多管发酵法与滤膜法测定粪大肠菌群对照
实验
【摘要】本文采用传统多管发酵法与滤膜法对水中粪大肠菌群进行比对实验，比较两者监测结果的一致性。结果表明，两种方法在结果一致性方面相关性好，与多管发酵法相比，滤膜法具有简便快速、结果准确的特点，实验过程污染的可能性低、无二次污染等优点。
【关键词】多管发酵法滤膜法粪大肠菌群
引言；水中粪大肠菌群的测定是污水处理的重要指标之一，环境监测的重要意义指通过对影响环境质量因素的代表值的测定，确定环境质量（或污染程度）及其变化趋势，从而指导工艺。然而面对每天繁重的监测工作，如何使实验更准确，方法更简便，是我们实验人员更加关注的问题。本文主要讨论多管发酵法与滤膜法测定粪大肠菌群这两种方法，通过实验对照，确定一个最佳方法用于工艺指导。
粪大肠菌群是水质污染的重要指标之一。目前，我国地表水及废水中粪大肠菌群的监测方法主要有传统的多管发酵法（MTF）及滤膜法（MF）。无论是哪一种方法，都是利用其可在高温生长并发酵乳糖产酸产气的特点，所以实验过程最终要的环节是严格地控制好温度。
本实验通过采用传统多管发酵法与滤膜法，对大量实际水样中的粪大肠菌群同步检测，进行比对实验，实验结果进行比较分析。
一、实验部分
1、多管发酵法
1.1培养基的准备
① 乳糖蛋白胨培养液：称取23.3g乳糖蛋白胨培养液于1L超纯水中，分装于有倒立发酵管的试管中，120度高温灭菌15分钟。单倍培养液取10ml，准备10支。三倍培养液取5ml，准备5支。
② EC肉汤：称取3.7g EC肉汤于1L超纯水中，分装于有倒立发酵管的试管中，120度高温灭菌15分钟，每管8ml，准备10支。
1.2实验方法
①根据我厂的出水情况，接种量分别为10ml、1ml、
0.1ml，接种体积10ml的水样装入3倍乳糖蛋白胨培养液中，共5支。接种体积1ml和0.1ml的水样各装入单倍乳糖蛋白胨培养液中，分别5支。共15支。
②在37℃±0.5℃下培养24±2h，产酸和产气的发酵管表明实验阳性。
③如在导管内产气不明显，可将实验结果为阳性的发酵管和产气不明显难以确认的发酵管，用灭菌的接种棒转接
到EC培养液中，在45℃±0.5℃下培养24±2h，培养后观察结果，发酵管产气则证明为粪大肠菌群阳性。
④其结果查表求得MPN指数，从而计算。
我国目前以1L为报告单位，MPN值再乘以10，即为1L水样中的总大肠菌群数。
2、滤膜法
2.1培养基的准备
MFC培养基：称取5.2gMFC培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，待冷却至60℃左右，在无菌条件下倾入灭菌培养皿内，培养基平铺于底部凝固后，等待使用。（9cm 的平皿倾注培养基约15ml左右）
2.2实验方法
①将抽滤装置的滤网，胶垫等先用本生灯或酒精棉球灭菌。
②根据我厂的出水情况，直接取100ml水样进行过滤。
③将滤过水样的滤膜置于培养基表面，将培养皿紧密盖好后，倒置于培养箱中45℃±0.5℃下培养24±2h。
④计数呈蓝色和蓝绿色的菌落，其公式为
二、结果与分析
对15 组数据进行统计，制作成数据对照表，“表1”，根据“表1”绘制成两种方法对照图，“图1”。
如“图1”所示：由于15组数据在采样时，水量不同，
由1000m3/h～5000m3/h不等，所以测得粪大肠菌群数据时多时少，但都达到我厂出水排放标准。在相同时间相同水量的情况下，两种方法测得结果基本相同，并没有出现多管发酵法测定结果总是高于或者少于滤膜法这种规律性现象，结果一致性方面相关性好，无统计学意义上的显著性差异。
三、结论
由于多管发酵法在检测水中粪大肠菌群存在准备工作量大，操作过程复杂，操作检测周期较长（需要48小时以上），干扰因素较多等因素，难以满足大批量样品的检测需要。
与多管发酵法相比，滤膜法具有简便快速、结果准确、节约能源与材料的优势，实验过程污染的可能性低、无二次污染等优点。因此我们在日常的出水粪大肠菌群检测时，提倡采用此方法，能够更快速有效的检测水质、指导工艺。
参考文献
[1]水和废水检测分析方法/国家环境环保总局《水和废水检测分析方法》编委会编.― 4版.―北京：中国环境科学出版社，2011.11（2008.4重印）
[2] 环境工程微生物检验手册/俞毓馨、吴国庆、孟宪庭主编.中国环境科学出版社，1990
粪大肠菌群测定复习试题 一、填空题 1.地表水环境质量标准(GHZB1—1999)中，对环境质量卫生指标粪大肠菌群项目作出明确规定：Ⅰ类水质标准值为；Ⅱ类水质标准值为；Ⅲ类水质标准值为；Ⅳ类水质标准值为，Ⅴ类水质标准值为。 答：≤200个/L；≤1000个/L；≤2000个/L；≤5000个/L；≤10000个/L。 2.粪大肠菌群是一部分，用粪大肠菌群作为卫生学指标比用 更有。目前，粪大肠菌群被认为是受粪便污染的最实用的。 答：总大肠菌群；总大肠菌群；代表性；指示菌。 3.检测粪大肠菌群时作发酵试验用的培养基，是由、、 、等配制而成的，调节pH为，应在 灭菌。 答：蛋白胨；牛肉浸膏；乳糖；氯化钠；7.2-7.4；115℃；20min。 4.农田灌溉水质标准(GB5084—92)中，根据农作物的需求状况，将灌溉水质按灌溉作物分为三类：水作、旱作和蔬菜。其生物指标粪大肠菌群标准值定为 。 答：≤10000个/L。 5.为了区别存在于中的大肠菌群和存在于的大肠菌群,可将培养_ __ _____，在此种条件下仍能_____ 并使____________ _，则称为粪大肠菌群。 答：自然环境；温血动物肠道内；温度提高到44℃；生长；发酵乳糖产酸产气。 6.进行复发酵试验时，用3mm 或灭菌棒将转接到 培养液中。在培养。培养后观察发酵管 表明确信。
