表达载体pET
A.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I. F.部分)。如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL和pI启动子控制的T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。pET表达系统包括质粒和宿主菌。您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。
B.使用许可及协议
Novagen的T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有T7 RNA 聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。详情请垂询。
C. 系统组成
pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。
? 选定的pET载体DNA，10 µg
? 宿主菌BL21，BL21(DE3)以及BL21(DE3)pLysS甘油菌1, 2
? 诱导对照克隆，甘油储存物
系统加感受态细胞包括所有上述组分以及一套3种直接用于高效转化pET重组子的感受态宿主细胞。每种宿主菌感受态细胞足够用于10次转化：
? 0.2 ml分装NovaBlue，BL21(DE3)以及BL21(DE3)pLysS感受态细胞
? SOC培养基
? 对照质粒
1、pET多肽表达系统包括BLR和BLR(DE3)pLysS宿主菌而非BL21系列宿主菌。
2、pETTrx融合系统32 包括AD494系列以及BL21系列宿主菌。
单独提供的组分和相关产品：参见Novagen目录或Novagen网站(https://www.doczj.com/doc/9f5914541.html,)pET 载体系统和感受态细胞完全列表。
D.选择合适的pET载体
pET载体最初由Studier及其同事构建(Studier and Moffatt, 1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al., 1990)。Novagen开发的系列新pET载体则使目的蛋白的克隆、检测以及纯化更加容易。载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。
?转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG 起始密码子的目的基因。只有3种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。
?翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因。翻译载体的详细信息请参考pET载体特点一览表(第7页)。
翻译载体在命名上与转录载体不同，多一个字母后缀，例如pET-21a(+)，表示相对于BamH I克隆位点识别序列GGATCC的阅读框。所有带后缀a的载体从GGA三联密码子开始表达，带b的从GAT 开始，带c的从BamH I识别序列A TC三联密码子开始。带d后缀的载体阅读框和带c的一样，不同的是它们有一个上游Nco I克隆位点而非Nde I位点以便直接将目的基因克隆到AUG起始密码子。
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基本考虑因素
选择合适的pET载体通常要综合考虑很多因素。其中包括下列一些基本因素：
?目的蛋白的应用
?目的蛋白已知特定信息
?克隆策略
pET载体的应用多种多样。例如分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是，能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的组合以便找到最佳条件，是非常值得的。
任何有关目的蛋白的信息都有助于选择合适的载体。例如，有些蛋白表现活性要求一端或两端均无外源序列。大多数pET载体可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻译起始序列在E. col i 中不能被有效使用，表达水平也会受到一定的影响。在这种情况下，通常是构建一种带有高效表达的氨基末端序列的融合蛋白(参见pET载体特点总表，第7页，N端融合表达)，并在纯化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。不需连接反应的克隆(LIC)在这种情况中特别有用，可以通过肠激酶或Xa因子切去所有载体编码的氨基末端序列(参见pET载体特点总表，第7页)。
不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选择。许多pET载体具有同样的限制性酶切位点，用户可以仅准备一次目的插入片段，将其插入到多个载体中。不同的要求可以考虑采用不同的PCR克隆策略。LIC载体试剂盒是一种非常有用的产品，可以用来以PCR制备插入片段却避免了限制性酶切消化载体和插入序列的操作。
蛋白溶解性及细胞定位
一旦确定了用途和克隆策略，下一步就是判断目的蛋白在细胞中的定位和可溶性。许多后续应用要求目的蛋白以具有生物活性的可溶状态表达。而目的蛋白的可溶性常常受很多因素影响，包括特定的蛋白序列等。在大多数情况下，可溶性并非有或无的现象，载体、宿主菌及培养基的不同选择可以增加或降低可溶/不溶蛋白的量。
正确选用合适的载体和宿主菌组合会明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。载体可以通过三种方式改善目的蛋白的溶解性或正确折叠：1)与本身溶解性高的多肽序列融合表达[例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，硫氧还蛋白(Trx)及NusA (N utilization substance A)]；2) 与催化二硫键形成的酶融合表达(例如Trx，DsbA，及DsbC)；或者3) 与信号序列融合表达，输出到细胞周质。如采用蛋白位于细胞质的表达载体，可选用允许二硫键在胞质中形成的宿主菌株来使目的蛋白正确折叠(例如带有trxB和gor突变的菌株，参见第12页)。
