滤膜法测定总大肠菌群
1 主题内容与适用范围
本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。
本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。
2 方法提要
用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。
3 培养基与试剂
3.1 品红亚硫酸钠培养基
3.1.1 成份
A 蛋白胨10g
B 酵母浸膏5g
C 牛肉膏5g
D 乳糖10g
E 琼脂15~20g
F 硫酸氢二钾3.5g
G 无水亚硫酸钠5g左右
H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL
I 蒸馏水1000mL
3.1.2 储存培养基的制备
先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
3.1.3 平皿培养基的配制
将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。待冷却凝固后置冰箱内备
用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。
3.2 乳糖蛋白胨培养基
3.2.1 成份
A 蛋白胨10g
B 牛肉膏3g
C 乳糖5g
D 氯化钠5g
E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL
F 蒸馏水1000mL
3.2.2 制法
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
4 仪器
4.1 滤器。
4.2 滤膜，孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。
4.3 抽滤设备。
4.4 无齿镊子。
4.5 培养箱: 36±1℃。
4.6 冰箱: 0~4℃。
4.7 天平。
4.8 显微镜。
4.9 平皿: 直径为9cm。
4.10 灭菌刻度吸管: 1mL,10mL。
5 检验步骤
5.1 准备工作
5.1.1 滤膜灭菌:
将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
5.1.2 滤器灭菌: 用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用121℃高压灭菌20min。
5.2 过滤水样
用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已灭菌的滤床上、，固定好滤器，将100mL水浴(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤。
5.3 培养
水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基(36.1.3.1)上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养22~24h。
6 观察结果
6.1 挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。
紫红色，具有金属光泽的菌落。
深红色，不带或略带金属光泽的菌落。
淡红色，中心色较深的菌落。
6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。
6.1.2 计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100mL 水样中的总大肠菌群数报告之(CFU/100mL)
总大肠菌群菌落数(CFU/100mL)＝───────────────────────………(36－1)
粪大肠菌群测定复习试题 一、填空题 1.地表水环境质量标准(GHZB1—1999)中，对环境质量卫生指标粪大肠菌群项目作出明确规定：Ⅰ类水质标准值为；Ⅱ类水质标准值为；Ⅲ类水质标准值为；Ⅳ类水质标准值为，Ⅴ类水质标准值为。 答：≤200个/L；≤1000个/L；≤2000个/L；≤5000个/L；≤10000个/L。 2.粪大肠菌群是一部分，用粪大肠菌群作为卫生学指标比用 更有。目前，粪大肠菌群被认为是受粪便污染的最实用的。 答：总大肠菌群；总大肠菌群；代表性；指示菌。 3.检测粪大肠菌群时作发酵试验用的培养基，是由、、 、等配制而成的，调节pH为，应在 灭菌。 答：蛋白胨；牛肉浸膏；乳糖；氯化钠；7.2-7.4；115℃；20min。 4.农田灌溉水质标准(GB5084—92)中，根据农作物的需求状况，将灌溉水质按灌溉作物分为三类：水作、旱作和蔬菜。其生物指标粪大肠菌群标准值定为 。 答：≤10000个/L。 5.为了区别存在于中的大肠菌群和存在于的大肠菌群,可将培养_ __ _____，在此种条件下仍能_____ 并使____________ _，则称为粪大肠菌群。 答：自然环境；温血动物肠道内；温度提高到44℃；生长；发酵乳糖产酸产气。 6.进行复发酵试验时，用3mm 或灭菌棒将转接到 培养液中。在培养。培养后观察发酵管 表明确信。
答：接种环；培养物；EC；44±0.5℃水浴下，24±2h；产气；试验阳性。 7.在污水综合排放标准(GB8978—1996)中，把医院、兽医院及医疗机构含病原体污水的粪大肠菌群分为三级标准：一级标准值；二级标准值；三级标准值。而传染病、结核病医院污水的粪大肠菌群三级标准值分别为：、、。 答：500个/L；1000个/L；5000个/L；100个/L；500个/L；1000个/L。8.EC培养液的配比是：胰胨，乳糖，氯化钠，磷酸二氢钾，胆盐三号，磷酸氢二钾，溶解于蒸馏水中。在 15min，灭菌后应为。 答：20g；5g；5g；1.5g；1.5g；4g；1000mL；121℃灭菌；pH；6.9。 二、问答题 1.粪大肠菌群的涵义是什么？ 答：指一群需氧及兼性厌氧在44.5℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.控制粪大肠菌群指标值的意义是什么？ 答：为了人体健康卫生的要求。 3.粪大肠菌群测定有几种方法？通常用哪种方法？ 答：有三种：多管发酵法、滤膜法、延迟培养法。用多管发酵法。 4.简诉测定粪大肠菌群多管发酵法的操作步骤？ 答：测定分二个步骤进行：量取若干经稀释的水样，接种乳糖蛋白胨培养液，进行初发酵试验：在37±0.5℃下培养24±2h，产酸和产气的发酵管表明试验阳性，再将表明试验阳性的发酵管中的培养物转接到EC培养液中，进行复发酵试验，在44±0.5℃水浴下培养24±2h，发酵管产气表明确信试验阳性。 5.在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml。 6.什么叫兼性厌氧细菌？ 答：氧存在或不存在的条件下均能繁殖的细菌。
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定 1 范围 本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。 2 定义 粪大肠菌群 fecal coliforms 系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。 3 设备和材料（内容略） 4 培养基和试剂 培养基：遵照附录A的规定。 革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。 5 检验步骤 样品稀释 在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。 用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。 乳糖发酵试验 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。 分离培养 从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。 证实试验 从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。 结果 证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。 附录 A （规范性附录） 培养基 乳糖胆盐发酵培养基 蛋白胨g 猪胆盐g 乳糖g %溴甲酚紫水溶液m L 蒸馏水1000m L