答：接种环；培养物；EC；44±0.5℃水浴下，24±2h；产气；试验阳性。 7.在污水综合排放标准(GB8978—1996)中，把医院、兽医院及医疗机构含病原体污水的粪大肠菌群分为三级标准：一级标准值；二级标准值；三级标准值。而传染病、结核病医院污水的粪大肠菌群三级标准值分别为：、、。 答：500个/L；1000个/L；5000个/L；100个/L；500个/L；1000个/L。8.EC培养液的配比是：胰胨，乳糖，氯化钠，磷酸二氢钾，胆盐三号，磷酸氢二钾，溶解于蒸馏水中。在 15min，灭菌后应为。 答：20g；5g；5g；1.5g；1.5g；4g；1000mL；121℃灭菌；pH；6.9。 二、问答题 1.粪大肠菌群的涵义是什么？ 答：指一群需氧及兼性厌氧在44.5℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.控制粪大肠菌群指标值的意义是什么？ 答：为了人体健康卫生的要求。 3.粪大肠菌群测定有几种方法？通常用哪种方法？ 答：有三种：多管发酵法、滤膜法、延迟培养法。用多管发酵法。 4.简诉测定粪大肠菌群多管发酵法的操作步骤？ 答：测定分二个步骤进行：量取若干经稀释的水样，接种乳糖蛋白胨培养液，进行初发酵试验：在37±0.5℃下培养24±2h，产酸和产气的发酵管表明试验阳性，再将表明试验阳性的发酵管中的培养物转接到EC培养液中，进行复发酵试验，在44±0.5℃水浴下培养24±2h，发酵管产气表明确信试验阳性。 5.在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml。 6.什么叫兼性厌氧细菌？ 答：氧存在或不存在的条件下均能繁殖的细菌。
学院：环境科学与工程学院班级：11级环境科学（2）班 姓名：李宝携学号：3111007398 实验3 多管发酵法检测水中的大肠菌群 一、实验目的 （1）了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。 （2）学习检测水中大肠菌群的方法。 二、实验原理 大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。 大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。 多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。当发酵产酸时，溴甲酚紫可由紫色变为黄色，乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。 三、实验材料 1、水样 中心湖湖水 2、试剂 三倍浓缩乳酸蛋白胨培养液 3、仪器及其他用品 试管、发酵管、烧杯、量筒、移液枪、高压灭菌锅 四、操作过程 1、取16支发酵管，其中5支加入5mL三倍乳糖蛋白胨培养液。取35mL三倍乳糖蛋白胨培养液于烧杯中，量取70mL水进行稀释，将三倍乳糖蛋白胨培养液稀释成一倍的乳酸蛋白胨培养液，分别取10mL一倍的乳酸蛋白胨培养液与10支试管中，最后，1支加入9ml自来水。 2、完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。 3、灭菌完毕，冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样。取1mL的水样于装有9mL自来水的试管中，混合摇匀，并分别移1mL于另外的5支10mL的试管中。 4、将各试管充分混均，包装完成，将其置于37℃恒温箱中培养24h。 5、取出培养液，观察试管的颜色及其中的气泡数并记录数据。 6、观察完毕，清洗仪器并整理数据。
筒式微孔膜过滤器验证方案江西隆莱生物制药有限公司
一、方案的起草与审批 1.1验证方案的起草 1.2方案审核 1.3方案批准 目录
1．基本情况 (3) 2．概述 (3) 3．验证项目和验证方法 (4) 3.1 起泡点试验 (4) 3.2 药液适应性实验 (6) 3.3 微生物挑战性实验 (7) 4. 异常情况处理程序 (8) 5. 再验证周期 (8) 6. 验证结果评定与结论 (9) 7. 附件一：预确认记录 (10) 7. 附件二：验证证书 (11) 1.基本情况
设备器具名称：筒式微孔滤膜过滤器 设备器具型号： 设备器具用途：产品的除菌过滤 生产商： 安装地点及使用单位：车间岗位。 主要技术参数： 2.概述 本滤器是筒式微孔滤膜过滤器，滤器材质为优质不锈钢（316L），滤膜材质是聚丙酰胺（或醋酸纤维素、聚丙烯等）。本滤器用于本公司去除液体或气体中的微粒，微生物等杂质，正常的使用程序是先按照“工器具清洁操作操作规程”进行用前或用后清洗，洗好的滤器在存放间晾干后装上滤膜，如需要按照本滤器要求的灭菌条件进行灭菌后待用。由于滤膜的孔径以及它的稳定和可靠的过滤性能直接关系到成品的微生物限度，因此，为了确保本滤器的完好过滤性能，特制订本验证方案对本
滤器进行验证。 3. 验证项目和判断标准 3.1 起泡点试验 3.1.1 目的 确定使用的药液过滤器孔径与工艺规定使用的孔径是否相符。 3.1.2 实验用材料、介质和器具 无油无菌压缩空气、压力表、纯化水 3.1.3 方法 将已清洁的滤器装上待测滤膜，按照滤器的使用说明固紧罗栓，用注射用水充分浸润，夹闭排气孔，将进液端用高强度管道与压力表和无菌压缩空气或氮气连接，逐渐开启供气阀，向待测过滤器中通入无菌压缩空气或氮气，观察过滤器组合中的压力表示数的变化。当过滤器组合的后部导管出口处出现第一个气泡时，读取压力表指示值，此压力数值即为过滤器滤膜的起泡点压力，将此压力与下表对照，可得出待测过滤器滤膜的实际孔径。 3.1.4 判断标准 待测过滤器起泡点压力应大于或等于下表所示孔径所对应压力数值： 表1.过滤器滤膜孔径与起泡点压力对照表 3.1.5.实验结果 表2.滤器的起泡点实验结果
