pET载体，原核表达金标准对于全世界许多研究者，Novagen 的pET 系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA 聚合酶识别的T7 启动子之下，因此在加入T7 RNA 聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到pET 载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由lacUV5 控制的T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入IPTG 诱导表达；也可通过l CE6 感染原始克隆宿主菌来提供T7 RNA 聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统( 如tac 、lac 、trc 、pL) 有困难的许多基因已经在pET 系统中稳定克隆和表达。T7 RNA 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50% 。
新开发的T7 驱动表达技术以pETBlue TM 系统为代表。pETBlue 载体包括了pET 用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒DNA 操作的方面更为方便。
pETBlue TM 系统：新一代T7 表达载体
pETBlue 载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和T7 驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌tet 启动子的反义方向插到lacZ a - 肽编码区，因此可进行蓝/ 白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的T7 转录和翻译信号使表达成为可能。与标准pET 载体一样，通过转化λ DE3 溶原菌并用IPTG 诱导或通过l CE6 感染原始宿主菌生产目标蛋白。
优点
·蓝/ 白斑筛选，便于克隆
·高拷贝数，质粒DNA 高产
·以AccepTor TM 载体或perfectly Blunt a 载体形式提供，便于快速PCR 克隆·目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性
·表达水平与经典pET 载体相同
·用Tuner TM (DE3)pLacI 宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。
PET 系统：大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌
pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯
化目标蛋白的许多其它相关产品。
优点
·是原核蛋白表达引用最多的系统
·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低
·真正的调节表达水平的“变阻器”控制
·提供各种不同融合标签和表达系统配置
·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物
·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化
阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标
蛋白等特点。
pETBlue TM 系统
T7 驱动的严紧控制表达、蓝/ 白斑筛选、质粒产量高
新颖的pETBlue TM 系统兼有广受欢迎的蓝/ 白斑筛选载体所具有的通过目测确定重组体和高质粒拷贝数，以及pET 载体严紧控制的高蛋白表达等特点。蓝/ 白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子( tet ) 驱动lacZ a - 肽表达而实现，而目标基因表达由相反方向的T7 启动子驱动。目标序列插入多克隆位点（MCS ）破坏了lacZ a - 肽的表达，在NovaBlue 菌株中当存在x-gal 时产生白菌落表型，而带有非重组载体的菌落变蓝。由
于T7 驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于tet 启动子的反义方向，因此实际上没有目标序列的基础表达。相对于pET 载体，pETBlue 质粒上高拷贝PUC 复制起点增加了质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。
如果插入序列相对于T7 lac 启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求，pETBlue 载体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达：用l CE6 （l pL 启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组pETBlue 质粒到宿主菌Tuner TM (DE3)pLacI 或Origami TM (DE3)pLacI 中并用IPTG 诱导。这些宿主菌染色体上带有一拷贝lacUV5 控制的T7 RNA 聚合酶基因，并通过相容的pLacI 质粒提供足够lac 阻遏蛋白，以确保低水平的未诱导表达。Tuner 菌株的lacY 状态使整个培养细胞被均一的诱导，并随IPTG 剂量诱导有不同的蛋白表达水平。Origami 菌株能够增强胞质中二硫键形成。
pETBlue-1
pETBlue-1 便于从5' 端编码开放读码框架的插入片段表达未融合的天然蛋白。该载体EcoR V (GATATC) 克隆位点位于强T7 基因10 核糖体结合位点（RBS ）附近。含有ATG 起始密码子或5' 端具有一个位置合适的G 核苷酸插入片段成为一个合适的大肠杆
菌翻译起始位点。
pETBlue-2
pETBlue-2 提供了载体编码的ATG 起始密码子和多种下游克隆位点。MCS 5' 和3' 端两套各三个重叠平末端酶切位点便于将任何插入片段克隆到读码框中。在载体确定的读码框中，这些酶产生的平末端终止于密码三联体的不同位置。因此只要插入方向正确，任何插入片段可克隆到经过合适平末端酶切割的载体的读码框中。而且，任何不含内部终止密码子的插入片段都可与C- 末端HSV.Tag a 表位和His.Tag a 序列克隆到同一读码框中。
pETBlue TM PCR 克隆试剂盒
方便地将PCR 扩增DNA 直接克隆到pETBlue 载体中
除了含有未切割质粒的pETBlue TM 系统，Novagen 还提供可立即插入PCR 产物的pETBlue 载体。已有两种试剂盒：AccepTor TM 载体试剂盒能够插入带单个3' -dA 突出的DNA ，如非校对DNA 聚合酶( 如Taq DNA 聚合酶) 的扩增产物；而perfectly Blunt a 克隆试剂盒设计用于克隆任何末端形式的插入片段。
在pETBlue-1 AccepTor 载体中表达插入基因的引物设计：
pETBlue-1 ：用5' 端ATG 开始的正义引物进行扩增，能够确保在大肠杆菌中有效合成蛋白的RBS 和翻译起始位点之间的最适距离。目标序列羧基端引物设计没有限制。
Met---
正义引物5' -ATG XXX ---
反义引物无限制
pET 系统概述
pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平
pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。
没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株
质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控
制的λ DE3 溶原菌。
有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码的高亲和力lacIq 阻遏蛋白，NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外，Novagen 提供了λ DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过l CE6 感染提供T7 RNA 聚合酶。虽然不如用IPTG 诱导λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。
高严紧性T7 lac 启动子
除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，pET 系统中T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通T7 启动子和T7 lac 启动子。T7 lac 启动子在启动子区下游17bp 处含有一个25bp 的lac 操纵序列。该位点结合lac 阻遏蛋白能够有效降低T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于lacI 的机制（除了抑制lacUV5 ）。含T7 lac 启动子的pET 质粒还具有它们自己的lacI ，确保足够的阻遏蛋
白结合到操纵基因位点上。
在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体/ 宿主菌组合。
控制诱导的表达水平