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。证
粪大肠菌群的测定 1 卫生学意义 粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标。 2 检验方法 2.1 术语与定义 一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。 2.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱：36℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：46℃±1℃。 （4）天平：感量0.1g。 （5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 （6）无菌锥形瓶：容量500mL。 （7）无菌培养皿：直径90mm。 （8）pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 2.3 培养基和试剂 （1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g；氯化钠：5.0g；乳糖：5.0g；磷酸氢 二钾（K 2HPO 4 ）：2.75g；磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）：2.75g；月桂基硫酸钠：0.1g； 蒸馏水：1000mL；pH：6.8±0.2 2）制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。 （2）EC肉汤（E.coli，BGLB）： 1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g；3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖： 5.0g；磷酸氢二钾（K 2HPO 4 ）：4.0g；磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）：1.5g；氯化钠：5.0g；
滤膜法-粪大肠菌群的测定 1、适用范围 本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。 2、原理 滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。 3仪器： 滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹 3、培养基和试剂 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。 M-FC培养基： 胰胨10g 蛋白胨5g 酵母浸膏 3.0g 氯化钠 5.0g 乳糖12.5g
胆盐三号 1.5g 1%苯胺蓝水溶10ml 1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml 蒸馏水1000ml 制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。加热溶解前，加入1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。 4、步骤 水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。 滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。 过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。培养：使用M-FC培养基。培养基含或不含琼脂，不含琼脂的培养基使已用M-FC 培养基饱和的无菌吸收垫。将滤过水样的滤膜置于琼脂或吸收垫表面。将培养皿紧密盖好后，置于能准确恒温于44.5℃±0.5℃的恒温培养箱或恒温水浴中，经
肥料中粪大肠菌群的测定 一：前期准备 一次性帽子、口罩、脚套 1， 移液管10ml 量筒100ml ｝ 玻璃珠 三角瓶 培养皿 2， 乳糖胆盐发酵培养基（用于乳糖发酵） 乳糖发酵培养基（用于复发酵） 伊红美蓝培养基（用于分离培养） } 121℃，15min 无菌水 } 121℃，15min 二：实验过程 无菌条件下进行： 10.0g 固体样品/10ml 液体样品 ↓ 三角瓶（带玻璃珠，90ml 无菌水）1:10=10-1 ↓ 200r/min 振荡30min ↓ 吸取10-1—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:100=10-2 ↓ 吸取吸取10-2—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:1000=10-3 ↓ ……依次稀释得到10-4，10-5等浓度稀释液（每个稀释度必须更换无菌移液管） ↓ 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取1.0ml 加入到乳糖胆盐发酵管内（装有乳糖胆盐发酵培 养基）（每一稀释度接种3支发酵管） ↓ 培养箱45℃，24h ↓ 结果：产酸，颜色变；产气，导管有气泡 不产酸，不产气，为粪大肠菌群阴性 ↓ 分离培养：从产酸产气或只产酸的发酵管中挑取发酵液在伊红美蓝培养基平板上划线 ↓ 培养箱36℃，18-24h ↓ 证实实验：从平板上挑取可以菌落，进行革兰氏染色。 结果：染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性 ↓ 革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中（装有乳糖发酵培养基） ↓ 培养箱44.5℃，24h ↓ 结果，不产气为粪大肠菌群阴性，产气为粪大肠菌群阳性 ↓ 证实为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN 检索表，得出每克（毫 升）肥料样品中的粪大肠菌群数 ｝160℃，4h ｝115℃，15min
