用比浊法测定大肠杆菌的生长曲线
(一)实验目的
了解细菌生长曲线的持点及测定原理，学会用比浊法测定细菌的生长曲线。
(二)实验原理
将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一般分为延缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个时期，各时期的长短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。
比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度(即OD值)，用于表示该菌在本实验条件下的相对生长量。
实验设正常生长、加酸抑制和加富培养等三种处理，以了解细菌在不同生长条件下的生长情况。
（三）实验器材
(1)活材料：大肠杆菌(E.coli)。
(2)培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨液体培养基14支(每支10mL)，浓缩5 倍的牛肉膏蛋白胨培养基1支。无菌酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。
(3)器材：1mL无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、标签等。
（四）实验方法
方法(1)
1)接种：取13支装有牛肉膏蛋白胨培养液的试管，贴上标签(注明菌名、培养处理、培养时间、组号)。按无菌操作法用吸管向每管准确加入0.2mL的大肠杆菌培养液，接种后，轻轻摇荡，使菌体混匀。另一支不接种的培养管注明CK(对照)。
2)培养：将接种后的培养管置于摇床上，在37℃下振荡培养。其中9支培养管分别于培养的0、1．5、3、4、6、8、10、12和14h后取出，放冰箱中贮存，待测定。加酸处理。取出经4h培养的另二支培养管，按无菌操作法加入lmL无菌酸溶液，摇匀后放回摇床上，继续振荡培养，于培养8h和14h后取出放冰箱中贮存，待测定。加富营养物处理。余下的二支培养管于培养6h后取出，按无
菌操作法加入浓缩5倍的牛肉膏蛋白胨培养液1mL，摇匀后，继续进行振荡培养，于培养8h和14h后取出，放入冰箱中贮存，待测定。
3)比浊：将培养不同时间、形成不同细胞浓度的细菌培养液进行适当稀释，使光密度值在0.0-0.4范围内，以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基调零点，在光电比色计上，选用400-440nm波长的滤光片进行比浊，从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。
方法(2)
将大肠杆菌接入装有牛肉膏蛋白胨培养液的小试管中(试管要能插入放比色杯的比色槽内)。37℃下振荡培养，分别在0、1.5 、3、4、6、8、10、12和14h 取出，以未接种培养液调零点，在光电比色计上比色。比色时应自制一个暗盒将培养管和比色槽罩住，以形成一个暗室。
（五）绘制曲线
以细菌悬液的光密度值(OD)为纵坐标，培养时间为横坐标，给出大肠杆菌在正常生长、加酸处理和加富培养三种条件下的生长曲线。
如果我们将上述培养0，1.5，3，4，6，8，10，12，14h的细菌悬液用稀释平板测数法进行测数，测出不同时间的含菌数，以菌悬液比浊的光密度值为横坐标，以细菌的数量为纵坐标，绘制一标准曲线，这样在测得了任一培养时间的菌悬液光密度值后，就可以在此标淮曲线上查出含菌数。这种方法已在工业上广泛采用，它可以节省许多稀释平板测数的时间，直接用比浊法测得的光密度值查标准曲线以了解各个培养时期的菌数消长情况。
培养基名称：大肠菌群大肠杆菌显色培养基(ECC) 英文名称：Chromogenic Coliform&E.coli Agar 大肠菌群大肠杆菌显色培养基(ECC)用途：用于大肠菌群和大肠杆菌的快速检测和计数。 大肠菌群大肠杆菌显色培养基(ECC)使用原理： 蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;十二烷基硫酸钠抑制革兰氏阳性菌;混合显色底物分别与大肠菌群和大肠杆菌所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上大肠菌群产生橙红色的菌落，大肠杆菌产生蓝绿色的菌落。 大肠菌群大肠杆菌显色培养基(ECC)配方(每升)： 蛋白胨15.0g 酵母膏粉3.0g 氯化钠5.0g 十二烷基硫酸钠0.1g 琼脂12.0g 混合显色底物6.77g 最终pH7.0±0.2 大肠菌群大肠杆菌显色培养基(ECC)使用方法： 1、称取大肠菌群大肠杆菌显色培养基(ECC)41.9g，加入蒸馏水或去离子水1.0L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，115℃高压灭菌10min。 2、以无菌手续取样品25.0g或25.0mL，加入含225.0mL无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的三角瓶内，充分振摇或用均质器均质1min成1：10稀释液，然后以1：10继续稀释，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个平皿，倾注加热溶解并冷至45℃左右的培养基。 3、观察结果。 质量控制： 大肠菌群大肠杆菌显色培养基(ECC)倾注平皿后呈淡黄色，下列菌株接种后于36±1℃培养18～24h生长情况如下表。