在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体/ 宿主菌
组合控制T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性，pET 系统还根据诱导物（IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。Tuner 和OrigamiB 宿主菌的lacY 突
变使这种控制成为可能。
选择pET 载体
所有的pET 载体均来自pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类pET 质粒，即转录载体和翻译载体：
转录载体（包括pET-21 、pET-23 和pET-24 ）表达目标RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的
一个缺失字母后缀加以区分）
翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框a 、b 和c 中带有克隆位点，分别对应于BamH I 位点的GGA 、GAT 和ATC 三联体。
选择要点
选择用于表达的pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：
·所表达蛋白的用途
·所表达蛋白的已知信息
·克隆策略
pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、
宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。
任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序
列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子Xa 能够去除所有
氨基端载体编码序列。
由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采PCR 克隆策略时则有不同的考虑。LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过PCR 制备插入片
段，而不需要限制性消化载体或插入片段。
溶解性和细胞定位
考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。
特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白(Trx.Tag ) 融合。新推出的pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白--Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外，trxB 突变株AD494 和BL21 trxB ，或trxB/gor OrigamiTM 和OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（15 -25 ° C）也可增
加可溶性目标蛋白的比例。
获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。
一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭( 如使用Novagen 的蛋白折迭试剂盒) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能
相当低。pET-31b （+ ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多
肽的有效方法。
满足不同需要的融合标签
如果融合序列不影响应用，生产带有S.Tag 、T7.Tag a 、His.Tag a 和HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒，GST.Tag 、S.Tag 和
T7.Tag 序列可用于亲和纯化。
使用S.Tag 和GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于1fmol 的融合蛋白。His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。
CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有CBD clos .Tag a 序列的pET-34b （+ ）和35b （+ ））。因为只有正确重新折迭的CBDs 结合到纤维素基质上，CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质
的生物相容性，使它更适合用于这一目的。
Nus.Tag 、Trx.Tag 和GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。Nus.Tag 和Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的Origami 宿主菌相容。
各种融合标签和相应pET 载体见列表。一些pET 载体带有数个串联的融合标签，作为5' 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。pET-30 Ek/LIC 、pET-32 Ek/LIC 、pET-34 Ek/LIC 和pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。
pET Ek/LIC 载体Combo 试剂盒包括所有4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基
因构型。
pET NusA 融合系统43.1
在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白
新推出的pET NusA 融合系统设计用于克隆和高水平表达与495aa NusA （Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中4000 个以上蛋白进行可溶性建模，NusA 蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同NusA 融合蛋白进行的试验中，大于85% 的表达蛋白都是可溶的。pET-43.1 载体含有Nus.Tag 融合伴侣并与trx/gor 突变体Origami 和OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用pET-43.1 载体和这些trx/gor 宿
主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。
优点
·高可溶性的N- 末端Nus.Tag 融合伴侣
·上游His.Tag a 、S.Tag 和可选择的C- 末端HSV.Tag a 、His.Tag 融合标签
·凝血酶和肠激酶切割位点
·多克隆位点位于所有读码框中
·与AD494 和Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭
pET 宿主菌株感受态细胞
所有pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。
（DE3 ）指宿主为λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5 启动子控制的T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为pLysS 和pLysE 的宿主菌带有编码T7 溶菌酶（为T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的pET 相容性质粒。带有pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长
和活力的目标蛋白的pET 重组体。带有pLacI 的宿主菌产生额外的抑制pETBlue 和pTriEx 载体基础表达的lac 阻遏蛋白。λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新
表达宿主菌。
AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄
抗性标记bla 的质粒。
B834 为BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。
BL21 应用最广的宿主菌来源，具有lon 和ompT 蛋白酶缺陷的优点。
BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷BL21 背景上具有与AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变( trxB ) 。由于trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的质粒。BLR 为BL21 的recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或
其产物能够引起DE3 噬菌体丢失的目标质粒。
HMS174 菌株在K-12 背景上提供了recA 突变。与BLR 一样，这些菌株能够稳定其产
物能够引起DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。