要获得可溶的活性蛋白，还可以考虑选用能将蛋白转运到细胞周质的载体，因为细胞周质的环境更有利于蛋白折叠和二硫键的形成。因此应选用那些带有信号肽的载体。DsbA和DsbC是pET-39b(+)
及pET-40b(+)携带的催化二硫键形成/异构化的细胞周质酶。pET系统中还提供许多不带DsbA或DsbC编码区而具有信号序列的载体供选择(参见第7页表)。
许多情况下，目的蛋白聚集成不溶的没有生物活性的结构，称为包涵体。形成包涵体较有利于纯化：1) 容易通过离心收获浓度高而相对纯净的蛋白；2)包涵体保护蛋白免受蛋白酶水解。另外，毒性蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌的生长。
纯化方法中有一些专用于纯化细胞质中的包涵体。收集包涵体后将其溶解，可以使目的蛋白在体外重折叠。采用这种方法能够获得很高的蛋白产量并避免宿主菌中的蛋白酶降解。然而，不同蛋白重折叠为活性蛋白的效率大不相同，有时则非常低。因此，此法仅建议用于制备抗原或用于不特别要求正确折叠的应用情况。pET-17xb以N端融合蛋白形式表达全长220 aa T7基因10 蛋白，并形成包涵体。pET-31b(+)也是表达融合蛋白包涵体的代表，非常适合制备小蛋白和多肽。
融合标签
融合标签用于检测和纯化目的蛋白，有时也通过增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。配合特定应用的要求，你可以制备带有以下标签的融合蛋白：S?Tag?，T7?Tag®，GST?Tag?，His?Tag®，HSV?Tag® 或Nus?Tag?，很方便用Western Blot 检测。这其中有些多肽(融合序列)很小，对检测试剂的特异性和灵敏度有特别的要求。His?Tag，GST?Tag，S?Tag以及T7?Tag亦可用相应的树脂及缓冲液试剂盒进行亲和纯化。使用S?Tag及GST?Tag检测试剂盒可以对粗提物中的融合蛋白或纯化的蛋白进行精确定量测定。
FRETWorks?S?Tag分析试剂盒基于一种特别的材料能通过荧光检测1 fmol以下的融合蛋白。
His?Tag是常用的纯化蛋白的融合标签，特别是那些以包涵体形式表达的蛋白。可以将蛋白在完全变性条件下溶解，继而进行亲和纯化。
CBD?Tag?序列也常用于低成本亲和纯化。尤其适用于重新折叠操作[pET-34b(+)和35b(+)带有CBDclos?Tag序列]；只有正确折叠的CBDs方能与纤维素基质结合，而折叠不正确的组分则可通过CBinDTM亲和纯化操作有效去除。尽管许多标签都可用于固定目的蛋白，CBD?Tag却因纤维素基质本身极低的非特异性结合和生物兼容性而特别值得推荐。
据报道Nus?Tag?，Trx?Tag?及GST?Tag?序列可以增加融合表达蛋白的溶解性。氨苄抗性的Nus?Tag和Trx?Tag载体与Origami?，Origami B及Rosetta-gami?等能在细胞质中形成二硫键的宿主菌配合使用(参见第12页)。
下表列出了各种融合标签及对应的pET载体。有些pET载体可带有多个5'端融合标签(参见第7
页)。另外，许多载体能表达两端带有不同的多肽标签的融合蛋白。选用在5'端标签与目的序列间有蛋白酶切位点(凝血酶，肠激酶，Xa因子)的载体可以在纯化完成后切去一个或多个融合标签。
表达C-端融合序列时要特别注意的是：(1)插入序列不含终止密码子；(2)克隆保留正确的阅读框。pET载体各种融合标签
E. pET载体克隆策略
将编码蛋白的DNA克隆到pET载体上有多种策略。利用多克隆位点中的特定限制性酶切位点或非连接反应依赖性克隆方法(LIC)能很方便地完成克隆。LIC方法不需要进行限制性酶切及连接反应，LIC插入片段可以被迅速地克隆到多功能LIC载体上，适用于高通量克隆。所有pET载体图谱可以参阅网站https://www.doczj.com/doc/9f5914541.html,相关信息。
所有pET翻译载体在克隆和标签区域后以3种阅读框形式提供翻译终止密码子以及下游T7转录终止子。终止子对于大多数蛋白的高效表达并非必要，但对于一些带有方向与目的基因一致的氨苄抗性基因(β-内酰胺酶) 的pET质粒情况就不同了。如果T7转录终止子在克隆时被去掉，就会现随目的蛋白增加，IPTG 依赖的β-内酰胺酶(Mr 31.5 kDa)累积的情况，因为这时T7 RNA聚合酶造成高效通读转录。
不同pET载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。选用的克隆方式将决定这些“标签”或载体的附加氨基酸是否与目的蛋白一起融合表达。后续章节将介绍几种融合或非融合表达的克隆方法。
制备不带融合标签的天然蛋白几乎所有pET载体都能表达不带载体编码序列的蛋白。许多载体提供一个Nde I 或Nco I位点，以便在插入编码序列5'-端克隆进AUG起始密码子。与此类似，在插入片段中带上翻译终止密码子，就可以避免在蛋白的C-端带有载体编码序列。
在许多pET载体中，Nco I位点(CCATGG)中的A TG三联密码子编码T7 RNA 聚合酶转录产物N-端甲硫氨酸AUG起始密码子。任何目的基因或PCR制备的插入片段，若在开放阅读框的起始位置带有Nco I位点或与Nco I匹配的粘末端[BspH I (TCATGA)，BspLU11 I (ACA TGT)，以及AflIII (ACRYGT)和Sty I (CCWWGG)] ，均可克隆入Nco I位点。注意，如果目的基因内部编码多个相同酶切位点，使用这些限制性酶切位点将十分复杂。此外，若每个限制性酶切位点作为下一个三联密码子的第一个核苷酸，可能无法得到天然蛋白。如果是这种情况，可以考虑采用某些限制性酶切去识别位点“下游”序列，以期得到天然目的蛋白(见下表)。
酶(同裂酶) 识别及切割位点产生的粘端(参见pET载体特点总表，第7页)
Bbs I (Bpi I, BpuA I) 5’ -GAAGAC(N)2 –3’
3’ -CTTCTG(N)6 -5’
GAAGACNN NNNNN
CTTCTGNNNNNN N
Bsa I (Eco31 I) 5’ -GGTCTC(N)1 -3’
3’ -CCAGAG(N)6 -5’
GGTCTCN NNNNN
CCAGAGNNNNN N
BsmB I ( Esp3 I) 5’ -CGTCTC(N)1 -3’
3’ -GCAGAG(N)5 -5’
CGTCTCN NNNNN
GCAGAGNNNNN N
BspMI 5’ -ACCTGC(N)4 –3’