实验九水中总大肠菌群的测定—多管发酵法一．实验目的和要求 1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术。 2．预习第六章细菌学检验法的关内容。 二．原理 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。 三．仪器 (1)高压蒸气灭菌器。 (2)恒温培养箱、冰箱。 (3)生物显微镜、载玻片。 (4)酒精灯、镍铬丝接种棒。 (5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶。 四．培养基及染色剂的制备 1．乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。 2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。 3．品红亚硫酸钠培养基： ①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀，定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于冷暗处备用。 ②平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 4．伊红美培养基： ①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解。再家人2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。
总大肠菌群 在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 一多管发酵法 1应用范围 1.1本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。 1.2水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。 2原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性， 产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。 3仪器 3.1显微镜 3.2革兰氏染色用有关器材。 3.3高压蒸汽灭菌器。 3.4干热灭菌箱。 3.5恒温箱。
3.6冰箱。 3.7放大镜。 3.8试管、平皿（直径 4培养基 4.1乳糖蛋白胨培养液 4.1.1成分 蛋白胨10g 牛肉膏3g 乳糖5g 氯化钠5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 蒸馏水1000ml 4.1.2制法 将蛋白胨、牛肉膏、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液， 灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。4.3品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）4.3.1成分 蛋白胨10g
乳糖10g 磷酸氢二钾3.5g 琼脂15~30g 蒸馏水1000ml 无水亚硫酸钠5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 4.3.2储备培养基的制备如革兰氏阴性无芽胞杆菌， 9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中 1ml 1000ml蒸馏水中加热溶解， 充分混匀，分装于装有倒管的试管中，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸160℃灭菌2h 调整pH为7.2~7.4，再加入1ml置高压蒸汽灭菌器中，以115℃乳糖及氯化钠置于 20ml 先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.3.3平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。
职业教育环境监测与治理技术专业教学资源库 《环境监测》练习题 1 《粪大肠菌群的测定》练习题 备注：每题后面的简单、一般、困难是指题目的难易程度。 一、选择题 1.EC 培养液的配比是：胰胨20g ，乳糖5g ，氯化钠5g ，磷酸二氢钾1.5g ，胆盐三号1.5g ，磷酸氢二钾4g ，溶解于1000mL 蒸馏水中。在( C )℃灭菌15min ，灭菌后pH 为6.9。（一般） A 、37 B 、115 C 、121 D 、165 2.检测粪大肠菌群时作发酵试验用的培养基，是由蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠等配制而成的，调节pH 为( B )，应在115℃灭菌20min 。（一般） A 、5.2-5.4 B 、7.2-7.4 C 、9.2-9.4 D 、12.2-12.4 二、判断题 1.粪大肠菌群是总大肠菌群一部分，用粪大肠菌群作为卫生学指标比用总大肠菌群更有代表性。目前，粪大肠菌群被认为是受粪便污染的最实用的指示菌。（√）（一般） 2.为了区别存在于自然环境中的大肠菌群和存在于温血动物肠道内的大肠菌群,可将培养温度提高到44℃，在此种条件下仍能生长并使发酵乳糖产酸产气，则称为粪大肠菌群。（√）（一般） 3.进行复发酵试验时，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44±0.5℃水浴下培养24±2h 。培养后观察发酵管产气表明确信试验阴性。（×）（困难） 三、问答题 1.简述粪大肠菌群指标的含义及常用测定方法。（一般） 答案：（1）粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便，在44.5℃温度下能生长并发酵乳酸产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。（2）粪大肠菌群指标常用的测定方法为多管发酵法，它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
BS ISO 4832:2006食品和动物饲料的微生物学大肠菌群计数水 平法--菌落计数技术 序 ISO是国际标准的全球性组织。准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。每一个团体成员负责各自的学科。与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。 国际性标准的起草原则在《ISO/IEC 细则》第三部分中有给出。 起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。国际性标准ISO 4831 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）起草的。 这个第三版的ISO 4832取代了ISO 4832:1991和ISO 5541-1:1986。主要的修改内容如下： ——在35℃下培养这个可选择的程序已被删除（见4.2）； ——引入使用亮绿乳糖胆汁培养基做确证实验（见5.4和9.4）。 考虑到本标准的上一个版本已被修改，已确认ISO 4832:1991的选择性方法不受影响。 绪论 由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。否则，要尽可能地完全遵循本标准。 当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。 同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。 本标准在技术上的描述没有ISO 4831那样精确，但大部分的微生物检测能根据本标准开展，每克或每毫升样品中含大数量的大肠菌群可使用本标准。此外，
