第21卷第1期2006年3月
大连水产学院学报J OURNAL OF DALI A N FI SHER I E S UN I V ERSI TY
Vol 21No 1
M ar 2006
文章编号:1000-9957(2006 01-0024-07
光照对4种单胞藻生长速率、叶绿素含量
及细胞周期的影响
刘青, 张晓芳, 李太武, 苏秀榕
1
1
2
2
(1 大连水产学院生命科学与技术学院, 辽宁大连116023; 2 宁波大学生命科学学院, 浙江宁波315211
摘要:在不同光照周期、光照强度和光谱下, 测定了小球藻Ch l orell a sp 、湛江等鞭金藻I sochry sis
zhanjiangensis 、青岛大扁藻P lat ym onas hel go l andica 和绿色杜氏藻D unaliella vir i dis 的生长速率及叶绿素含量。结果表明:当光照强度为3000l x 时, 在光照周期为24L 0D 、18L 6D 、12L 12D 、6L 18D 和0L 24D 的5个梯度组中, 光照周期为18L 6D 时, 的5个梯度组中, 光照强度为5000l x 时,
4种藻的生长速率均最大, 分别为0 227、0 150、
0 175、0 360个/d; 当光照周期为12L 12D 时, 在光照强度为10000、5000、3000、1000、500l x
4种藻的生长速率均最大, 分别为0 225、0 188、0 174、
0 261个/d; 在红、绿、蓝、白光不同光谱的照射下, 以白炽灯下4种藻的生长速率最大, 分别为0 185、0 165、0 257、0 322个/d , 且在蓝光培养下小球藻、等鞭金藻和扁藻叶绿素a 的含量较高。测定了在4种光源培养下扁藻的细胞周期, 结果以在红光下培养的扁藻G 1期占的比例最低, 白光下次之, 而在绿、蓝光下培养的扁藻G 1期所占比例比在红、白光下高出3 8%~5 9%。因此, 培养上述4种藻类的适宜光源为白光或红光。
关键词:单胞藻; 光照; 生长速率; 叶绿素; 细胞周期中图分类号:Q 948 885 3 文献标识码:A
光对植物生长的影响, 国内外学者进行过大量的研究, 而光照周期、光照强度、光谱成分等因子对单胞藻生长的影响, 近年也有大量报道
[1~12]
。但由于藻的种类不同和试验条件的不同, 其结果也
存在一定的差异。本试验中, 作者选取生产上常用的小球藻、湛江等鞭金藻、青岛大扁藻和绿色杜氏藻为研究对象, 探讨了光照周期、光照强度和光质对4种藻的生长速率、叶绿素含量的影响, 并首次
报道了光质对扁藻细胞周期的影响。旨在寻找培养单胞藻的最佳光照条件, 以指导生产实践。
1 材料与方法
1 1 藻种及培养
试验用小球藻Ch lorella sp 、湛江等鞭金藻Isochrysis zhanjiangensis (简称等鞭金藻、青岛大扁藻P laty m onas hel g oland ica (简称扁藻和绿色杜氏藻Dunaliella viri d is (简称杜氏藻均由辽宁省海洋水产研究所提供。
试验用海水需经沉淀、过滤后煮沸, 锥形瓶也经煮沸消毒。用250mL 锥形瓶取藻种(约200mL, 在与培养条件相同的环境下放置两昼夜使其稳定, 取上层藻液接种, 然后在设定的各种试验条件下进行培养, 培养期间每天摇瓶数次。营养盐按Conw ay 配方配制, 与海水的体积比为1 1000。1 2 试验方法
1 2 1 不同光照周期下藻的生长速率和叶绿素含量设光照周期为24L 0D 、18L 6D 、12L 12D 、
收稿日期:2005-01-15
(-, 女, E-m l
li i ng @d lf
6L 18D 和0L 24D 共5个梯度组, 每种藻在每一光照周期下设置3个重复。将接种后的锥形瓶置于光照培养箱(HPG-400型内培养, 培养温度为(25 1 , 光照强度为3000lx , 培养6d 后取出, 分别测定其生长速率和叶绿素含量。
1 2 2 不同光照强度下藻的生长速率和叶绿素含量设光照强度为10000、5000、3000、1000、500l x 共5个梯度组, 每种藻在每一光照强度下设置3个重复。在室温为21~27 、光照周期为12L 12D 下, 培养6d 后取出, 分别测定其生长速率和叶绿素含量。
1 2 3 光谱成分对藻生长速率、叶绿素含量及细胞周期的影响将4种藻分别置于红光(650~760n m 、绿光(500~560nm 、蓝光(430~470nm 和白炽灯(390~760n m 下进行培养, 每组设3个重复。在室温为21~27 、光照周期为12L 12D 下, 培养6d
后取出, 分别测定其生长速率和叶绿素含量。同时, 用EPI CP0-XL 型流式细胞仪检测扁藻的细胞周期, 变异系数CV 为<2 0%, 样品
56[13]
浓度为10~10个/mL。所测结果以直方图表示, 细胞周期图谱由电脑自动生成并打印。1 3 测定方法
1 3 1 种群增长的测定种群增长的测定是采用细胞视野计数法。每次取样前先将锥形瓶中的藻液摇匀, 取0 1mL 藻液置于浮游植物计数框上, 在O ly m pus 显微镜下(600倍, 计数40~50个视野。
藻类生长的变化一般通过细胞密度和生长速率的变化来反映, 生长速率的计算公式为:l n N t -l n N 0
ln2, t
其中:N t 是第t 天的细胞数量; N 0为初始细胞数量; t 为培养时间。
=
1 3
2 叶绿素含量的测定采用分光光度法测定叶绿素的含量。取一定量的藻液用真空泵抽滤, 抽干后将藻及滤膜一起放入具塞离心管中, 加入体积分数为95%的丙酮溶液至10m L , 振荡提取叶绿素, 放置暗处过夜, 在3000r /min 下离心15m in , 取上清液测定其吸光值。
2 结果
2 1 不同光照周期下4种藻的生长速率和叶绿素含量
由图1可见, 在光照周期为18L 6D 下, 小球藻、等鞭金藻、扁藻和杜氏藻(以下排序同的生长均最快, 生长速率分别为0 227、0 150、0 175、0 360个/d, 而在0L 24D 光照周期下的生长最慢。
由表1可见, 4种藻在18L 6D 光照周期下, 其单位水体的叶绿素含量最高, 分别为411 77、912 61、501 94、1452 54 g /L,而在0L 24D 下的叶绿素含量最低。