菌名菌号生长状况培养特征 大肠埃希氏菌ATCC25922良好菌落蓝绿色 柠檬酸杆菌ATCC8090良好菌落橙红色 鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115良好菌落无色 粪肠球菌ATCC29212受抑制----- 贮存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。贮存期二年。规格：可配置1L的培养基干粉。
水中大肠杆菌群书的监测（发酵法） 一、试验目的： 1.了解和学习水中大肠杆菌的测定原理和测定意义。 2.学习和掌握水中大肠杆菌的监测方法。 二、试验原理： 水的微生物学的检验，特别是大肠杆菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水的标准规定饮用水中大肠杆菌群书每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。 水中大肠杆菌的检验方法，常用多管发酵发和滤膜法。多管发酵发可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅用于自来水和深井水。操作简洁快速，但不适用于杂质较多，易于阻塞滤孔的水样。 三、试验材料： 1.培养基：乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基 2.器材：灭菌三角瓶、无菌平皿、无菌吸管、无菌试管等。 四、试验内容 第一天： 1.水样的采集
自来水洗将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，在开放水龙头取水流5ｍｈ，以灭菌山角瓶接水取样以备分析。 2.用发酵法检查大肠杆菌 （1）生活饮用水的检验 ①初步发酵试验：在2个各装有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中，以无菌操作各自加水样10ｍｈ。摇匀后，37℃培养24ｈ 第二天： ②平板分离：经24ｈ培养后。特产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMD培养基上），37℃培养18～24ｈ。大肠杆菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。 第三天： ③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同一类型菌群1～3个，37℃培养24ｈ，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。 第四天： ④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管，查附录1或2，报告每升水样品中大肠菌群数（MPN）
同步荧光光谱法在环境分析中的应用 环境分析化学是分析化学的一个新分支。在某种意义上讲,环境科学的发展依赖于环境分析化学的发展。随着人们对环境问题 认识的深入,环保意识的增强,环境分析受到越来越多的重视,已有大量综述性章发表[3]。随着有机化工、石油化工、医药工业的发展,以及农药(杀虫剂、除草剂等) 的大量使用,有机化合物对环境的危害和污染日益严重。目前,有机污染物分析测试的重要对象包括,多环芳烃和有机氯等污染物;与空气污染有关的挥发性有机 物、胺类化合物;与水污染有关的表面活性剂;砷、汞、锡等金属 有机化合物[3]。环境有机物的分析手段很多,其中荧光分析法由 于灵敏度高和选择性较等优良性能而得到广泛的应用。 早在16 世纪人们就观察到了荧光现象。20世纪以来,特别是近几十年,荧光现象在理论和实际应用方面都取得了很大进展,并 建立了荧光分析方法[4]。荧光分析法是通过测量样品的荧光强度,用于定量测定许多无机物和有机物,而又具有灵敏度高、选择性强、试样量少和方法简单等特点的一种很有用的分析手段。正因 为如此,近年来催化荧光法、荧光淬灭法、同步荧光技术以及荧光技术与其他技术联用得以不断涌现和完善,引起了分析界广泛地兴趣和瞩目[4]。本主要就近年来同步荧光光谱法在环境有机污染物分析中的应用作一综述,重点是介绍国内的情况。
正常规的化学分析是在样品沉淀、分离、萃取之后通过重量分析、色层析、光分析、电分析等分析技术来完成的,通常需消耗大量的溶剂和时间,并且在取样和处理过程中产生大量污染物,分析成本高。荧光技术灵敏度高,但常规的荧光分析法在实际应用中往往受到限制,对一些复杂混合物分析常遇到光谱互相重叠、不易分辨的困难,需要预分离且操作繁琐。[1] 1971 年L loyd首先提出了用同步荧光光谱技术[2]。和常规荧光分析法相比, 同步荧光分析法具有谱图简化、选择性提高、 光散射干扰减少等特点, 并且不需要预分离、操作简便、节省分 析成本、缩短分析时间, 尤其适合对多组分混合物的分析[2]。该法近几年得到迅速发展和广泛的应用, 出现了许多的新技术, 如 导数恒能量同步荧光法、三维同步荧光法和可变角同步荧光法等[5]。该法已应用于多组分多环芳烃的定性定量分析,环境、药物 分析, 食品、蛋白质、氨基酸、石油产品分析等。 近年来,人们对环境污染物质的分析十分重视,由于环境样品 中微量有机物的系统测定要求尽可能地采用高灵敏度和高选择性 的分析法, 所以在分析方面有较大的困难[2]。同步荧光技术在痕量分析方面尤有前途。酚为环保检测项目之一, 但在普通的荧光 光谱中, 瑞利峰和拉曼峰对荧光峰有干扰,用同步荧光光谱通过筛选最佳波长差,消除了这些因素的干扰,对酚进行了定量测定,并用于大气中酚的测定[2]。杜娟等[6]用同步荧光分析法测定工业及