濾膜過濾法 原理:利用0.45±0.02u,直徑為47mm的無菌濾紙在抽氣幫浦真空抽氣上運作, 在將它放在培養液的飽和吸收墊上培養22至24小時,由於大腸菌類無法濾過因而置留在濾膜上,所以可看出菌落。 實驗設備與材料： 所需用具：塑膠培養皿(直徑50mm)6個、無菌濾膜6張、安全吸球、量筒、燒杯數個、錐形瓶、鑷子，取藥杓、秤藥紙，吸收墊，定量玻璃吸管，隔熱板。 所需儀器：過濾抽氣裝置，恆溫培養箱、微量天平、電磁加熱攪拌器。 實驗步驟: 水樣來源---汙水處理廠 1.我們使用的培養基為M-endo agar. 2.二段水以1000mL加入51g M-endo agar.和95%酒精20mL 現在只要需30mL 的二段水所以用下面公式算出所需要的量 M-endo agar 51/1000 = X/30，X=1.53g 95%酒精 20/1000=Y/30，Y=0.6mL 3.然後調備完的東西放入量瓶將磁石放進去，然後放於電磁加熱攪拌器加熱， 它的外圍要用隔熱板圍住，怕後來會發生意外造成人元的損傷，還要隨時注意加熱的狀況，如果沸騰的話就要馬上關掉磁石攪拌器了。 4.等培養基稍微冷卻之後，把它平均的倒入６個4~5mL的空小培養皿，下來等 待凝固後就可以做下一個實驗了。 5.再來之後用六個小燒杯來做十倍稀釋，要先把取回來的水樣樣本取11mL，加 入有100mL的二段水的小燒杯，混合均勻後，再取11mL，加入另一個100mL 二段水的小燒杯，做10-2稀釋，往下繼續做，做到10-5稀釋，所以會有6個濃度各別100mL，分別是原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定 1 范围 本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。 2 定义 粪大肠菌群 fecal coliforms 系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。 3 设备和材料（内容略） 4 培养基和试剂 培养基：遵照附录A的规定。 革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。 5 检验步骤 样品稀释 在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。 用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。 乳糖发酵试验 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。 分离培养 从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。 证实试验 从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。 结果 证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。 附录 A （规范性附录） 培养基 乳糖胆盐发酵培养基 蛋白胨g 猪胆盐g 乳糖g %溴甲酚紫水溶液m L 蒸馏水1000m L
粪大肠菌群的测定 1 卫生学意义 粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标。 2 检验方法 2.1 术语与定义 一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。 2.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱：36℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：46℃±1℃。 （4）天平：感量0.1g。 （5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 （6）无菌锥形瓶：容量500mL。 （7）无菌培养皿：直径90mm。 （8）pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 2.3 培养基和试剂 （1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g；氯化钠：5.0g；乳糖：5.0g；磷酸氢 二钾（K 2HPO 4 ）：2.75g；磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）：2.75g；月桂基硫酸钠：0.1g； 蒸馏水：1000mL；pH：6.8±0.2 2）制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。 （2）EC肉汤（E.coli，BGLB）： 1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g；3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖： 5.0g；磷酸氢二钾（K 2HPO 4 ）：4.0g；磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）：1.5g；氯化钠：5.0g；
粪大肠菌群多管发酵法 1、培养基、试剂与仪器 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。 单倍乳糖蛋白胨培养液： 称取23.0g乳糖蛋白胨营养液于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每试管约8ml（先用移液管吸取7ml至试管中，再用滴管吸取营养液放至小玻璃管中，直至营养液溢出。注意小玻璃管中不能有气泡，若出现气泡，应将气泡排出后再注入营养液。），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 EC 培养液： 称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管8ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 培养基的存放 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。 