2 2 不同光照强度下4种藻的生长速率
和叶绿素含量
图1 不同光照周期下4种藻的生长速率由图2、表2可见, 在光照周期为
12L 12D, 光照强度为5000l x 时, 4种藻 F i g 1 Th e gro w th rate of four un ice ll u lar al ga species und er
的生长速率和叶绿素含量均最高(分别为
differen t photoperiods
0 225、0 188、0 174、0 261个/d和343 21、282 64、341 13、802 77 g /L,而在500l x 强度照射下, 4种藻的生长速率和叶绿素含量均最低。在光照强度为
1000~10000l x 时, 小球藻的生长速率差异不大。3种绿藻单位水体叶绿素a /b的值:小球藻为2 25~2 81, 扁藻为2 03~2 43, 杜氏藻为2 38~2 71; 等鞭金藻单位水体叶绿素a /c的值为2 33~2 60。
表1 不同光照周期下单胞藻的叶绿素含量
T ab 1 Th e ch lorophyll con ten t i n un icell u lar algae und er d ifferen t photoper i ods
藻类
光照周期24L 0D 18L 6D 12L 12D 6L 18D 0L 24D 24L 0D 18L 6D 12L 12D 6L 18D 0L 24D 24L 0D 18L 6D 12L 12D 6L 18D 0L 24D 24L 0D 18L 6D 12L 12D 6L
18D 0L 24D
单位水体叶绿素含量/( g L -1 叶绿素a 217 01297 15219 78168 24108 80377 35733 70682 26345 06327 86165 52346 74236 30181 46120 44870 011008 28971 44874 93686 01
叶绿素b(c 92 10114 62101 8084 1854 0461 11178 91178 0057 3854 4076 60155 20107 4366 4743 99377 03144 26385 49348 58254 50
总量309 11411 77321 58252 42162 84438 46912 61860 26402 44382 26242 12501 94343 73247 93164 981247 041452 541356 931223 51940 51
a /b(c 2 362 592 162 012 016 174 103 836 016 032 162 232 202 732 742 312 272 522 512 70
单位细胞叶绿素含量/(10-6 g i nd -1 叶绿素a 10 8314 3111 4626 5824 398 6210 7015 169 8610 40
叶绿素b (c
4 60
5 525 3113 3012 122 472 623 962 642 72
总量15 4319 8316 7739 8836 5111 0913 3219 1212 5013 12
a /b(c 2 352 592 162 012 013 494 083 833 743 82
小球藻Ch l orell a
等鞭金藻Isoc hry sis zhanji angensis
扁藻P l a t ymona s h el g oland ica
杜氏藻Duna liella viri d is
表2 不同光照强度下单胞藻的叶绿素含量
Tab 2 The ch l orophyll con tent i n un icell u l ar algae under d ifferent light i n tensities
藻类
光照强度
/lx500100030005000100005001000300050001000050010003000500010000500100030 00500010000
单位水体叶绿素含量/( g L -1 叶绿素a 66 5972 32161 88243 15110 41108 62127 98177 47201 55115 25100 54121 12181 56234 12112 33122 23286 75442 46586 39147 56
叶绿素b(c 27 8632 1457 61100 0643 8141 7650 5671 2281 0949 5344 6852 0289 49107 0146 2351 36118 98165 81216 3857 87
总量94 45104 46219 49343 21154 22150 38178 54248 68282 64164 78145 22173 14271 05341 13158 56173 59405 73608 27802 77205 43
a /b(c 2 392 252 812 432 522 602 532 492 482 332 252 332 032 192 432 382 412 672 712 55
单位细胞叶绿素含量/(10-6 g i nd -1 叶绿素a 9 579 6814 9817 1210 5310 417 506 606 447 66
叶绿素b (c
4 004 30
5 337 054 184 482 982 642 602 94
总量13 5713 9820 3124 1714 7114 9010 469 249 0410 60
a /b(c 2 392 252 812 432 522 332 532 502 482 61
小球藻Ch l orell a
等鞭金藻Isoc hry sis zhanji angensis
扁藻P l a t ymona s h el g oland ica
杜氏藻Duna liella viri d is
2 3 光谱成分对试验藻生长速率、叶绿素含量及细胞周期的影响
2 3 1 不同光谱成分下4种藻的生长速率、叶绿素含量由图3可见, 4种藻在白炽灯下的生长速率均最大(0 185、0 165、0 257、0 322个/d,在绿光和蓝光下的生长较为缓慢, 有的出现负生长。