3’ -TGGACG(N)8 -5’
ACCTGCNNNN NNNNN
TGGACGNNNNNNNN N
任何上述限制性酶切位点都可以通过PCR引物设计得到，从而获得与Nco I匹配的粘端。要注意的是，和许多采用限制性酶切消化策略一样，如果目的基因编码完全雷同酶切位点时，这种简便方法的使用就会受到一定的限制。但是，不太可能某个插入片段同时包含以上4种酶位点。制备以蛋白酶切去融合标签的天然蛋白GST?Tag?[pET-41a-c(+)，42a-c(+)]和Nus?Tag?[pET-43.1a-c(+)，pET-44a-c(+)]载体上，在编码Xa因子，肠激酶或凝血酶酶切位点序列内带有PshA I 或Sma I限制性酶切位点。利用这些产生平末端的限制性酶(如下图示)，Xa因子、肠激酶或凝血酶即可从融合蛋白上切去所有载体编码序列。凝血酶的酶切效率会受到紧邻酶切位点的氨基酸影响。选用非极性或非酸性氨基酸作为起始的2到3个氨基酸有利于提高凝血酶酶切效率(Chang，1985；Le Bonniec，1991；Le Bonniec，1996)。不需连接反应的克隆方法(LIC)
LIC 是设计用于不需限制性酶切和连接反应而定向克隆PCR产物的方法(Aslanidis and de Jong，1990；Haun et al.，1992)。用LIC法制备的pET载体有不互补的12–15碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。T4 DNA 聚合酶的3'? 5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。pET LIC载体上所有载体编码的氨基酸序列都可以通过肠激酶或Xa因子去掉。LIC克隆策略详见操作手册TB163和TB205。
F. pET系统蛋白表达的调控
即使在没有IPTG 存在的情况下，也会有少量lacUV5 启动子表达的T7 RNA聚合酶，因此存在目的蛋白的本底表达。任何重组蛋白在E. coli 内表达都会或多或少地影响宿主的正常功能，并对宿主产生“毒性”。不同的外源蛋白毒性也不同。如果目的基因产物对E. coli毒性极大，这种本底表达就足以阻碍细胞生长以及影响在λDE3溶原菌中质粒的稳定性。pET系统功能非常强大，你可以根据目的蛋白的特点，通过选用T7/T7lac启动子，pLysS或pLysE宿主菌，以及培养基外加葡萄糖等方法严紧控制蛋白表达水平。也要注意，不要因为过度控制造成表达水平过低。因此，仔细了解下列工具的功能特点，以及根据实际经验为特定目的蛋白表达选择这些工具，两方面都很重要。
T7lac启动子
控制基础表达的手段之一是采用带有T7lac启动子的载体(Studier et al.，1990；Dubendorff and Studier，1991；见第7 页表)。这些质粒在紧邻T7启动子的下游有一个lac操纵子序列。它们同样带有常规启动子以及编码lac阻遏蛋白(lacI)的序列，T7lac和lacI启动子位置交错。采用这种载体及DE3溶原菌，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体lacUV5 启动子，抑制宿主聚合酶转录T7 RNA聚合酶，也作用于载体T7lac 启动子，以阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。只有极少数毒性极大的目的基因造成质粒在BL21 (DE3)或HMS174 (DE3)中不稳定(Dubendorff and Studier，1991)。注意：结合pLysS或pLysE宿主菌，蛋白表达有被过度调节的可能(见载体与宿主菌共同影响表达水平，见本页)。
pLysS和pLysE宿主菌
另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性、编码表达少量T7溶菌酶（T7 RNA 聚合酶天然抑制物）的宿主菌中表达(Moffatt and Studier，1987；Studier，1991)。T7 溶菌酶是一种双功能蛋白：它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层(Inouye et al.，1973)，它也可与T7 RNA 聚合酶结合，阻止转录(Zhang and Studier，1997；Huang et al.，1999)。T7溶菌酶由克隆到pACYC184BamH I位点的T7溶菌酶基因供给细胞(Chang and Cohen，1978)。克隆片段(T7 DNA 的10,665–11,296bp；Dunn and Studier，1983)在紧邻溶菌酶基因处还有T7 RNA 聚合酶3.8 ?promoter 启动子。由pACYC184的tet启动子控制的溶菌酶基因，按这种序列排列的质粒被称为pLysE，带有这种质粒的菌株会高水平积累溶菌酶。序列反向排列的质粒被称为pLysS；带有这种质粒的细胞积累溶菌酶的水平要低得多。注意，从pLysS宿主菌表达溶菌酶同样受培养条件影响。因为上游的CAT 抗生素抗性基因由一个代谢产物抑制敏感启动子调节，pLysS宿主菌在没有葡萄糖生长到平稳期时会
产生高水平cAMP和更高的CAT启动子活性。而当细胞培养到平稳期时，高CAT启动子活性会提高溶菌酶水平(Novy and Morris，2001)。而如果T7溶菌酶是由克隆基因提供的，大肠杆菌的耐受水平相对较高(例如细胞不会裂解)，这显然是因为表达出的蛋白无法穿过细胞内膜到达肽聚糖层。
两种溶菌酶质粒都不会干扰对含有该种质粒细胞的转化；pLysS对细胞生长影响很小，而pLysE 会明显降低宿主菌的生长水平。pLysE提供的高水平的溶菌酶会大幅度增加蛋白表达的滞后时间，降低通过诱导T7 RNA聚合酶表达目的基因的最高水平。含有相对无害的目的基因的宿主细胞可以在IPTG存在下持续生长，pLysE对这些细胞蛋白表达的有效阻滞作用在某些情况下是一个有用的特点。pLysS和pLysE溶原菌对带毒性基因的载体的耐受性有所提高：不稳定的质粒变得稳定，无法构建成功的质粒能够获得和表达。pLysE造成细胞生长缓慢并有裂解倾向，在大多数情况下使用不便。对于毒性极大的基因，带有T7lac 启动子的质粒和pLysS宿主菌是最佳选择。