附件 水肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、 48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水 样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
Colitag大肠菌群和埃氏大肠杆 菌快速检测方法 主要内容 ?基本概念 ? Colitag方法特点 ?基本介绍 ?检测过程 |?第三方认可
基本介绍 ?总大肠茵群醉底物法 在选择性培养基上能产生半乳辖并酶的细菌群落，请细茵群落能分解色廉底物释放色廉体使培养基呈现颜色査化，以此技术来检测水中总大肠茁影的方法称为总大肠茵群髓底场法 ?埃氏大肠杆茵酶底物法 在选择性培养基上能产生半乳罄昔酶，分解色孫底物，释放出色原体，从而使培菲基颜色发生变化.同时，酸酶分解产生荧光物质，便苗落能够在紫外光照射下产生特征桂荧光，以此技术检测埃氏大肠杆苗的方法称为埃氏大肠杆繭酶底物法. Coli tag方法特点 ?可以检测到受损大肠苗群和埃氏大肠杆菌。其它方法检测这些受损酋时常会遗漏. ?操作过趕简单.检测准确度高，假阳柱和假阴性是目前最低的. ?检测时间短于传统方法.
基本介绍 ?检测时何：24小时 *羹国国家环保蜀等权嵐机构测试站匙：佩阴柱lb假朋性小于 ?检测At生勒种矣：可同时栓测大厢荀祥和埃氏大麟轩罠感同时隆测龔丸騰杆36和疑氏丸肠打歲 ] ＜楼测结杲更迟方式；可绘测有#无，也可检剧瑕可能鈿苗数（MPN〕 ?检测所需配舍谊备：可调恒涅培拓箱（蛋少可必控制.禎口拓振氏度 ^44.5+0.2 ）T专刑玖管（鈕果只检测山有喷T则不宵要此 确）* M6nm UV灯（用366 nm匸￥灯照射观蔡灵龙｝? ?方法权威性：其吗国事环保局认可的标准快速检测方法：中圍国曩标准中規定的*＜屣*T法；日本、韩国*法国和名西等国家的国素折准* 拥有Fi：j（l refiusviuidim^if 41 - 檢测下喂；MFI /10（hnl.液俸 检测过程1.取一包检测试剂，与100 mL被测液体混合；2.摇匀混合，充分溶解，若要定量则转移溶液至定量盘，在35摄氏度的环境下培养22-26小时。培养后的水样进行以下认定： A :如果水样呈黄色，说明有大肠菌群存在；B:如果用366 nm UV灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在。3.如果检测粪大肠菌，则先在35度环境下培养4小时后，改成44.5度培养20小时，进行以上第3项观测。A:如果水样呈黄色，说明有粪大肠菌存在；B:如果用366 nm UV 灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在 第三方认可（1）美国EPA认可：美国EPA目前已经认可10种用于检测大肠菌群和埃氏大肠杆菌的方法，其中Co litag是美国EPA认可的检测数据最好的 一种。Colitag通过美国国家环保局严格的检测程序，结果表明：colitag检测大肠 菌群和大肠杆菌的假阴性为0%，假阳性小于5%。这个结果首先是由美国国家环保局的生物学家以正式信函的形式通知CPI公司。后来这一结果在2002年3月的 《联邦登记》（Federal Registe）上发表，具体请见67卷45期第10538页（Page 10538, Vol. 67 N O. 45）。同时，美国国家环保局对另一方法的检测报告显示，该法检
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
食品微生物检验技术课程综述大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号：114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟
大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂
2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。 2.81mol/L 盐酸（HCI ) ：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。3检验程序 4.样品稀释
大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。1.2 冰箱:0～4℃。1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。1.4 天平。1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。1.7 平皿:直径为90mm。1.8 试管。1.9 吸管。1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。1.13 酒精灯。1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置 36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养 18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