由表3可见, 在蓝光下培养的小球藻、等鞭金藻和扁藻的叶绿素a 含量较高, 分别为385 85、148 24、232 50 g /L;3种绿藻单位水体叶绿素a /b的值和等鞭金藻叶绿素a /c的值均为最高。单位水体叶绿素a /b的值:小球藻为2 75~20 55, 扁藻为2 35~19 47, 杜氏藻为2 47~20 31, 等鞭金藻(叶绿素a /c为3 45~13 05。单位细胞叶绿素a /b的值:小球藻为2 74~7 37, 等鞭金藻(叶绿素a /c为4 44~13 03。
第1期刘青, 等:光照对4种单胞藻生长速率、叶绿素含量及细胞周期的影响27
图2 不同光照强度下4种藻的生长速率
F i g 2 Th e gro w th rate of four un icellu l ar a l ga spe -cies under d ifferen t light i n tensities
图3 不同光质下4种藻的生长速率
Fig 3 The gro w th rate of four un i ce llu l ar alga s p e -cies under differen t spectra
表3 不同光质下单胞藻的叶绿素含量
Tab 3 Th e ch lorophyll con ten t i n un icell u lar algae und er d ifferen t spec tra
藻类
光谱成分白光
红光绿光蓝光白光红光绿光蓝光白光红光绿光蓝光白光红光绿光蓝光
单位水体叶绿素含量/( g L -1 叶绿素a
小球藻Ch l orell a 等鞭金藻Isoc hry sis zhanji angensis
扁藻P l a t ymona s h el g oland ica 杜氏藻Duna liella viri d is
205 03292 48336 17385 8512811679190461441481242071599319986199232150694135561115220126315154
叶绿素b(c 74 6881 1019 9018 78371151810081271113678163401067174111942811112261271219415154 总量279 71373 58356 07404 631651319719054171159160286122134105104173244144975146787142233120331108
a /b(c 2 753 6116 8920 5531454144516213105216421351112419147214721481710220131
单位细胞叶绿素含量/(10-6 g i nd -1 叶绿素a 12 3519 7028 1127 9514153161773911941118
叶绿素b (c
4 50
5 054 083 793127219931943116
总量16 8524 7532 9831 7417180191764310844134
a /b(c 2 743 906 897 3741445161919513103
21312 光谱成分对扁藻细胞周期的影响由图4、表4可见, 红光下培养的扁藻G 1期(细胞从有丝分裂完成到DNA 复制之前的这段间隙占的比例最短(7519%, 在
绿光、蓝光下培养的扁藻G 1期所占比例要比红光、白光下的高出318%~519%。白光下培养的扁藻G 2期所占比例最短(216%, 绿光下培养的扁藻S 期(细胞进入DNA 复制的时期, DNA 含量在S 期增加一倍占的比例最短(110%, 蓝光下次之(215% 。扁藻的M 期(分裂期则没有检测出。
表4 不同光谱成分下扁藻的细胞周期比例 Tab 14 The proportion of cell cyc l e i n P lat y monas
helgolandica under d ifferen t spectra
细胞周期cell cycle G 1G 2S
白光w h i te li ght 7810216
1914
红光red li gh t 75191813518
绿光green li ght 81181712110
蓝光b l ue light 81181517215
%
3 讨论
311 光照周期对单胞藻生长速率和叶绿素含量的影响
, ,
28大连水产学院学报第21卷
[2]
(饱和光期, 生长率即不再增加甚至下降。据谭辉玲等报道:钝顶螺旋藻Sp irulina p latensis 在培养
期内, 随着光照时间延长, 生长加快, 干物质积累量增加, 叶绿素和蛋白质含量都较高; 而当每天的光照时间继续增加时, 螺旋藻细胞生长受到抑制, 干重下降。藻类因种类的不同, 对光照时间的需求也不同, 如骨条藻日照9h 的光合速率大于15h 的, 以24h 全光照下最低
[15]
[14]
。
光照时间的长短对藻类的生长没有直接影响, 主要与光合作用中所得能量的积累有关, 因而光照时间对藻类生长的影响与光强度、温度有关。田宫博对小球藻的生长研究结果表明, 在低光照或较高温度下, 日照6、12、18h , 得出日照时间与生长速率成正比; 而在较强光照下, 日照时间增加而生长速率却不增加; 当藻密度很大时, 饱和光期延长。一般来说, 周期性光线的明暗交替可刺激藻类的细胞分裂, 24h 全光照通常会降低藻类的生长, 本试验中全光照下藻类生长速率降低也与此有
关。
图4 不同光谱成分下扁藻的细胞周期图谱
F ig 14 Ce ll cycle of Platy monas helgoland ica under d ifferent spectra
[3]
?o?±
的研究结果表明, 盐生杜氏藻在光强5600l x 下, 生长和生殖的最适光期为20h , 随着
光期的缩短(18、12、6、4h, 杜氏藻的日产量递减。本试验条件下未做光期为20h 的试验, 作者推测绿色杜氏藻的最适光期为18~24h 。
单位水体叶绿素含量的变化反映了藻类密度或现存量的变化。藻类生长速率高时, 现存量一般也高, 两者的变化趋势相近。本试验的结果也表明, 在不同的光照周期下, 4种藻的叶绿素量与其生长