有pLysS (或pLysE)存在时制备细胞抽提物特别方便。目的蛋白表达后，收集细胞并重悬于50 mMTris-HCl，2 mM EDTA，pH 8.0缓冲液。简单冻融，或加入0.1% Triton X-100，细胞内的T7溶菌酶即可有效裂解细胞。PopCulture?和BugBuster?蛋白抽提试剂可以帮助带有pLysS和pLysE质粒的菌株充分释放蛋白。这个特点使带有pLysS质粒的细胞在即使不特别要求目的质粒稳定性的情况下，仍然不失为一种不错的选择。注意，在利用重组子带有信号序列分离细胞周质部分蛋白时，建议不使用pLysS或pLysE质粒(因为宿主产生的T7溶菌酶会使细胞膜崩溃)。
载体与宿主菌共同影响表达水平
实际操作中，通常需要尝试多种不同载体/宿主菌组合以期获得拥有正确结构的目的蛋白的高水平表达。当使用“普通”T7启动子时，pLysS提供的低水平溶菌酶对T7 RNA聚合酶诱导后的目的蛋白表达影响很小，只是在出现目的基因产物时有短时延滞。显然，产生的T7 RNA聚合酶比被少量溶菌酶抑制的要多。(估计诱导时溶菌酶水平有所提高，因为T7 RNA 聚合酶能够开始使pLysS质粒基因完全转录产生溶菌酶mRNA。但是，φ3.8启动子是相对较弱的启动子(McAllister et al.，1981)，主要转录仍然来自于目的质粒采用的强启动子φ10。) 当采用T7lac 启动子时，我们观察到特定诱导条件下，pLysS宿主菌中的表达水平比非pLysS宿主菌相对较低。具体实例见Mierendorf等1994年综述，两个目的蛋白在不同T7/T7lac 启动子和pLysS及pLysE宿主菌中的表达差异比较。
含葡萄糖的培养基
Grossman等(1998)首次描述，培养基中添加葡萄糖可以维持pET系统中低水平本底表达。当培养细胞到达稳定期时，葡萄糖会作为第一碳源首先被利用，而后才是甘油等碳源。替代碳源的代谢导致
lDE3 溶原菌中环AMP (cAMP) 水平提高，从而刺激lacUV5启动子指导的转录，T7 RNA聚合酶表达。与野生型lac 启动子相比，lacUV5 启动子对cAMP刺激不如野生型敏感(Eron and Block，1971；Fried and Crothers，1984)。但研究显示，足够的刺激可以提高T7 RNA聚合酶水平，继而T7启动子调节目的基因表达(Kelley，1995；Grossman et al.，1998；Pan and Malcom，2000；Novy and Morris，2001)。已观察到当细胞进入稳定期时，在标准培养基中补充加入葡萄糖，lacUV5 启动子带来的本底表达大幅度下降(Grossman et al.，1998；Pan and Malcom，2000；Novy and Morris，2001)。
最低限度的本底表达对于pET载体在不带有pLysS质粒的宿主菌中表达至关重要，特别是当目的基因有毒性时，要生长达到稳定期(16 h或过夜培养)就更是如此(Grossman et al., 1998; Novy and Morris, 2001)。没有了来自pLysS质粒的T7溶菌酶，细胞稳定期本底表达水平就会提高。如果外源基因有毒性，在液体培养基和琼脂平板中加入0.5–1%葡萄糖以维持质粒稳定是非常必要的。包含pLysS质粒的宿主菌达到稳定期时溶菌酶表达水平较高，而目的蛋白表达水平降低。造成这种情况的原因可能是CAT基因启动子在没有葡萄糖时也对cAMP刺激敏感，而且位于pLysS的T7溶菌酶基因的上游(Novy and Morris, 2001)。
注意：在非表达宿主菌中进行克隆步骤时，不必要也不建议外加葡萄糖。虽然细菌生长到稳定期时不建议这样做，葡萄糖可以维持pET系统在lDE3宿主菌中最低水平本底表达目的蛋白，阻止T7溶菌酶过表达。
pLacI宿主菌
特别的(DE3)pLacI表达菌株只用于高拷贝质粒，如pETBlue?和pTriEx?(1.1，2，3及4)系列载体。这种宿主菌由共生的pLacI质粒提供lac 阻遏蛋白以保证非诱导条件下的严紧抑制。pETBlue和pTriEx不带有lac 阻遏蛋白基因，要求宿主菌提供lac 阻遏蛋白。请参考pETBlue系统操作手册(TB249)和pTriEx系统操作手册(TB250)了解pLacI宿主菌的使用。
另一个降低lDE溶原菌本底表达的办法是采用pETcoco载体。这类载体通常以单拷贝存在于细胞中，而一般pET载体常常是每个细胞20–50拷贝。在只有一个拷贝的情况下，目的基因变得十分稳定，重组和基因重排的可能极小，减少了本底转录水平，仅相当于pET载体的1/40。以IPTG诱导pETcoco重组蛋白表达，表达水平则与pET相近。详细信息参阅Sektas and Szybalski，2002 以及操作手册TB333。
G. 用于克隆的宿主菌
如前所述，pET系统功能强大，特性之一是能够将目的基因克隆在转录活性极低的条件下，即缺
乏T7 RNA 聚合酶来源的情况下。由于宿主T7 RNA 聚合酶不是来源于T7 启动子，所以在缺乏T7 RNA 聚合酶时，pET质粒上处于大肠杆菌T7启动子转录通读（如果存在）区域的克隆序列仅会有微弱转录，本底表达水平极低。尽管少数情况下(例如无毒目的蛋白)，可以直接将重组子克隆到表达宿主菌中，一般不建议采用这种策略。即使pET载体上的T7启动子只是造成低水平本底表达，通常也会造成宿主生长困难以及表达宿主中质粒不稳定。
用于克隆的宿主菌通常是K12系列NovaBlue，JM109以及DH5 a。这些菌株是recA–endA–型，转化效率很高，且质粒产量高，适合用于保存带有克隆目的基因的pET载体。NovaBlue还有另外的优点，由于带有可供筛选的F因子，便于辅助噬菌体感染，NovaBlue还可以制备用于突变的单链DNA (只适合质粒上带有f1复制区的情况)。请注意，pET载体不编码lacZ a-肽，因此也没有蓝/白斑筛选功能。如果要求T7表达载体具有蓝/白斑筛选功能，pETBlue质粒和NovaBlue配套使用可以达到要求(见操作手册TB249)。如果需要，NovaBlue宿主菌或其它非DE3宿主菌均可经噬菌体λCE6感染而诱导表达。详见噬菌体CE6相关描述。H. 用于表达的宿主菌重组质粒转化到带有染色体T7 RNA 聚合酶基因(T7 gene 1，举例见下文) 的大肠杆菌中，即可开始生产蛋白了。这些菌株都是噬菌体DE3的溶原菌，噬菌体DE3是?的一种衍生噬菌体，带有噬菌体21抗性区和lacI基因，lacUV5 启动子，以及T7 RNA聚合酶基因(Studier and Moffatt，1986；Novy and Morris，2001)。这一区段被插入int 基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG 诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA 开始转录。还可以选用带有蛋白酶缺陷，氨基酸营养缺陷型，溶解性增强，补充稀有密码子等特性的DE3溶原菌。另外，Novagen提供的λDE3溶原化试剂盒可以将将其它类型的大肠杆菌转换成DE3溶原菌。应该注意，几种常用商业克隆载体都带有T7启动子和单独的lac操纵子/启动子元件用于重组子的蓝/白斑筛选。虽然原则上这些载体可以用于pET表达菌株，实际应用中还是不用为妙。这些载体上的多拷贝lac操纵子会结合lac抑制因子，使pET菌株中同样受lac抑制因子控制的基因部分表达。结果基本的T7 RNA聚合酶活性会升高，使目的基因的稳定性受到影响。这些因素在pETBlue?系统中达到相当好的平衡。