附件水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果， 二、 三、 (一) (二) 四、 (一) (二) (三) (四) (五) (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。
(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 5.0g 2.75g 2.75g 配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。 ２、煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB） 1公升的BGLB 培养基中含有下列成份： 蛋白胨（Peptone）10.0g
附件 水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释 度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用范围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。
(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在 160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) p H计：精确度达 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在 25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 培养基，应使用市售商品化培养基。 １、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份：
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
检测过程 1. 取一包检测试剂，与 100 mL 被测液体混合； 2. 摇匀混合，充分溶解，若要定量则转移溶液至定量盘，在 35 摄氏度的环境下培养 22-26 小时。培养后的水样进行以下认定： A：如果水样呈黄色，说明有大肠菌群存在； B：如果用 366 nm UV灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在。 3. 如果检测粪大肠菌，则先在 35 度环境下培养 4 小时后，改成 44.5 度培养 20小时，进行以上第 3项观测。 A：如果水样呈黄色，说明有粪大肠菌存在； B：如果用 366 nm UV 灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在 第三方认可（1）美国 EPA认可：美国 EPA目前已经认可10种用于检测大肠菌群和埃氏大肠杆菌的方法，其中 Co litag 是美国 EPA 认可的检测数据最好的一种。 Colitag通过美国国家环保局严格的检测程序，结果表明：colitag检测大肠菌群和大肠杆菌的假阴性为0%，假阳性小于5%。这个结果首先是由美国国家环保局的生物学家以正式信函的形式通知CPI 公司。后来这一结果在2002年3月的《联邦登记》（Federal Register）上发表，具体请见67卷45期第10538页（Page 10538, Vol. 67 N O. 45）。同时，美国国家环保局对另一方法的检测报告显示，该
法检测大肠杆菌出现9%的假阴性，检测大肠菌群出现13%的假阳性，此结果发表于 1989 年 7 月 17 日的《联邦登记》（第 29998页，第二段，B部分第三行）和1992年6月10日的《联邦登记》（第 27475 页，第一列的第一整段）。（2）美国 Wisconsin 州卫生实验室验证：美国 Wisconsin 州卫生实验室通过大量不同实际样品对美国EPA认可的10种该类方法进行了检验，发现只有两种方法分析采样结果完全正确。Colitag是其中一种。
第52卷第2期 2006年4月 武汉大学学报(理学版) J.W uhan Univ.(N at.Sci.Ed.)V ol.52N o.2 A p r.2006,129～132 收稿日期:2005209222 通讯联系人 E 2mail :cai _lin @w https://www.doczj.com/doc/a313847079.html, 基金项目:国家自然科学基金资助项目(20275027);湖北省教育厅科学技术研究重点项目(D 200524005)作者简介:徐 靖(19662),女,博士生,郧阳医学院副教授,现从事动态分子光谱及动力学分析的研究. E 2mail :x uj ingw h @https://www.doczj.com/doc/a313847079.html, 文章编号:167128836(2006)022******* 水溶性CdT ePCdS 量子点荧光探针 同步荧光法测定D NA 徐 靖1,2,赵应声1,吴新国1,蔡汝秀1 (1.武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉430072;2.郧阳医学院公共与管理学院,湖北十堰442000) 摘 要:以巯基丙酸(HS —CH 2CH 2COO H )为稳定剂,水相合成了核壳型Cd TePCdS 量子点(QDs ).