第 1期刘青, 等: 光照对 4种单胞藻生长速率、叶绿素含量及细胞周期的影响29 312 光照强度对试验藻生长速率和叶绿素含量的影响在光因子中, 有关光照强度对藻类影响的研究最多。在饱和光照强度内, 随着光强的增加, 藻类的光合速率加快; 超过饱和强度, 藻类的光合速率反而减弱直至停止。据 , oμ??à 报道, 绿色杜氏藻和盐生杜氏藻最高收获量的照度均为 6 000 lx, 光强为 6 000 ~ 12 000 lx时, 随着光强的增加, 藻类的收获量下降。陈明耀等结果相近。 [ 15] [ 4] 指出, 湛江等鞭金藻 25e 时的最适照度为 7 000 lx。这些结果与本试验由于对光照强度的色素适应, 不同光强下单位细胞叶绿素含量和叶绿素 a / b的变化趋势则未必与叶绿素量的变化一致, 如等鞭金藻单位细胞叶绿素含量在 500 lx时最高, 而在 5 000 lx 时反而最低。 [ 5] 一般藻类在强光下, 叶绿素和藻胆蛋白的含量会呈下降趋势。据陆开形等报道, 雨生红球藻 H aem atococcus pluvialis从低光强到高光强, 随着时间的变化, 单位细胞叶绿素 a的含量逐渐减少, 直至稳态。曾文炉也曾报道, 耐强光的盐泽螺旋藻品系 3F, 在强光下其叶绿素和藻胆蛋白的含量呈下降趋势, 胡萝卜素和 B - 胡萝卜素含量也有所降低; 钝顶螺旋藻在强光下的光合行为也与此类似。本试验结果表明: 在光照强度增加时, 小球藻单位细胞叶绿素 a的变化呈现低 - 高 - 低的趋势; 等鞭金藻单位细胞叶绿素 a的变化趋势是从高到低, 这与一般研究者得出的结论基本相同。藻类细胞分裂速率达到最高值时的照度远较光合作用最高值时的照度低, 这是因为细胞含氮产物 [ 16 ] 的形成在较低的照度下即可完成, 而糖类的生物合成则继续随光照的增高而增强 , 因此, 作者从生长率测得的最适照度要比根据光合强度测得的低。 313 光质对试验藻生长速率和叶绿素含量及细胞周期的影响光合作用中能被植物色素所吸收和利用的光, 仅仅为波长 390~ 760 nm 可见光的绝大部分[ 16] [ 6] 。藻的种类不同, 对有色光的吸收也不同。 [ 7] 本试验结果表明, 4种藻类在白炽灯下的生长要明显快于在绿光和蓝光下的生长。 ?± ? 曾报 ?D 道, 最适合杜氏藻生长和光合作用的是白色光, 盐生杜氏藻在红光下光合活性较白光下降低了30 , % 在绿光和蓝光下生长受到抑制, 光合强度降到补偿点以下。张爱琴等 [ 8] 的
研究结果表明, 在红光下培养的螺旋藻, 其叶绿素和藻胆蛋白的含量都比较高。由
于这两种色素对可见光的吸收都主要集中在红光区, 而红光是植物进行光合作用的最有效光能, 所以藻体细胞能积累较多的光合产物和干物质, 而在蓝、绿光环境下藻体细胞生长缓慢。这些结果与本试验结果基本一致。藻类叶绿素合成明显受蓝光
促进, 在红光下合成较少。据王伟报道, 中华盒形藻 B iddulp h ia [ 10] sinensis在红光下其叶绿素 a的含量较低, 在蓝光下叶绿素 a的含量较高。同样, 李韶山也指出, 用蓝光处理离体的大麦叶片, 其叶绿素含量较稳定, 而用红光处理后, 其叶绿素和蛋白质含量均有所下降。本试验结果表明, 在蓝光培养下的小球藻、等鞭金藻和扁藻, 叶绿素 a含量均较高, 3种绿藻单位水体叶绿素 a / b的值和等鞭金藻单位水体叶绿素 a / c的值均为最高值。这与王伟和李韶山报道的结果相近。 H ow e ll等 [ 11] [ 9] 曾报道, 螺旋藻在红光下培养时, 其叶绿素含量最高, 而在蓝光和绿光下培养, 其叶绿素 a的含量最低。这与本试验的结果相反, 这可能是因为螺旋藻属于蓝藻门种类, 蓝藻的藻胆素对可见光的吸收主要在红光区, 因而光合效率较高, 产生的光合产物多; 而在蓝、绿光, 特别是绿光下, 蓝藻中的叶绿素几乎不吸收绿光, 所以光合活性降低, 藻类生长减慢。M ig uel等 [ 12] 通过试验, 对红光促进螺旋藻生长的机理, 提出了不同的解释, 他发现在红光环境下, 螺旋藻细胞中的藻蓝素含量下降, 而 B - 胡萝卜素上升, 后者可以吸收 300~ 500 nm 的光波, 因而避免了叶绿素 a的氧化; 而
在弱光照条件下, B- 胡萝卜素则主要发挥其作为辅助色素的功效, 专职于捕获光能
并将其有效地传递给叶绿素 a 。本试验选取 4种光源培养扁藻, 测出的细胞周期值都存在一定差异。在红光下培养的扁藻 G1期占的比例最短 ( 7519 , 而在绿光、蓝光下培养的扁藻 G1期所占比例要比在红光、白光下的高出 % 318 ~ 519 , 在绿光下培养的扁藻 S期占的比例最短 ( 110 。M 期由于时间极短, 在此没有检 % % %
30 大连水产学院学报第 21卷测出。这表明在红光、白光培养下的扁藻细胞进入分裂期的比例较多, 从细胞周期的测定结果看, 培养上述类型的单胞藻以白
光或红光较为适宜。参考文献: [ 1] [ 2] [ 3] [ 4] 夏丽, 陈贻 . 盐藻的低温光抑制 [ J]. 海洋科学, 1989, 254 56- 59. : 谭辉玲, 薛建刚. 特定红外辐射对钝顶螺旋藻生长的影响 [ J] . 微生物学通报, 1993 20( 4 : 200- 203. , ’??? ? ". ?áí?? ? ? 3 ? 3 ? … ? 2à ?í?3 μ ? ? ? , A steromona s g raci le A rtar oD una liella salina Teod [ J] . ???? … ?
? o o à ± oD ± à o ?? à à à?? ? ? “? 2 à , á ? , 1966 ( 6 : 36- 42 ?( o ? à ? , . , ????? ? “. ? o ?o ? 1 o ? ? ? ± ? ??í? ?± ? ? 3 ? ? í ? á ?? ? à ? 1 3 ? ? à à ? μ ± o′ ? à 2 ± à ± o?D una liella s lina [ J ] . ? o ? 2 à à o , 1963 32 a ? à o ? ′? , ( 2 : 230 - 238 . [ 5] [ 6] [ 7] 陆开形, 蒋霞敏, 翟兴文. 光照对雨生红球藻生长的影响 [ J] .