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
pET-41b(+) 编号 名称 北京华越洋VECT--‐540 pET--‐41b(+) pET41b载体基本信息 别名: pET41b, p ET 41b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物: T7或pGEX--‐5‘ 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin 备注: Encodes GST fusion tag; Nterm thrombin cleavage site; Nterm enterokinase c leavage s ite; P shAI b lunt c loning s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET41b载体质粒图谱和多克隆位点信息
Feature N ame Start End T7_terminator 120 1 T7_Terminal_primer 69 87 EK 278 264 S15 353 309 6xHIS 413 396 GST (variant) 1094 444 T7_transl_en_RBS 1119 1103 lacO 1164 1137 T7_promoter 1182 1164 tet (300 --‐ 563) 1218 1481 pBRrevBam_primer 1289 1270 lacI 1564 2655 ROP 3227 3418 pGEX_3_primer 3434 3412 pBR322_origin 4452 3833
原核表达载体的重要调控元件 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。
pET-SUMO 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4790 pET--‐SUMO pETsumo载体基本信息 载体名称: pET--‐SUMO 质粒类型: 大肠杆菌表达载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 启动子: T7 和 lacO 克隆方法: TA C loning 载体大小: 5643bp 5' 测序引物及序列: T7 F orward 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag(6x)；SUMO T ag 载体抗性: 卡那霉素 筛选标记: --‐--‐ 备注: 宿主菌株BL21(DE3)；IPTG诱导 稳定性: --‐--‐ 组成型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 pETsumo载体质粒图谱和多克隆位点信息
pETsumo载体简介 The Champion pET--‐SUMO Expression System produces the highest levels of soluble protein i n E. c oli. I t u tilizes a s mall u biquitin--‐related m odifier (SUMO) f usion, b elonging t o the growing family of ubiquitin--‐related proteins, to enhance the solubility of expressed fusion proteins. In contrast to ubiquitin, SUMO is involved in the stabilization and localization of proteins in vivo. After expression, the 11 kd SUMO moiety can be cleaved by the highly specific and active SUMO (ULP--‐1) protease at the carboxyl terminal, producing a native protein*. The Champion pET SUMO Protein and Peptide Expression System o ffers: Greatly enhanced solubility with an N--‐terminal SUMO fusionHighly efficient cleavage--‐ produces n ative p rotein o f i nterest w ith S UMO (ULP--‐1) p rotease*Highly s pecific c leavage--‐ eliminates the chance of your protein of interest being internally digested, regardless of its a mino a cid s equenceSignificantly i ncreased s tability w ith S UMO f usion--‐can b e u sed f or small peptide productionT7lac promoter for high--‐level protein expressionN--‐terminal 6xHis t ag f or p rotein d etection a nd p urification. pETsumo载体序列