当固定波长差为240nm 时,Cd TePCdS 量子点的同步荧光最大发射位于338nm.基于DNA 对量子点荧光的猝灭效应,将 Cd TePCdS 量子点作为荧光探针建立了一种简便快速测定DNA 的同步荧光分析法.详细研究了p H 值、量子点浓 度、离子强度、温度等条件对量子点同步荧光及DNA 测定的影响.该方法测定ctDNA 的线性范围为50.0～750.0μg/L ,检出限为16μg/L ,9次重复测定500μg/L ctDNA 的相对标准偏差为2.0%.该方法用于合成样品的测定,结果满意. 关 键 词:Cd TePCdS ;核壳型量子点;DNA ;荧光探针;同步荧光中图分类号:O 657.32 文献标识码:A 近年来,半导体量子点(QDs )的研究引起了广 泛的关注[1～4].半导体量子点的激发光谱宽,呈连续分布,发射光谱对称且半峰宽窄,不同大小的半导体量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的荧光.这就使得在复杂体系中同时研究多种生物分子成为可能.与传统的有机荧光染料相比,半导体量子点还具有不易发生光漂白,荧光量子产率高及斯托克斯位移大等优点,因此可望作为荧光探针应用于生物体系中[2～5].水相合成的半导体量子点由于具有良好的亲水性和生物相容性,其合成及应用成为极具吸引力的研究新热点[6～8]. 核酸作为遗传信息的载体,一直是化学和生命科学中重要的研究领域.核酸的定量分析是核酸研究的基础.荧光分析法因其简便快速、灵敏度高,成为核酸分析的最重要手段之一[9,10].由于核酸无内源荧光,故其测定必须应用量子产率高的荧光探针.核酸分子的检测灵敏度主要取决于核酸探针的检测灵敏度.某些能与核酸发生某种嵌插作用的有机染料如二苯并咪唑、溴化乙啶及其二聚体[10]等常用作核酸荧光探针.但是有机荧光染料易于发生光漂白现象,而使其信号强度减弱,从而限制了在痕量核酸检测中的应用.本文以巯基丙酸(HS —C H 2C H 2 COO H )为稳定剂,水相合成了核壳型Cd TePCdS 量子点.核壳体系可以有效地钝化核微粒表面的非 辐射复合中心,减少核心半导体在导带的捕获态,从而显著提高荧光量子产率,增强光稳定性[11,12].由于在量子点的外面包覆了一层巯基丙酸,借助于其外端的羧基,能与生物分子的氨基相作用,从而达到直接与生物分子结合的目的[6,7].Cd TePCdS 量子点具有宽而连续的激发光谱和狭窄对称的发射光谱,最大发射波长位于578nm.当固定波长差为240nm 时,其同步荧光最大发射位于338nm.与荧光发射光谱相比,该量子点的同步荧光光谱的峰形更窄,更对称,荧光强度也更强,与DNA 作用后量子点的同步荧光强度显著降低.基于DNA 对量子点荧光的猝灭效应,将Cd TePCdS 量子点作为荧光探针建立了一种简便快速测定DNA 的等波长差同步荧光分析法,并对量子点与DNA 之间的结合方式进行了初步讨论. 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 小牛胸腺DNA (ctDNA )为华美公司产品,贮备
大肠杆菌的检测方法 一、大肠杆菌的生物学特性 大肠杆菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 二、培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。 在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株 三、大肠菌群及大肠杆菌测定——MPN法检验流程（FDA BAM）检样50g+450ml稀释液，适当十倍稀释样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL，如没有产气，则报告为阴性；如有产气，
则分别接种BGLB肉汤管（35 ±℃，48 ± 2h）和EC肉汤（44.5±0.5 ℃（水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h ），对于接种BGLB肉汤管的查MPN表报告结果，验证是否为大肠菌群；对于接种EC肉汤的产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气查MPN表报告结果验证是否为大肠杆菌。
第三章大肠菌群测定 一、大肠菌群检验 (一)检验方法 (二)培养基 (三)检验时应注意事 二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。 一、大肠茵群检验 (一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
大肠杆菌和大肠菌群计数方法 Enumeration of Escherichia coli and the coliform 章节内容： ?传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法 ?LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌 （除双壳类软体动物制品外） ?瓶装水检测方法 ?贝类和贝类肉制品检测方法 ?柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法 ?大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法 ?