河北渔业, 2002, 6 6- 10 : . 曾文炉, 丛威, 蔡昭铃, 等. 螺旋藻的营养方式及光合作用
影响因素 [ J] . 植物学通报, 2002 19( 1 : 70- 77. , ? ?“ ? ? ‘. ? à ?à à o , ? ?? ? ?, ? à ào? ′à ? ?o ?? ? ? ? à ? ± ? o à ±D unaliel la T eod [ M ] . ?1 ± ? ? ? à ? ? ′ ? o ? ?± o ± ? ? ′ , ? ′ ± é ? à , ±á? ? ? ? ? ?? μ μ ?? ?3 . ???? ?± ? μ ??, 1973. 114- 186. : ? 3a ? ± [ 8] [ 9] [ 10 ] [ 11 ] 张爱琴, 姜泉, 谢小军, 等. 不同光质对
钝顶螺旋藻生长和放氧放氢活性的影响 [ J] . 植物生理学通报, 1989 ( 4 : 23- 26. , 王伟. 光质对中华盒形藻生长及生化组成的影响 [ J]. 武汉植物学研究, 1999, 17( 3 :
197- 200. 李韶山, 潘瑞枳. 植物的蓝光效应 [ J] . 植物生理学通讯, 1993, 29( 4 : 248- 252 . HOW ELL R, K ROBER O, COLL I S F. The ef fect of l igh t qu ality on grow th and com position of soybean [ J ] . Plant Phys io, 1997, 32 N l ( supp : 8. [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] M I EL O, E I I O D. E ffects of light inten sity and qual ity on the grow th rate and photosynthetic pigm ent con tent of Spiru lina p la ten sis GU RR [ J] . Japp l Phyco, 1990, ( 2 : 97 - 104 l . 宋平根, 李素文. 流式细胞术的原理和应用 [ M ] . 北京: 北京师范大学出版社, 1992. 何志辉, 赵文. 养殖水域生态学 [M ] . 大连: 大连出版社, 2001 14- 19 . . 陈明耀. 生物饵料培养 [ M ] . 北京: 中国农业出版社, 1995. 51 - 53 . 潘瑞枳, 董愚得. 植物生理学: 上册 [ M ] . 北京: 人民教育出版社, 1979 . Effects of light on grow th rate chlorophyll level , and cell cycle in four alga species L I Q ing , U 1 ZHANG X iao-fang , 1 L I T a-wu , i 2 SU X iu -rong 2 ( 1. S ch ool of L ife S cience and Techno logy, D al ian F isheries U n iv. , D alian 116023 Ch ina; , 2 College of L ife S cien ces N ingbo U n ivers ity, N ingbo 315211, Ch ina . , Abstract G row th rate and chlorophy ll content in four a lg a speciesChlorella, Isochry sis zhanjiangersis P laty: , m onas helgoland ica and Dunaliella virid is w ere deter ined in different pho toperio ds, light in tensity and ligh t m qua lity R esults show ed th at there w as the m ax i al grow th in pho toper io d of 18L B6D, wh ich w as 0 227 . m . , 0 150 0 175 ind1 / d and 0 360
ind1 / d for Chlorella, Isochry sis zhangjiangersis P latym onas helg oland ica . , . . , and Dunaliella virid is, respectively M ax i al grow th rate w as a lso observed at 5 000 lx lig ht in tensity w hich . m , w as 0 225, 0 188 0 174 ind1 / d and 0 261 ind1 / d fo r Chlorella, Isochry sis zhangjiangersis P la tym onas . . , . . , helg oland ica andDunaliella viridis respectively In different light spectra m ax i al grow th occurred in wh ite , . , m lig h, wh ich w as 0 185 0 165 0 257 ind1 / d and 0 322 in d1 / d for Ch lorella, Isochry sis zhangjiangersis t . , . , . . , P latym onas helg oland ica and Dunaliella viridis respect iv e ly. There w as h ig her ch lorophy ll content in blue , lig ht than in other treatm ents A lso cell cycle o f P latym onas sp. w as stud ied in four lig ht qua lities R esults . , . in dica ted that proport io n of stage G1 ofP la tym onas sp w as th e least in red lig h, fo llowed by w hite ligh.t T he . t proportion o f stage G1 w ere 3 8 ~ 5 9 h ig her in g reen and blue lig ht than in red and w hite ligh. It is sug . % . % t gested that na tu re and red lig ht be the opti al culture lig ht qua lity m . K ey w ord s a lg a ligh; grow th rate chlorophyl; ce ll cyc
le : ; t ; l
第一节 叶绿素荧光参数及其意义 韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333） 叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最 广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统II 的叶绿素a ，而光系统II 处于整个光合 作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统II ，进而引起 叶绿素a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量 方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的 应用。 1 叶绿素荧光的来源 藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来 的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少， 叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析 吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs ，1 fs=10－15 s ）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图1）。而最低激发态的叶绿素分子可以稳定 存在几纳秒（ns ，1 ns=10－9 s ）。 波长吸收荧光红 B 蓝 荧光 热耗散 最低激发态较高激发态基态吸收蓝光吸收红光能量A 图1 叶绿素吸收光能后能级变化（A ）和对应的吸收光谱（B ）（引自韩博平 et al., 2003） 处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素a ，用于进行光化 学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞 争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化 学反应发射在皮秒级（ps ，1 ps=10－12 s ），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用 于进行光化学反应，荧光只占约3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素b 到叶绿素a 的传递几乎达到100％的效率，因此基本检测不到 叶绿素b 荧光。在常温常压下，光系统I 的叶绿素a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统I 叶 绿素a 荧光的研究要在77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系 统II 的叶绿素a 发出的荧光。
叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL 式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。 解方程（1） （2）组得 C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C T C T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝ 5 .341000 652 A (6) 有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler 等对Arnon 进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： C a ＝12.21A 663—2.59 A 646 (7)