总大肠菌群检验的实验设计 一、实验目的 1、了解总大肠菌群的数量指标在环境领域的重要性，学会总大肠菌群的检验方法。 2、通过检验过程，了解大肠菌群的生化特性。 3、掌握根据国标设计实验的方法。 二、实验原理 人的肠道中主要存在3大类细菌：大肠菌群；肠球菌；产气夹馍杆菌。由于大肠菌群的数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，故被定为检验肠道致病菌的指示菌。 我国《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）中微生物指标由2项增至6项，增加了大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群等指标。修订了总大肠菌群的指标：饮用水中总大肠菌群【MPN/(100mL)或CFU/（100mL）】不得检出；大肠埃希氏菌【MPN/(100mL)或CFU/（100mL）】不得检出；耐热大肠菌群【MPN/(100mL)或CFU/（100mL）】不得检出，菌落总数(CFU/mL)的限值为100（见附表）。 总大肠菌群的检测方法主要有多管发酵和滤膜法。前者被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种到乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后，在检索表中查出大肠菌群的近似值。后者是一种快速的替代方法，能测定大体积的水样，但只局限于饮用水或较洁净的水。本实验采取多管发酵法。 三、实验器材 1、器皿：显微镜、锥形瓶（500ml）、发酵试管(18×180mm)10支、发酵锥形瓶（100ml）2只、移液管10ml一支、量筒（100ml）一支、培养皿（Φ90mm）10套、接种环、试管架。 2、试剂、材料：革兰氏染色液、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基、伊红美蓝培养基、乳糖蛋白胨培养基。 四、实验步骤 1、采样：用事先灭好菌的500mL锥形瓶取宿舍饮用水400mL，先让出水口流一
粪大肠菌群的测定 1、半个月前配好初、复发酵所需培养液 2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口 3、操作 （1） 培养液 初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 10 g 牛肉浸膏 3 g 乳糖 5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000ml 调节PH 为7.2—7.4（NaOH ） 6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。 单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。 双月10个地表水，2个创业。共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。 创业的水一个月采两次水样 复发酵 EC 培养液 胰胨 20 g 乳糖 5 g 胆盐三号 1.5 g 磷酸氢二钾 4 g 磷酸二氢钾 1.5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000ml 充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。 三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml
（2）做样 初发酵： 地表水15根管为一个水样。5根为一组。第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。 （10、1、0.1的取样量） 创业，每个水样15根单倍。同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、 0.001ml。 将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。 观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。 复发酵： 呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。将阳性的试管中溶液接种（接种环）到EC培养液中，放在45℃±0.5℃的水浴锅中培养24h±2h。水浴锅液面应高于管中液面。 观察：产气（有气泡）则证实为阳性。记录阳性试管数，查表可得MPN值。 结果表示单位为：个/L
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 食品商务网 2005-12-14 12:00:00.0 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 SN 0169-92 代替 ZB X09 002一88 Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export 1 主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2 设备和材料 2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。 2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。 2.3 培养箱：36±1℃,44.5±0.5℃。 2.4 冰箱: 0~5℃和-15~-20℃。 2.5 均质器。 2.6 乳钵和研棒。 2.7 平皿：直径90mm。 2.8 天平：感量0.1g。 2.9 显微镜。 2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11 玻璃珠：直径约5mm。 2.12 菌落计数器。 3 培养基及试剂 3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。 3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3 EC 肉汤。 3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5 营养琼脂斜面。 3.6 色氨酸肉汤。 3.7 MR-VP培养基。 3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11 生理盐水。 3.12 革兰氏染色液。 3.13 Kovacs氏靛基质试剂。 3.14 甲基红指示剂。 3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。 4 样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不
大肠菌群检测方法 进入无菌室步骤 1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。 2．关灯后0?5小时后放可进入。 3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成） 2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。 3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml） 4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml） 5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液 7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml） 8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。） 10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中） 11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 －2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成 －3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样 12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面） 13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。 14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准） 15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