NovaBlue 适合用作初始克隆宿主菌的K-12 菌株，具有高转化效率、蓝/ 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒DNA 高产的recA endA 突变。由于存在F 附加体编码的lacI q 阻遏蛋白，NovaBlue 的DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。Origami 为K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似，Origami （DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高10 倍以上。Origami 宿主菌与氨苄
抗性质粒相容，可用于pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。TrxB 和gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标
记bla 的pET 质粒。
Origami B 宿主菌来源于BL21 lacZY 突变株，还带有与原始Origami 菌株相同的TrxB / gor 突变。Origami B 菌株集BL21 、Tuner 和Origami 宿主菌的优点于一体。TrxB 和gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的
pET 质粒。
Rosetta 宿主菌从BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA 、AGG 、AGA 、CUA 、CCC 和GGA 的tRNAs 。这样Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在Rosetta （DE3 ）pLysS 和Rosetta （DE3 ）pLacI 中，稀有tRNA 基因存在于分别带有T7 溶菌酶和
lac 阻遏基因的同一质粒上。
Tuner 菌株为BL21 的lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。lac 通透酶（lacY ）突变使得IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。Tuner （DE3 ）pLacI 菌株与pETBlue 和pTriEx 载体的表达相容。
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
如何阅读质粒图谱 最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于 大家分享。 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素 #复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 ＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+ ＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l ＃P/E 启动子/增强子l ＃Termsl 终止信号 ＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 ＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 ＃增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。 ＃核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。l ＃转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
pET-41b(+) 编号 名称 北京华越洋VECT--‐540 pET--‐41b(+) pET41b载体基本信息 别名: pET41b, p ET 41b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物: T7或pGEX--‐5‘ 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin 备注: Encodes GST fusion tag; Nterm thrombin cleavage site; Nterm enterokinase c leavage s ite; P shAI b lunt c loning s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET41b载体质粒图谱和多克隆位点信息
Feature N ame Start End T7_terminator 120 1 T7_Terminal_primer 69 87 EK 278 264 S15 353 309 6xHIS 413 396 GST (variant) 1094 444 T7_transl_en_RBS 1119 1103 lacO 1164 1137 T7_promoter 1182 1164 tet (300 --‐ 563) 1218 1481 pBRrevBam_primer 1289 1270 lacI 1564 2655 ROP 3227 3418 pGEX_3_primer 3434 3412 pBR322_origin 4452 3833
原核表达载体的重要调控元件 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。
pET-SUMO 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4790 pET--‐SUMO pETsumo载体基本信息 载体名称: pET--‐SUMO 质粒类型: 大肠杆菌表达载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 启动子: T7 和 lacO 克隆方法: TA C loning 载体大小: 5643bp 5' 测序引物及序列: T7 F orward 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag(6x)；SUMO T ag 载体抗性: 卡那霉素 筛选标记: --‐--‐ 备注: 宿主菌株BL21(DE3)；IPTG诱导 稳定性: --‐--‐ 组成型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 pETsumo载体质粒图谱和多克隆位点信息
pETsumo载体简介 The Champion pET--‐SUMO Expression System produces the highest levels of soluble protein i n E. c oli. I t u tilizes a s mall u biquitin--‐related m odifier (SUMO) f usion, b elonging t o the growing family of ubiquitin--‐related proteins, to enhance the solubility of expressed fusion proteins. In contrast to ubiquitin, SUMO is involved in the stabilization and localization of proteins in vivo. After expression, the 11 kd SUMO moiety can be cleaved by the highly specific and active SUMO (ULP--‐1) protease at the carboxyl terminal, producing a native protein*. The Champion pET SUMO Protein and Peptide Expression System o ffers: Greatly enhanced solubility with an N--‐terminal SUMO fusionHighly efficient cleavage--‐ produces n ative p rotein o f i nterest w ith S UMO (ULP--‐1) p rotease*Highly s pecific c leavage--‐ eliminates the chance of your protein of interest being internally digested, regardless of its a mino a cid s equenceSignificantly i ncreased s tability w ith S UMO f usion--‐can b e u sed f or small peptide productionT7lac promoter for high--‐level protein expressionN--‐terminal 6xHis t ag f or p rotein d etection a nd p urification. pETsumo载体序列