Hydrobiologia485:191–198,2002. ?2002Kluwer Academic Publishers.Printed in the Netherlands. 191 Chlorophyll-a determination with ethanol–a critical test ′Eva P′a pista1,′Eva′Acs2&B′e la B?ddi3,? 1E?tv?s Lor′a nd University of Science,Doctoral School,P′a zm′a ny P′e ter allee1/A,Budapest H-1117,Hungary 2E?tv?s Lor′a nd University of Science,Department of Microbiology,P′a zm′a ny P′e ter allee1/C Budapest H-1117, Hungary 3E?tv?s Lor′a nd University of Science,Department of Plant Anatomy,P′a zm′a ny P′e ter allee1/C,Budapest H-1117,Hungary Tel:12660240;E-mail:bbfotos@ludens.elte.hu (?Author for correspondence) Received2May2001;in revised form30August2002;accepted20August2002 Key words:algae,chlorophyll-a determination,ethanol,ISO standard10260(1992) Abstract Chlorophyll-a content is widely used as an indicator of the quality of freshwater bodies.Quanti?cation of chlorophyll-a is a routine procedure in the test laboratories of water works,and in research laboratories.Although attempts have been made to standardise the measurement procedure,there are nonetheless many procedures currently in use.This work is focused on a careful re-examination of the ISO:10260,1992standard,which prescribes90%(v/v)ethanol for chlorophyll extraction and measurement.Chlorophyll contents of cultures of the cyanobacterium Synechococcus elongatus N?geli and the chlorophyte Scenedesmus acutus Meyen were determined by means of a series of concentrations of ethanol/water mixtures which were employed as extracting agents–the water content was gradually decreased from20to0%.The extraction procedure was veri?ed by measuring the amount of retained water after using both water and oil pumps for?ltering the samples.The spectroscopic effects of the presence of water were studied and the molecular background of these spectral phenomena is discussed.The extraction yields obtained with90%ethanol were compared to those obtained with methanol and acetone.On the basis of the calculated error level,improvements to the ISO:10260,1992standard method have been suggested. Introduction The chlorophyll(Chl)content of freshwater bodies is a widely accepted indicator of water quality.Research projects on periphyton(Cattaneo,1983;Jonsson, 1987;Robinson&Rushforth,1987;Pantecost,1991) or phytoplankton(Kiss&Genkal,1993;Balogh et al., 1995;Jones,1995;Kiss,1996;Sha?k et al.,1997; Skidmore et al.,1998;Kiss et al.,1998)use these characteristics to describe the trophic state(Sumner &Fisher,1979;V?r?s&Padisák,1991;Talling, 1993)of the studied system.However,the identi?c-ation of the alga species,the knowledge of the algal cell number,or the physiological state of cells may also be important in providing a true picture of the water quality or trophic state.A combination of Chl determination and consideration of these other factors may provide an improvement in the reliability and ac-curacy of water quality estimation.Uterm?hl(1958) developed a method to determine the individual num-ber of algae with an inverted microscope and Lund et al.(1958)described a procedure to estimate the accuracy and limitations of Uterm?hl’s method. If certain taxa are in developing or degrading stages in the studied populations,consideration of the factors above is essential,since certain species produce toxins harmful to both water animals and hu-man(Slatkin et al.,1983;Codd et al.,1992).It has been established that the presence of algae and thus the Chl content indicate the concentration of certain chemicals or the appearance of toxins in the drinking water(Bernhardt&Clasen,1991).Thus,considera-
叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5m 3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm 和645nm下测定吸光度。在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。 四、实验结果计算 叶绿素a的含量 = 12.7 ? OD 663 – 2.69 ? OD 645 叶绿素a的含量 = 22.9 ? OD 645 – 4.86 ? OD 663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02 ? OD 663 + 20.20 ? OD 645
细胞生长状况有关指标的检测方法 一、细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为细胞计数板。巴氏吸管和显微镜。步骤如下。 l 取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻擦干。 l 取细胞悬液0.3ml，加入0.9结晶紫染液，混匀后滴半滴于细胞计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡。 l 在显微镜下用10X物镜观察计数四角大方格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。 细胞数（ml）=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数 台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。此外还可用0.02%的藻红b染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝。 细胞存活率=[4大格活细胞数/（4大格活细胞数+4大格死细胞数）]×100% 在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。 二、细胞生长曲线和生长倍数 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反映出细胞生长的动态。 测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养1周（7天），期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。 也可采用MTT法来进行生长曲线测定。 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。