验所需仪器 超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500ml广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环2步骤 前期准备 器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）：所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌。 广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管（已经装好营养液）、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。 采样：采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。 采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过 2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。 4.2 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表1。(根据实验经验，经过紫外消毒的水样取0.1mL、0.01mL、0.001mL体积进行检测，可根据水样的洁净度适当调整取样体积。) 表1 接种用水量参考表 如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL 或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。 4.3 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 4.4 复发酵试验
滤膜法-粪大肠菌群的测定 1、适用范围 本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。 2、原理 滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。 3仪器： 滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹 3、培养基和试剂 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。 M-FC培养基： 胰胨10g 蛋白胨5g 酵母浸膏 3.0g 氯化钠 5.0g 乳糖12.5g
胆盐三号 1.5g 1%苯胺蓝水溶10ml 1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml 蒸馏水1000ml 制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。加热溶解前，加入1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。 4、步骤 水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。 滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。 过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。培养：使用M-FC培养基。培养基含或不含琼脂，不含琼脂的培养基使已用M-FC 培养基饱和的无菌吸收垫。将滤过水样的滤膜置于琼脂或吸收垫表面。将培养皿紧密盖好后，置于能准确恒温于44.5℃±0.5℃的恒温培养箱或恒温水浴中，经
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910346947.0 (22)申请日 2019.04.27 (71)申请人 南京岚煜生物科技有限公司 地址 211122 江苏省南京市江宁区乾德路2 号 (72)发明人 许行尚 杰弗瑞·陈 于沛 (74)专利代理机构 南京正联知识产权代理有限 公司 32243 代理人 王素琴 (51)Int.Cl. B01D 61/58(2006.01) (54)发明名称 一种全血过滤的方法及用于全血过滤的滤 膜结构 (57)摘要 本发明公开了一种全血过滤的方法及用于 全血过滤的滤膜结构，具体包括以下步骤：(1)选 择由至少两层过滤膜依次从上至下叠加构成滤 膜结构，且将所述滤膜结构进行红细胞凝集素处 理，待用；(2)将全血样本加入所述滤膜结构进行 过滤；(3)收集过滤后的血清或血浆。滤膜结构为 至少两层过滤膜从上至下叠加构成，且叠加的过 滤膜从上至下的孔径逐渐变小，面积逐渐变大或 相等。通过由至少两层过滤膜叠加构成的滤膜结 构，且将所述滤膜结构进行红细胞凝集素处理， 使全血样本中的红细胞与滤膜中红细胞凝集素 相结合，被截留在滤膜结构中，从而以保证红细 胞完全过滤吸附在滤膜结构中，从而实现能从非 常少量的血液中有效稳定地分离出血浆/血清。权利要求书2页 说明书8页 附图1页CN 109925884 A 2019.06.25 C N 109925884 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109925884 A 1.一种全血过滤的方法，其特征在于，具体包括以下步骤： (1)选择由至少两层过滤膜依次从上至下叠加构成滤膜结构，且将所述滤膜结构进行红细胞凝集素处理，待用； (2)将全血样本加入所述滤膜结构进行过滤； (3)收集过滤后的血清或血浆。 2.根据权利要求1所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述过滤膜为多孔结构；所述滤膜结构中叠加的过滤膜从上至下的孔径逐渐变小，面积逐渐变大或相等。 3.根据权利要求1所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述滤膜结构包括两层过滤膜，分别为上层过滤膜和下层过滤膜，所述上层过滤膜为红细胞凝集素滤膜，所述下层过滤膜由至少一层亲水性微孔膜叠加组成；或所述上层过滤膜为亲水过滤膜，所述下层过滤膜为红细胞凝集素滤膜；所述红细胞凝集素滤膜中均匀分布有红细胞凝集素。 