滤膜法测定总大肠菌群 1 主题内容与适用范围 本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。 本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。 2 方法提要 用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。 3 培养基与试剂 3.1 品红亚硫酸钠培养基 3.1.1 成份 A 蛋白胨10g B 酵母浸膏5g C 牛肉膏5g D 乳糖10g E 琼脂15~20g F 硫酸氢二钾3.5g G 无水亚硫酸钠5g左右 H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL I 蒸馏水1000mL 3.1.2 储存培养基的制备 先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。 3.1.3 平皿培养基的配制 将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。 用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。待冷却凝固后置冰箱内备
用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。 3.2 乳糖蛋白胨培养基 3.2.1 成份 A 蛋白胨10g B 牛肉膏3g C 乳糖5g D 氯化钠5g E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL F 蒸馏水1000mL 3.2.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4 仪器 4.1 滤器。 4.2 滤膜，孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。 4.3 抽滤设备。 4.4 无齿镊子。 4.5 培养箱: 36±1℃。 4.6 冰箱: 0~4℃。 4.7 天平。 4.8 显微镜。 4.9 平皿: 直径为9cm。 4.10 灭菌刻度吸管: 1mL,10mL。 5 检验步骤 5.1 准备工作 5.1.1 滤膜灭菌: 将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确
肥料中粪大肠菌群的测定 一：前期准备一次性帽子、口罩、脚套 1，移液管{10ml 量筒100ml｝160℃，4h 玻璃珠160℃，4h 三角瓶160℃，4h 培养皿160℃，4h 2，乳糖胆盐发酵培养基（用于乳糖发酵）115℃，15min 乳糖发酵培养基（用于复发酵）115℃，15min 伊红美蓝培养基（用于分离培养）121℃，15min 无菌水121℃，15min 二：实验过程无菌条件下进行： 10.0g固体样品/10ml液体样品 ↓ 三角瓶（带玻璃珠，90ml无菌水）1:10=10-1 ↓ 200r/min振荡30min ↓ 吸取10-1—5ml，加入45ml无菌水（提前准备）1:100=10-2 ↓ 吸取吸取10-2—5ml，加入45ml无菌水（提前准备）1:1000=10-3 ↓ ……依次稀释得到10-4，10-5等浓度稀释液（每个稀释度必须更换无菌移液管） ↓ 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取1.0ml加入到乳糖胆盐发酵管内（装有乳糖胆盐发酵培养基）（每一稀释度接种3支发酵管） ↓ 培养箱45℃，24h ↓ 不产酸，不产气，为粪大肠菌群阴性→实验终止→<3 结果：产酸，颜色变；产气，导管有气泡 ↓ 分离培养：从产酸产气或只产酸的发酵管中挑取发酵液在伊红美蓝培养基平板上划线 ↓ 培养箱36℃，18-24h ↓ 证实实验：无菌落→实验终止→<3 有菌落，进行革兰氏染色。 染色反应阳性者（紫色）→实验终止→<3 染色反应阴性者（红色）为粪大肠菌群阴性 ↓ 革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中（装有乳糖发酵培养基） ↓ 培养箱44.5℃，24h ↓ 结果，不产气为粪大肠菌群阴性→实验终止→<3 产气为粪大肠菌群阳性 ↓ 根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数
实验六食品中大肠菌群的测定 一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定
食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。 ①存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。 ⑧在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。 ⑧在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。 ④检验方法简便，易于检出和计数。 在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。 另外，作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50％以上，一般粪便中该菌量为109个／g —1010个／g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为，在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群链球菌对低温抵抗力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。 当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处： ①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。 ⑧大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。 ②在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。 3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义 粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。 许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主