【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体 原核表达载体，如pet系列，型号从小到大，那么多，往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。 希望下面的讨论分系列进行，如pet系列、pgex系列等 这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍，只要你耐心的看完，相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充 pET，原核表达金标准（转） pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，
pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签 2）信标标签
3）纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4）酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
pET 原核表达 pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
pET-3a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5510 pET--‐3a(+) pet3a载体基本信息 别名: pET3a, p et 3a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4640bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐T7 载体抗性: Ampicillin 备注: Same a s p ET9 b ut a mpR; a,b,c,d v ary b y M CS. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet3a载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet3a载体简介 The maps for pET--‐3b, pET--‐3c and pET--‐3d are the same as pET--‐3a (shown) with the following exceptions: pET--‐3b is a 4639bp plasmid; subtract 1bp from each site beyond BamH I a t 510. p ET--‐3c i s a 4638bp p lasmid;subtract 2bp f rom e ach s ite b eyond B amH I a t 510. pET--‐3d is a 4637bp plasmid; the BamH I site is in the same reading frame as in pET--‐3c. An Nco I site is substituted for the Nde I site with a net 1bp deletion at position 550 o f p ET--‐3c. A s a r esult, N co I c uts p ET--‐3d a t 546. F or t he r est o f t he s ites,subtract 3bp from each site beyond position 551 in pET--‐3a. Nde I does not cut pET--‐3d. The pET--‐3a--‐d vectors carry an N--‐terminal T7?Tag? sequence and BamH I cloning site. These vectors are the precursors to many pET family vectors; the pET--‐23a--‐d(+) series corresponds to pET--‐3a--‐d but incorporates several additional features. Unique sites are shown on the circle map.Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding s trand t ranscribed b y T7 R NA p olymerase i s s hown a bove.
原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到 JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。 1．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 （1）制样 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。 2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。 4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。 5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离心2min，倾倒上清。 6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。 （二）菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker 20ul。 （3）SDS-PAGE分析 1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶 蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%) 4-4020