4.根据权利要求3所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述上层过滤膜为红细胞凝集素滤膜；所述下层过滤膜为若干滤孔均匀分布且孔径大小不同的过滤膜，或所述下层过滤膜由第一下层膜和第二下层膜依次上下叠加组成，所述第一下层膜的孔径大于所述第二下层膜的孔径。 5.根据权利要求3所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述上层过滤膜为玻璃纤维滤纸或硝酸纤维素膜或聚砜膜；所述下层过滤膜为亲水性微孔膜，包括玻璃纤维滤纸或硝酸纤维素膜或聚砜膜或乙酸纤维素膜；所述步骤(2)过滤时采用上部加压或下部抽吸加快过滤速度。 6.根据权利要求3所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述红细胞凝集素滤膜是将过滤膜进行红细胞凝集素处理得到的，其制备过程为： 1)将红细胞凝集素放入红细胞凝集素缓冲液中稀释； 2)将所述过滤膜放入步骤1)的含有红细胞凝集素的红细胞凝集素缓冲液中润湿，然后在室温晾干，再放置于37℃～55℃温度烘箱中烘干2h以上；或将在红细胞凝集素缓冲液中润湿后的所述过滤膜进行真空抽干或冻干处理。 7.根据权利要求6所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述红细胞凝集素缓冲液为PB 或Tris-HCl或CB；所述红细胞凝集素缓冲液的浓度为5mM～1M；所述红细胞凝集素滤膜中添加的红细胞凝集素的重量不少于5ng。 8.根据权利要求3所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述过滤膜在使用前需采用缓冲液进行处理，所述缓冲液为溶解BSA、氨基酸、含有表面活动性剂成分的任一种缓冲液；处理方法为：将所述过滤膜在缓冲液中润湿后，在室温晾干且干燥2h以上，待用。 9.根据权利要求6所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述上层过滤膜的孔径不小于0.45μm，所述下层过滤膜的孔径为0.2μm～4μm。 10.根据权利要求9所述的全血过滤的方法，其特征在于，所述上层过滤膜的孔径为1μm ～5μm；所述上层过滤膜的厚度为0.5～20mm，所述下层过滤膜的厚度为0.05～2mm；红细胞凝集素滤膜中添加的红细胞凝集素的重量为20ng～100ng。 11.一种用于全血过滤的滤膜结构，其特征在于，该滤膜结构由至少两层过滤膜依次从上至下叠加构成；所述过滤膜为多孔结构；该滤膜结构中叠加的过滤膜的孔径从上至下孔径逐渐变小，面积从上至下逐渐变大或相等。 2
肥料中粪大肠菌群的测定 一：前期准备 一次性帽子、口罩、脚套 1， 移液管10ml 量筒100ml ｝ 玻璃珠 三角瓶 培养皿 2， 乳糖胆盐发酵培养基（用于乳糖发酵） 乳糖发酵培养基（用于复发酵） 伊红美蓝培养基（用于分离培养） } 121℃，15min 无菌水 } 121℃，15min 二：实验过程 无菌条件下进行： 10.0g 固体样品/10ml 液体样品 ↓ 三角瓶（带玻璃珠，90ml 无菌水）1:10=10-1 ↓ 200r/min 振荡30min ↓ 吸取10-1—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:100=10-2 ↓ 吸取吸取10-2—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:1000=10-3 ↓ ……依次稀释得到10-4，10-5等浓度稀释液（每个稀释度必须更换无菌移液管） ↓ 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取1.0ml 加入到乳糖胆盐发酵管内（装有乳糖胆盐发酵培 养基）（每一稀释度接种3支发酵管） ↓ 培养箱45℃，24h ↓ 结果：产酸，颜色变；产气，导管有气泡 不产酸，不产气，为粪大肠菌群阴性 ↓ 分离培养：从产酸产气或只产酸的发酵管中挑取发酵液在伊红美蓝培养基平板上划线 ↓ 培养箱36℃，18-24h ↓ 证实实验：从平板上挑取可以菌落，进行革兰氏染色。 结果：染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性 ↓ 革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中（装有乳糖发酵培养基） ↓ 培养箱44.5℃，24h ↓ 结果，不产气为粪大肠菌群阴性，产气为粪大肠菌群阳性 ↓ 证实为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN 检索表，得出每克（毫 升）肥料样品中的粪大肠菌群数 ｝160℃，4h ｝115℃，15min
滤膜法测定总大肠菌群 1 主题内容与适用范围 本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。 本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。 2 方法提要 用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。 3 培养基与试剂 3.1 品红亚硫酸钠培养基 3.1.1 成份 A 蛋白胨10g B 酵母浸膏5g C 牛肉膏5g D 乳糖10g E 琼脂15~20g F 硫酸氢二钾3.5g G 无水亚硫酸钠5g左右 H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL I 蒸馏水1000mL 3.1.2 储存培养基的制备 先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。 3.1.3 平皿培养基的配制 将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。 用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。待冷却凝固后置冰箱内备