【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体 原核表达载体，如pet系列，型号从小到大，那么多，往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。 希望下面的讨论分系列进行，如pet系列、pgex系列等 这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍，只要你耐心的看完，相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充 pET，原核表达金标准（转） pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，
酿酒酵母表达载体 pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF pY15TEF, pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424,酵母双杂交系统：酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109;质粒pGADT7,pGBKT7 ;对照质粒pGBKT7-53 , pGBKT7-lam , pGADT7-T , PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,丫187,丫190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZ a A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc , 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33, KM71 , KM71H , GS115, 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62等原核表达载体，包括pET系列，pET-GST, pGEX 系列(含GST标签)，pMAL 系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,- p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis 系列，pQE 系列,pTrc99a,pTrcHis系列， pBV220,221,222,pTXB 系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA (分泌型表达系列),pQBI63 (原核表达带荧光)pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPi nPoi nt-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF (+) , pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233- 3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK (+) ,pBlueScript SK (-) pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C,大肠杆菌冷激质粒：pColdI pColdII pColdIII pColdTF原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet- 1,pCDFduet-1, pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣：pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞：DH5a JM101 JM103
pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签 2）信标标签
3）纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4）酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
pET 原核表达 pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
一、载体主有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ 多 克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记： （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆
载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 相关概念： 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或 操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子－为真核λ基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。 λ转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT 或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 三、载体及其分类 载体：即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的 基因片段进入受体细胞的DNA。 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动 外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨型载体）（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件 （ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
pET-3a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5510 pET--‐3a(+) pet3a载体基本信息 别名: pET3a, p et 3a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4640bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐T7 载体抗性: Ampicillin 备注: Same a s p ET9 b ut a mpR; a,b,c,d v ary b y M CS. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet3a载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet3a载体简介 The maps for pET--‐3b, pET--‐3c and pET--‐3d are the same as pET--‐3a (shown) with the following exceptions: pET--‐3b is a 4639bp plasmid; subtract 1bp from each site beyond BamH I a t 510. p ET--‐3c i s a 4638bp p lasmid;subtract 2bp f rom e ach s ite b eyond B amH I a t 510. pET--‐3d is a 4637bp plasmid; the BamH I site is in the same reading frame as in pET--‐3c. An Nco I site is substituted for the Nde I site with a net 1bp deletion at position 550 o f p ET--‐3c. A s a r esult, N co I c uts p ET--‐3d a t 546. F or t he r est o f t he s ites,subtract 3bp from each site beyond position 551 in pET--‐3a. Nde I does not cut pET--‐3d. The pET--‐3a--‐d vectors carry an N--‐terminal T7?Tag? sequence and BamH I cloning site. These vectors are the precursors to many pET family vectors; the pET--‐23a--‐d(+) series corresponds to pET--‐3a--‐d but incorporates several additional features. Unique sites are shown on the circle map.Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding s trand t ranscribed b y T7 R NA p olymerase i s s hown a bove.