pET-41a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4930 pET--‐41a(+) pET41a载体基本信息 别名: pET41a, p ET 41a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5933 b p 5' 测序引物: pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 3' 测序引物: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin, N--‐EK, N--‐S 载体抗性: 卡那 备注: 载体带有GST蛋白纯化标签，pET41 a,b,c 的差异是在于多克隆位点。 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET41a载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET41a载体简介 pET41系列载体是设计用来克隆和高水平表达蛋白质的载体，载体融合表达一个含有220 个氨基酸的GST标签蛋白纯化片段。pET41a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒 图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在 质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子 是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够 产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. N o. 69337--‐3)的作用下终 止蛋白翻译。 pET--‐41a载体上面含有一个EK蛋白酶切位点，当将目的基因使用载体上面的PshAI限制 性内切酶位点插入进去时，可以通过EK蛋白酶将载体上的融合的所有氨基酸序列包括GST标签序列，全部切除掉。
实验方法与步骤 1 表达质粒的构建及测序分析 1.1 cofilin-1的片段的准备 1.1.1 引物设计 根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。引物如下： 引物名称序列 F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′ R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。 1.1.2 cofilin-1片段PCR 1 反应体系： 2.5μl KOD polymerase(3’-5’核酸外 切酶活性) KOD polymerase buffer 5μl MgSO4 2.5μl DMSO（“万能溶剂”） 2.5μl dNTPMixture 5μl PrimerF（底物） 1.5μl PrimerR 1.5μl Template（模板）5μl ddH2O 25μl Total 50μl 2PCR反应条件：
①94℃预变性3min ②94℃退火30s ③65℃延伸40s ④68℃40s ⑤go to②30个循环 ⑥68℃5min ⑦4℃forever 3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测 （1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。 （2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。 （3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。 4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收： （1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。 （2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。 （3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。 （4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，
[Merck推荐]原核表达秘笈之宿主菌株选择指南 在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。 事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因——即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。 作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？ 知其然还要知其所以然。比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。 真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。（已经携带有氯霉素抗性质粒） 当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione
pET-14b 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4150 pET--‐14b pET14b载体基本信息 别名: pET14b, p et 14b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4671bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐His, N--‐thrombin 载体抗性: Ampicillin 备注: Hosts: E.coli. R elated v ectors: p BR322. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET14b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET14b载体简介 The p ET--‐14b v ector (Cat. N o. 69660--‐3) c arries a n N--‐terminal H is?Tag? s equence f ollowed b y a thrombin site and three cloning sites. Unique sites are shown on the circle map. Note that thesequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA p olymerase i s s hown b elow. pET14b载体序列 ORIGIN 1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA 61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG 121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT 181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA 241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG 301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC 361 CACACCCGTC CTGTGGATAT CCGGATATAG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA 421 CCCGTTTAGA GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT 481 CAGCTTCCTT TCGGGCTTTG TTAGCAGCCG GATCCTCGAG CATATGGCTG CCGCGCGGCA 541 CCAGGCCGCT GCTGTGATGA TGATGATGAT GGCTGCTGCC CATGGTATAT CTCCTTCTTA 601 AAGTTAAACA AAATTATTTC TAGAGGGAAA CCGTTGTGGT CTCCCTATAG TGAGTCGTAT 661 TAATTTCGCG GGATCGAGAT CTCGATCCTC TACGCCGGAC GCATCGTGGC CGGCATCACC 721 GGCGCCACAG GTGCGGTTGC TGGCGCCTAT ATCGCCGACA TCACCGATGG GGAAGATCGG 781 GCTCGCCACT TCGGGCTCAT GAGCGCTTGT TTCGGCGTGG GTATGGTGGC AGGCCCCGTG 841 GCCGGGGGAC TGTTGGGCGC CATCTCCTTG CATGCACCAT TCCTTGCGGC GGCGGTGCTC 901 AACGGCCTCA ACCTACTACT GGGCTGCTTC CTAATGCAGG AGTCGCATAA GGGAGAGCGT 961 CGACCGATGC CCTTGAGAGC CTTCAACCCA GTCAGCTCCT TCCGGTGGGC GCGGGGCATG 1021 ACTATCGTCG CCGCACTTAT GACTGTCTTC TTTATCATGC AACTCGTAGG ACAGGTGCCG 1081 GCAGCGCTCT GGGTCATTTT CGGCGAGGAC CGCTTTCGCT GGAGCGCGAC GATGATCGGC 1141 CTGTCGCTTG CGGTATTCGG AATCTTGCAC GCCCTCGCTC AAGCCTTCGT CACTGGTCCC 1201 GCCACCAAAC GTTTCGGCGA GAAGCAGGCC ATTATCGCCG GCATGGCGGC CGACGCGCTG 1261 GGCTACGTCT TGCTGGCGTT CGCGACGCGA GGCTGGATGG CCTTCCCCAT TATGATTCTT 1321 CTCGCTTCCG GCGGCATCGG GATGCCCGCG TTGCAGGCCA TGCTGTCCAG GCAGGTAGAT 1381 GACGACCATC AGGGACAGCT TCAAGGATCG CTCGCGGCTC TTACCAGCCT AACTTCGATC 1441 ACTGGACCGC TGATCGTCAC GGCGATTTAT GCCGCCTCGG CGAGCACATG GAACGGGTTG 1501 GCATGGATTG TAGGCGCCGC CCTATACCTT GTCTGCCTCC CCGCGTTGCG TCGCGGTGCA 1561 TGGAGCCGGG CCACCTCGAC CTGAATGGAA GCCGGCGGCA CCTCGCTAAC GGATTCACCA 1621 CTCCAAGAAT TGGAGCCAAT CAATTCTTGC GGAGAACTGT GAATGCGCAA ACCAACCCTT 1681 GGCAGAACAT ATCCATCGCG TCCGCCATCT CCAGCAGCCG CACGCGGCGC ATCTCGGGCA 1741 GCGTTGGGTC CTGGCCACGG GTGCGCATGA TCGTGCTCCT GTCGTTGAGG ACCCGGCTAG 1801 GCTGGCGGGG TTGCCTTACT GGTTAGCAGA ATGAATCACC GATACGCGAG CGAACGTGAA 1861 GCGACTGCTG CTGCAAAACG TCTGCGACCT GAGCAACAAC ATGAATGGTC TTCGGTTTCC 1921 GTGTTTCGTA AAGTCTGGAA ACGCGGAAGT CAGCGCCCTG CACCATTATG TTCCGGATCT 1981 GCATCGCAGG ATGCTGCTGG CTACCCTGTG GAACACCTAC ATCTGTATTA ACGAAGCGCT