用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。 3.2 乳糖蛋白胨培养基 3.2.1 成份 A 蛋白胨10g B 牛肉膏3g C 乳糖5g D 氯化钠5g E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL F 蒸馏水1000mL 3.2.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4 仪器 4.1 滤器。 4.2 滤膜，孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。 4.3 抽滤设备。 4.4 无齿镊子。 4.5 培养箱: 36±1℃。 4.6 冰箱: 0~4℃。 4.7 天平。 4.8 显微镜。 4.9 平皿: 直径为9cm。 4.10 灭菌刻度吸管: 1mL,10mL。 5 检验步骤 5.1 准备工作 5.1.1 滤膜灭菌: 将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
膜过滤原理： 膜分离技术是利用具有选择透过能力的薄膜做分离介质，膜壁密布微孔，原液在一定压力下通过膜的一侧，溶剂及小分子溶质透过膜壁为透过液，而较大分子溶质被膜截留，从而达到物质分离及浓缩的目的。膜分离过程为动态错流过程，大分子溶质被膜壁阻隔，随浓缩液流出膜组件，膜不易被堵塞，可连续长期使用。过滤过程可在常温、低压下运行，无相态变化，高效节能。 膜孔经分类： 膜组件的使用及维护： 1、使用条件 ： 1、系统最高跨膜压力不超过0.2MPa，长期工作压力小于0.1MPa。 2、最高进液温度不能超过45℃，长期运行温度10～40 ℃。 3、膜组件应避免接触强酸、强碱，短时间清洗碱浓度应小于0.5%，长期运行pH 应在2～12, 3～10范围之内（具体见膜产品资讯）。 4、允许进料液内含颗粒粒径小于5μm。 膜组件清洗： 由于膜适用范围广泛，处理介质复杂。在处理料液过程中，膜表面会存在不同程度的污染。清洗周期越短，膜性能恢复越好，使用寿命越长。清洗进行方法
与正常超滤过程相同，清洗液自原液入口处进入，浓缩液及滤出液全部返回清洗液容器，循环后排放，以净水洗净即可。清洗方式主要分为物理清洗和化学清洗。 物理清洗：一般每批料液处理完后，用清水将膜组件内残余料液清洗干净，用清水以一定流速通过纤维内、外表面，将污染物洗出，时间约20～30分钟。 化学清洗：可用稀酸、稀碱或其他清洗剂进行化学清洗。在许多情况下，用稀碱液清洗膜较为有效。用0.5～1% 的氢氧化钠水溶液在膜系统内循环，浸泡20～60分钟，可取得较好的清洗效果。如果处理液中含有蛋白质，则可用0.5～ 1%碱性蛋白酶、胃蛋白酶进行浸泡清洗。 （注意：常用的化学药品的选择必须根据膜材料的性质选择，如酸类、碱类、氧化剂、杀菌剂、加酶洗涤剂等。）
职业教育环境监测与治理技术专业教学资源库 《环境监测》练习题 1 《粪大肠菌群的测定》练习题 备注：每题后面的简单、一般、困难是指题目的难易程度。 一、选择题 1.EC 培养液的配比是：胰胨20g ，乳糖5g ，氯化钠5g ，磷酸二氢钾1.5g ，胆盐三号1.5g ，磷酸氢二钾4g ，溶解于1000mL 蒸馏水中。在( C )℃灭菌15min ，灭菌后pH 为6.9。（一般） A 、37 B 、115 C 、121 D 、165 2.检测粪大肠菌群时作发酵试验用的培养基，是由蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠等配制而成的，调节pH 为( B )，应在115℃灭菌20min 。（一般） A 、5.2-5.4 B 、7.2-7.4 C 、9.2-9.4 D 、12.2-12.4 二、判断题 1.粪大肠菌群是总大肠菌群一部分，用粪大肠菌群作为卫生学指标比用总大肠菌群更有代表性。目前，粪大肠菌群被认为是受粪便污染的最实用的指示菌。（√）（一般） 2.为了区别存在于自然环境中的大肠菌群和存在于温血动物肠道内的大肠菌群,可将培养温度提高到44℃，在此种条件下仍能生长并使发酵乳糖产酸产气，则称为粪大肠菌群。（√）（一般） 3.进行复发酵试验时，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44±0.5℃水浴下培养24±2h 。培养后观察发酵管产气表明确信试验阴性。（×）（困难） 三、问答题 1.简述粪大肠菌群指标的含义及常用测定方法。（一般） 答案：（1）粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便，在44.5℃温度下能生长并发酵乳酸产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。（2）粪大肠菌群指标常用的测定方法为多管发酵法，它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
