影响。糖肽是动植物及真菌体内广泛分布的重要组分，是构成细菌细胞壁的主要成分，也是维持生命活动不可缺少的生理活性物质。如云芝糖肽能增强和调节机体免疫［５］；灰树花菌丝糖肽有抗肿瘤活性［６］；黄豆β－伴大豆糖蛋白所含 糖肽能抑制大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）吸附人肠内细胞［７］；东方拟无枝酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）分离出核酸化合物编码糖基转移酶，通过基因重组能表达糖肽类化合物［８］。 作为黏多糖类物质，ＳＧ化学组成和结构仍以主要双糖结构为代表。理化分析表明ＳＧ组成中不含有糖醛酸，含有己糖、氨基己糖、氨基酸和少量的神经氨酸衍生物。电泳和纸层析表明为单一产物，紫外全谱扫描在２８０ ｎｍ处有紫外吸收，２０２ ｎｍ有末端吸收，具体结构尚无报道。ＳＧ中的氨基酸序列分析及结合ＵＶ、１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、ＩＲ测定ＳＧ中的多糖结构是研究ＳＧ的首要任务，也是探索ＳＧ结构与功能的重要手段，更是发现ＳＧ多种生物活性的有效途径。２． ＳＧ生物活性 作为结构复杂的多硫酸化黏多糖，ＳＧ具有抗炎、抗溃疡等多种生物学功能。２．１ 抗炎活性 炎症反应是多种因子、细胞参与的复杂的病理生理过程，实质是黏附分子介导的白细胞黏附及其黏附级联反应。Ｙａｎｇ等［９］发现墨角藻聚糖（Ａｌｇａｌｆｕｃｏｉｄａｎ）经过硫酸化修饰后具有抗血栓、抗炎、抗肿瘤等活性。Ｓｌｏｍｉａｎｙ 等［１０］采用幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ， ＨＰ）脂多糖感染大鼠胃黏膜引发炎症，ＳＧ治疗后黏膜损伤比对照组减少５６．７％，表明ＳＧ对黏膜炎症有显著疗效。Ｂａｚｕｒｏ等［１１］研究ＳＧ治疗ＨＰ引起的萎缩胃炎，结果发现ＳＧ能明显减弱炎性浸润，减少白细