实验报告 植物生理学及实验（甲）实验类型：课程 名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶 绿素含量的测定姓名：专业：学 号：指导老师：同组学生姓名： 实验日期：实验地点： 二、实验内容和原理一、实验目的和要求装 四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订 六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和 性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在 未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为 材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应， 形成绿色的可溶性叶绿素2． 盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH
HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色 、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为 叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75
叶绿素含量的测定 一.实验原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL.式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。就是吸光度的加和性。如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 植物叶绿素含量测定----丙酮提取法 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 ● 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。 ●利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为： ●A=Kbc 式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。 ●叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a 和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示： ●A663=82.04C a+9.27C b （1） ●A645=16.76C a+45.60C b（2） ●C a=12.7 A663—2.59 A645(3) ●C b=22.9 A645—4.67 A663 (4) ●C a十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) ●
人体各大器官细胞的更新周期 肝细胞的寿命只有5个月 由于血液供应充足，肝脏自我恢复和再生的能力惊人。这意味着它把毒素排出体外的重要工作可以继续下去。如果你奇怪为什么就连酒鬼的肝功能有时候也会提高，这是因为肝细胞只有150天左右的寿命。英国莱斯特皇家医院的肝脏外科医生大卫·劳埃德解释说：“我可以在一次手术中切除患者肝脏的70%，只要两个月的时间，大约90%的肝就会长出来。” 但是，酗酒者的软组织细胞（肝脏的主要细胞）可能会逐渐受损，形成疤痕组织，也叫硬化。因此，虽然健康的肝可以不断自我更新，而硬化损伤是永恒的，有时甚至是致命的。 味蕾的寿命仅仅10天 英国牙医协会的科学顾问达明·维穆斯莱教授解释说，舌头上有大约9000个味蕾，帮助我们感受甜、咸、苦或者酸味。味蕾本身是舌头表面细胞的集合，每个味蕾有大约50个味觉细胞。味蕾一般只需要10天到2周便会自我更新一次。但是，任何引起发炎的因素如感染或者吸烟都会损害味蕾，影响它们的更新，减弱它们的敏感性。 大脑的寿命和你自己的寿命相同 英国巴特与伦敦医院的神经外科专家约翰·瓦德莱指出，能持续终身的大多数细胞是在大脑中发现的。瓦德莱说：“我们的脑细胞约有1000亿个，出生时数量已固定，我们大脑的大部分不会随老化而自我更新。” 事实上，我们的确会损失细胞，这就是患上痴呆症的根本原因以及头
部受伤破坏性很大的原因。瓦德莱说：“但是，大脑有两个部位的细胞会自我更新，支配我们嗅觉的嗅球和用于学习的海马状突起。” 脑细胞处在一种连续不断地死亡且永不复生增殖的过程，死一个就少一个，直至消亡殆尽。这是一种程序性死亡，也叫凋亡。人到20岁之后,脑细胞就开始以每天10万个速度递减，减少的都是那些闲置的，呀不经常通电的，也就是不用的，爱因斯坦的大脑利用为11%，平常人一般3--6%吧 心脏干细胞的寿命是20年 之前人们一直以为心脏不能自我更新。但是，纽约医学院的一项研究发现，心脏上布满不断自我更新的干细胞，它们一生中至少更新2到3次。 肺表面细胞的寿命大约是2到3周 国肺脏基金会副主席基思·普罗斯解释说，肺细胞不断自我更新。但是，肺有不同的细胞，它们的更新速度不同。位于肺部深处的用来交换氧气和气体的气泡或者气囊细胞更新过程稳定，需要约1年的时间。与此同时，肺部表面的细胞必须每隔2到3周进行自我更新。普洛斯博士说：“它们是肺的第一道防线，因此必须快速更新。”肺气肿会阻止这种更新，因为这种病源自气泡的破坏，肺壁上形成了永久性的“洞”。 眼睛的寿命也和你的寿命相同 眼睛是身体中为数较少的在你的生命期间不会改变的身体部分之一。眼部唯一不断更新的部位是角膜。英国视光师学院的院长罗伯·霍根表示，如果角膜受损，它能在24小时内复原。霍根说：“角膜必须有一个平滑的
叶绿素含量测定方法---丙酮法 由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。 藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。 取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）： 叶绿素a含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数 叶绿素b含量用以下公式进行计算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数 叶绿素总含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数 由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。 叶绿素提取方法 提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300. 一、直接浸提法： 1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。随后在盛有藻泥的离心管中加入蒸馏水，与藻泥混匀后再次离心，目的是除去藻细胞表面的盐份，此清洗过程重复三次。 2、往藻泥中加二甲基亚砜3.33ml，65℃水浴9h，20h； 3、然后离心，将上清转移到10ml棕色瓶中， 4、添加6.67ml80%丙酮到离心管中，混匀，离心，再将上清转移到10ml棕色瓶中。 5、定容，待测。
叶绿素含量的测定 绿素含量的绿定叶 一、绿绿目的 1.了解分光光度绿的工作原理～ 2.掌握不同型分光光度绿的操作方绿～号 3.通绿本绿绿的绿掌握绿素含量绿定的一绿常绿的方法学叶------分光光度法。 二、绿绿原理 叶叶体体体叶绿素是脂溶性色素～主要存在于以绿绿首的色素中。在活中～绿绿 素脂蛋白绿合受到绿原系绿的保绿～绿和光是绿定的。与并氧 叶绿素的80%丙绿提取液在波绿663nm～645nm有吸收峰～绿素叶a和绿素叶b 的绿度符合以下公式, C=0.0127A-0.00259A a663645 C=0.0229A-0.00467A绿度绿位是,g/Lb645663 C=12.7A-2.59Aa663645 C=22.9A-4.67A绿度绿位是,mg/Lb645663 叶绿素绿绿度绿, C=C+CTab 若以绿液中色素含量表示～绿来 三、绿器、绿绿和材料 1.绿器 紫外-可绿分光光度绿、、研体25ml容量、璃漏斗、璃棒、皮绿滴管瓶玻玻2. 绿绿
丙绿;分析绿,、85%丙绿、80%丙绿 2.材料 绿绿、石英砂、酸绿碳 四、操作步绿 1. 在遮光件下取出等绿绿品～剪碎～混～取绿绿条匀称0.1-0.5g～ 2. 绿品置于绿～加入少量酸绿和石英砂～加入一定绿的丙绿磨绿绿～再加研内碳体研匀 85%丙绿适量绿绿磨至绿绿白色～研 3. 绿绿有绿绿的漏斗绿液绿入将匀25ml的容量中～用瓶并80%的丙绿分次洗绿和绿绿清研～ 最后用80%的丙绿定容。 4. 以80%的丙绿绿比液～在参663和645nm波绿绿绿定吸光绿;A绿在0.2-0.8范绿～内 绿度绿大绿用80%丙绿适稀绿,。当 五、绿果绿理 按照公式绿算出绿素叶a和绿素叶b的绿度～再绿算出绿素的含量。叶六、 注意事绿 1. 在活～绿合绿绿素是绿定的～绿绿一绿破～绿素易被光解。因此～抽提和绿体内叶坏叶 定工作绿可能避光快速完成。尽 2. 绿含有大量酸性液泡的绿品～绿首先加入微性的绿液～仔绿磨后加入丙绿绿行碱冲研抽提。 3. 分光光度绿的精度绿绿定的绿果有至绿重要的影～使用前绿绿器绿行校正。响七、思考绿
植物组织中叶绿素含量测定 （无机及分析化学实验II-设计性实验） 一、实验目的 1．设计用分光光度计测定植物组织中的叶绿素 2. 学习利用文献资料设计研究方案 3. 掌握分光光度计测定植物组织中的叶绿素的原理与方法 二、原理： 叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合 成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对 光、热较敏感；在酸性条件下，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中 可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种，均 易溶于乙醇、乙醚、酒精和氯仿。 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素a、b在长波方面最大吸收峰分别位于663nm和645nm，且两吸 收曲线相交于652nm处。叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，可在663nm和 645nm测定试样吸光度（两组份混合试样测定，双波长法），根据Lambert－