一．填空题 1.总大肠菌群多管发酵法测定的步骤分为____________、_____________和______________。 2.粪大肠菌群多管发酵法的初发酵试验，是将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，在____℃培养____h，产酸产气则为阳性。 二、判断题 1.总大肠菌群测定时，如果不能实现常规的检验步骤，例如水样运输途中不能保证所要求的温度，或采样后不能在允许的时间内进行检验等，都可采用延迟培养法。（） 2.对受污染严重的水体样品，如果在初发酵中未发现产气，则应将其培养到48h，然后再进一步证实有无大肠菌类细菌。( ) 3．如果粪大肠菌群测定的接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液10m1，如接种量为1m1，则接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10m1中。( ) 4．粪大肠菌群多管发酵法的复发酵试验，是将培养物转接到EC培养液中，在35℃下培养24h。( ) 5．水中总大肠菌群和粪大肠杆菌的快速测定法，适用于医院污水、生活污水、垃圾渗滤液以及其他行业(如餐饮业、食品加工等)排入地表水中的污水。( ) 三、选择题 1．我国目前以为总大肠菌群的报告单位，MPN值再乘即为该体积水样中的总大肠菌群数。( ) A． 100m1， 10 B． 1 L， 1 C， 1 L， 10 四．简答题 1.简述多管发酵法测定水源水中总大肠菌群的初发酵操作步骤。 2.如果总大肠菌群和粪大肠菌群测定水样接种量不是10ml、1m1和0.1ml而是较低或较高三个浓度的水样，应如何计算总大肠菌群数或粪大肠菌群数?试写出计算公式。
答案 一．1.初发酵试验 平板分离 复发酵试验 2. 37 24 二．1.正确 2.正确 3.错误 4.错误 5.正确 三.1.C 四. 1.答案：(1)将水样做1∶10稀释。(2)在各装有5m1三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入10ml 水样；在各装有10m1乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入1ml 水样；在各装有10m1乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入1m1 1∶10的稀释的水样。(3)将各管充分混匀，置37℃恒温箱培养24h 。 2.答案：如果接种的水样量不是10m1、1m1和0.1m1，而是较低或较高的三个浓度的水样，可先查MPN 表求出MPN 指数，再经过下面的公式换算成每100m1的MPN 值。MPN 值乘以10，即为1L 水样中的总大肠菌群数(或粪大肠菌群数)。 ()()ml ml MPN MPN 接种量最大的一管 指数值10?=
BS ISO 4832:2006食品和动物饲料的微生物学大肠菌群计数水 平法--菌落计数技术 序 ISO是国际标准的全球性组织。准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。每一个团体成员负责各自的学科。与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。 国际性标准的起草原则在《ISO/IEC 细则》第三部分中有给出。 起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。国际性标准ISO 4831 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）起草的。 这个第三版的ISO 4832取代了ISO 4832:1991和ISO 5541-1:1986。主要的修改内容如下： ——在35℃下培养这个可选择的程序已被删除（见4.2）； ——引入使用亮绿乳糖胆汁培养基做确证实验（见5.4和9.4）。 考虑到本标准的上一个版本已被修改，已确认ISO 4832:1991的选择性方法不受影响。 绪论 由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。否则，要尽可能地完全遵循本标准。 当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。 同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。 本标准在技术上的描述没有ISO 4831那样精确，但大部分的微生物检测能根据本标准开展，每克或每毫升样品中含大数量的大肠菌群可使用本标准。此外，
微孔过滤膜有：混合纤维素滤膜（CA-CN）、格栅膜、硝酸纤维素（CN）、醋酸纤维素（CA）、尼龙（JN）等滤膜，其孔径范围在0.15-5.0微米之间，是精细过滤工序中的必备产品。 一、微孔过滤膜主要特点： 1、亲水性好、适用于PH3-10的液体过滤； 2、孔隙率高：70-80%，孔径分布均匀； 3、薄膜厚度：100-160μm； 4、滤速快、吸附少、无介质脱落； 5、外观呈白色，平整、光滑、无针孔。 二、不同材料微孔滤膜性能和应用一览表 材质符号主要性能应用 混合纤维素CA-CN ①孔隙率高，截留效果好 ②不耐有机溶液和强酸、 强碱溶液 ③性价比高。 ①实验室、小生产工艺中除菌、除微粒的过 滤 ②水体中大肠肝菌群的测定； ③2微米和5微米的滤膜还用于油料过滤。 格栅膜G/CA-CN 是在超净混纤膜上印上网格，以 方便对截留物计数，用于微粒、 细菌的检测，作为培养基组成份， 均匀准确，是实验室、质检部门 进行微生物检测的理想产品。 ①水体中大肠肝菌群的测定； ②医用工业中微生物的检测。 硝酸纤维素CN 对蛋白等生物大分子吸附力强①医学研究及诊断的细菌培养和生物工程 ②DNA-RNA杂交实验和检定； ③做液闪测定、放射性示踪物的超净制备 ④电泳、微量元素分析等。 醋酸纤维素CA 对蛋白吸附比较低； ①适用于低分子醇类、油脂类溶液的过滤 ②科研中特殊成分的分析测定 尼龙JN 耐碱性和有机溶液 聚醚砜PES 通量大、对蛋白吸附力较低