参考文件 大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich 发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。 大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。 1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。与已知的非产气致病菌容易区别开来。 因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂。于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。 虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5℃进行，其他所有食品都在45.5℃进行。粪大肠菌群包含绝大部执蟪Ω司? 克雷伯氏菌也作为粪大肠菌群,但克雷伯氏菌的检出被认为与粪便污染并无关系。因此,大肠杆菌又被作为一个重要指标。快速鉴定大肠杆菌的新方法采用，使检测大肠杆菌相对容易了。
大肠杆菌生长曲线的制备 一、实验目的 1 了解细菌生长曲线特点及测定原理； 2 学习用比浊法测定细菌的生长曲线。 二、基本原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。 三、器材 1菌种：大肠杆菌
2培养基：LB培养基（蛋白胨10g 酵母膏5g Nacl 10g pH7.0~7.2） 3仪器和器具：721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。 四、方法与步骤 1种子液制备 取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入LB培养基中，静止培养18h作种子培养液。 2标记编号 取11支无菌试管，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。 3接种培养 吸取2.5ml种子液加入装有60mlLB培养基的锥形瓶中，混匀。分别取5ml加入到11根试管，于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。 4生长量测定 将未接种的LB培养基倾倒入比色杯中，选用600nm 波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，
第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验 (一)检验方法 (二)培养基 (三)检验时应注意事 二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。 一、大肠茵群检验 (一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
大肠杆菌生长曲线的测定 一、基本原理 生长曲线是微生物在液体培养基中所表现出来的生长、繁殖的规律，不同的微生物表现为不同的生长曲线，而即使是同一种微生物在不同培养条件下，其生长曲线也不同。因此测定微生物的生长曲线对于了解，掌握微生物的生长规律是有帮助的。 由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。本实验是以活菌计数法与光电比浊法相对应来测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线，从而观察分析大肠杆菌在这些培养条件下的生长情况。 二、器材 培养了20小时的大肠杆菌悬液；肉汤蛋白胨培养基（液体、固体）；浓缩的肉汤蛋白胨液体培养基（浓缩5倍）；无菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸＝3：1：1）。 1毫升及5毫升无菌吸管；无菌试管；无菌生理盐水； 无菌平皿；血球计数器；显微镜；光电比色计；无菌离心管；离心机等。 三、操作步骤 1．将经20小时培养的大肠杆菌培养物，倒入无菌离心管内离心（3000r.p.m×10），以无菌生理盐水洗涤三次后，制成约9亿毫升的菌悬液（用显微镜直接计数法），作为种子。上述过程都必须注意严格无菌操作。 2．取盛有200毫升培养基经灭菌的三角瓶三瓶，分别标明A、B、C，按5%接种量，将上述种子接入，置37℃振荡培养。在B瓶培养了4小时后取出，加入10毫升无菌酸溶液，然后继续振荡培养。在C瓶培养了6小时后取出，加入10毫升无菌浓缩肉汤蛋白胨液，再继续振荡培养。 3．间隔一定时间，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20小时后，从A、B、C三角瓶中各取5毫升菌液放于无菌试管中，置冰浴。并作适当稀释，使菌悬液的光密度控制在0.0－0.4范围内，再置光电比色计中进行比浊测定（400－440毫微米波长），用未接种的肉汤蛋白胨液为空白对照。记下光密度值。 另外，A管在比浊测定以前，以无菌操作吸取0.1毫升菌液于肉汤蛋白胨琼脂平板上，用玻璃刮棒涂抹均匀后，置37℃培养30小时后计数。 4．按间隔时间全部测完了以后，以菌悬液光密度值（O.D.）为纵坐标，培养时间为横坐标再绘制一条A培养条件下的生长曲线。 四、思考题 1．比较A、B、C三组生长曲线有什么不同？说明原因，标出A组生长曲线的四个时期的位置及名称。 2．两条A生长曲线有什么不同？为什么？