Beer定律，列出浓度c与吸光度A之间的关系式： A 663 ＝82.04c a＋9.27c b (1) A 645 ＝16.75c a＋45.6c b (2) （1）、（2）式中的A 663、A 645 为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度 度。 c a 、c b为叶绿素a、b的浓度，单位为g/L。 82.04、9.27为叶绿素a、b在波长663nm时的比吸收系数16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm时的比吸收系数。解方程式（1）（2），则得经验公式： c a =12.7 A 663 -2.69 A 645 (3) c b =22.9 A 645 -4.68 A 663 (4) c T =（c a + c b）=20.2 A645+8.02 A663...... (5) 此时，c T为总叶绿素浓度，c a、c b为叶绿素a、b的浓度，单位为mg/L ，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算a、b总叶绿素的浓度。 仪器：分光光度计、电子天平、棕色容量瓶（如使用白玻容量瓶，可用报纸遮光）、小漏斗、滤纸 试剂：95%乙醇 三、实验步骤 1、试材的采集 采集新鲜植株叶片（或含叶绿素的其他组织），夹于双层报纸中，风干（不能置于太阳光下晒）。将风干材料处理成细小颗粒，装入封口塑料袋，避光保存。 2、待测液的制备 （1）叶绿素的浸提 精密称定风干后的样品（约0.1g）于20mL 95%乙醇中，在室温浸提36-48h。 （2）叶绿素浸提液定容
中国农业科学 2010,43(15):3176-3183 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.15.015 平邑甜茶叶片光合速率及叶绿素荧光参数 对氯化镉处理的响应 王 利1，2，杨洪强1，3，范伟国3，张 召2 （1山东农业大学资源与环境学院农业资源利用博士后流动站，山东泰安 271018；2山东农业大学林学院农业生态与环境重点实验室， 山东泰安 271018；3山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018） 摘要：【目的】研究氯化镉处理对平邑甜茶叶片光系统Ⅱ（PSⅡ）活性、光合速率影响及其相互关系，为进一步揭示镉伤害机理提供理论依据。【方法】平邑甜茶在含不同浓度氯化镉1/2 Hoagland营养液中培养30 d后， 测定其叶片光合速率（Pn）、气孔导度、胞间CO2浓度和荧光参数等，分析氯化镉处理后这些参数间的关系。【结果】 在氯化镉处理下，平邑甜茶叶片光合速率和气孔导度显著降低，胞间CO2浓度增加，300 μs时的叶绿素荧光强度 （Fk）提高，PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm，φPo）、用于电子传递的量子产额（φEo）、光化学性能指数（PI ABS）以及 有活性的反应中心的密度（RC/CS）明显下降，并且这些参数的变化幅度随着氯化镉浓度的增加而提高；通径分析 显示，300 μs时的相对可变荧光强度（V K）及其可变荧光Fv占（J相的荧光强度Fj-O相的荧光强度Fo）振幅的 比例（W K）对Pn的直接作用高于其它荧光参数。【结论】氯化镉使平邑甜茶叶片PSⅡ供体侧、受体侧和反应中心 受到显著伤害，从而降低了PSⅡ活性和光合速率；在氯化镉处理下，V K和W K对Pn的直接作用比较大。 关键词：平邑甜茶；氯化镉；光合速率；光系统Ⅱ；叶绿素荧光 Effect of CdCl2 Treatment on Photosynthetic Rate and Chlorophyll Fluorescence Parameters in Malus hupehensis Leaves WANG Li 1,2, YANG Hong-qiang 1,3, FAN Wei-guo3, ZHANG Zhao2 (1Post-Doctoral Mobile Station of Agricultural Resource Utilization, College of Resources and Environment, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong; 2Key Laboratory of Agricultural Ecology and Environment, College of Forestry, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong; 3State Key Laboratory of Crop Biology/College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong) Abstract: 【Objective】For discovering the mechanism of Cd damage on leaves of Malus hupehensis Rehd., the activity of photosystemⅡ (PSⅡ), net photosynthetic rate (Pn) and their correlation in leaves treated with CdCl2 were studied. 【Method】 After 30 days of treatment by CdCl2 in 1/2 Hoagland solution, the Pn, stomatal conductance (Gs), intercellular CO2 concentration (Ci) and chlorophyll fluorescence parameters in leaves of Malus hupehensis Rehd. were measured, and the relationship between these parameters under CdCl2 treatment were analyzed. 【Result】Under the treatment of CdCl2, the Pn and Gs reduced, the Ci and the fluorescence intensity Fk at 300 μs increased, and the maximum photochemistry efficiency of PSⅡ(Fv/Fm, φPo), the quantum yield for electron transport (φEo) , the performance index on absorption basis (PI ABS) and the density of active reaction center (RC/CS) all decreased significantly. Furthermore, the range of variation of these parameters increased with the increasing of CdCl2 concentration. The direct effect of the relatively variable fluorescence intensity V K and the ratio of variable fluorescence Fv on the amplitude Fj-Fo (W K) at 300 μs for Pn were higher than that of others through the path analysis. 【Conclusion】 CdCl2 damaged the sides of acceptor and donor and the reaction centers of PSⅡ of leaves of Malus hupehensis Rehd. The activity of PSⅡand Pn decreased, and the direct 收稿日期：2009-12-02；接受日期：2010-03-01 基金项目：山东农业大学博士后项目、国家自然科学基金项目（30671452） 作者简介：王利，副教授，博士。E-mail：liwang6868@https://www.doczj.com/doc/9b11963883.html,。通信作者杨洪强，教授。E-mail：hqyang@https://www.doczj.com/doc/9b11963883.html,
植物生理学实验报告实验题目：叶绿素含量的测定 姓名 班级 学号
一、实验原理和目的 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比。叶绿素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。 叶绿素(95%乙醇)在665nm、649nm，类胡萝卜素在470nm有最大吸收峰，根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量 二、实验器具和步骤 植物材料：女贞 实验器具：分光光度计；电子天平；研钵；试管；小漏斗；滤纸；吸水纸；移液管；量筒；剪刀 试剂：95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉 步骤：1.称取剪碎的新鲜样品0.1g 左右，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3～5ml 95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。静置3～5min 2. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到10ml试管中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至10 ml ，摇匀 4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度 5. 计算公式： 叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=13.95A665－6.88A649； Cb=24.96A649－7.32A665 C类=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 单位：mg/L 三、实验数据和作业
2、计算叶绿素含量 计算公式： 叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=13.95A665－6.88A649； Cb=24.96A649－7.32A665 C类=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 单位：mg/L 由上面的公式进行代入计算，有： Ca=13.95*1.820-6.88*0.953=18.83236 Cb=24.96*0.953-7.32*1.820=10.46448 C类=（1000*1.948-2.05*18.83236-114.8*10.46448）/245=2.8901 则：叶绿素含量=（29.29684*10*0.001*1）/0.1=2.9297 四、数据分析 实验中可能清洗研钵和滤纸不是特别干净可能造成误差 五、思考题 为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？答：因为叶绿素存在于叶绿体内囊体上与其上的蛋白质组成色素蛋白复合体，要 分离叶绿素和蛋白质必须有水，叶绿素的头部为极性的，有亲水性