聚偏二氟乙 烯PVDF ①是疏水性膜，不吸潮，易恒重 ②能反复热压消毒，性能不变③ 质地薄、流速快④耐化学腐蚀、 耐氧化⑤酒精处理后变为亲水 膜。 ①醇、酸、烷烃、芳香烃、卤代烃等溶剂除 去微粒，提高试剂级别②空气中悬浮微粒的 净化和发酵工业中空气除菌，③油类中不溶 物的净化和固体微粒的重量分析④非特异 性蛋白的分离和提纯⑤水溶液的浓缩，化学 物质的分离和回收。 聚四氟乙烯PTFE 耐酸、碱性强聚丙烯PP 深层过滤 玻璃纤维膜BF 流速快、耐高温①空气污染监测； ②生物大分子沉淀物的过滤； ③滤膜前预过滤。 三、产品规格： 过滤精度（μm）：0.15、0.22、0.45、0.65、0.8、1.2、2.0、5.0 四、使用方法： 1、清洗：使用前用蒸馏水清洗滤膜，然后在70-80℃蒸馏水中浸泡4小时，或在常温蒸馏水中浸泡12小时； 2、消毒：（本滤膜在出厂前未经消毒，因此使用前需作灭菌处理） 将清洗后的滤膜放入滤器中一起进行蒸汽热压灭菌处理120℃三十分钟，也可采用其它灭菌方法处理。 3、过滤液体时滤膜必须处于湿润状态，否则将影响过滤速度。 若因灭菌处理使滤膜呈干燥状态，需用无菌水润湿后使用。 五、运输与保存： ☆纤维素滤膜为易然品，在运输和贮存时要远离火源； ☆微孔滤膜必须在常温和相对湿度60%条件下避光保存， 若因干燥导致滤膜失水卷曲，则只须浸泡处理后即可使用。
粪大肠菌群的测定 1、半个月前配好初、复发酵所需培养液 2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口 3、操作 （1） 培养液 初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 10 g 牛肉浸膏 3 g 乳糖 5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000ml 调节PH 为7.2—7.4（NaOH ） 6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。 单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。 双月10个地表水，2个创业。共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。 创业的水一个月采两次水样 复发酵 EC 培养液 胰胨 20 g 乳糖 5 g 胆盐三号 1.5 g 磷酸氢二钾 4 g 磷酸二氢钾 1.5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000ml 充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。 三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml
（2）做样 初发酵： 地表水15根管为一个水样。5根为一组。第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。 （10、1、0.1的取样量） 创业，每个水样15根单倍。同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、 0.001ml。 将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。 观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。 复发酵： 呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。将阳性的试管中溶液接种（接种环）到EC培养液中，放在45℃±0.5℃的水浴锅中培养24h±2h。水浴锅液面应高于管中液面。 观察：产气（有气泡）则证实为阳性。记录阳性试管数，查表可得MPN值。 结果表示单位为：个/L
水中总大肠菌群的测定复习试题 （多管发酵法） 一、填空题 1.总大肠菌群主要包括有_________________________ 、_________________________ 、肠杆菌属、_____________________________ 等菌属的细菌。 答：埃希氏菌属；柠檬酸杆菌属；克雷伯氏菌属。 2.总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于 ____________________ ，操作 ， 需要时间______________ 。 答：各种水样；较繁；较长。 3.配制乳糖蛋白胨培养液时，将 _____________ 、__________________ 、____________ 、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH值为 _________________ ，再加入 _______________ 溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在_________ 答：蛋白胨；牛肉浸膏；乳糖；7.2?7.4 ；115；20；暗处。 4.平板分离：经初发酵试验培养h 后，发酵试管颜色变黄为_______________ ，小玻璃倒管内有__________ 为产气。 答：24；产酸；气泡。 5.配制伊红美蓝贮备培养基：先将 _______________ 加至900ml蒸馏水中，加热融化，然后加入_______________________ 及 _______________ ，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH值为__________________ 。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入_______________ ，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中，在____________ C灭菌min ，贮存 于___________ 备用。 答：琼脂；磷酸氢二钾；蛋白胨；7.2?7.4 ；115；20；冷暗处。 二、选择题 1.下列物质中________ 不是配制品红亚硫酸钠培养基所需要的。 A、蛋白胨；B琼脂；C溴甲酚紫乙醇溶液；D磷酸二氢钾 答：C 2.测定水源水中总大肠菌群时，将水样作 _________ 稀释。