3 讨论
构建真核表达载体首先要根据其用途和基本策略进行严密的实验设计,如果将目的片段和载体质粒分别双酶切后进行连接,会因酶切效果不理想导致缺失。因此本研究采取T 载体克隆的方法将目的片段连入P M D -19T 载体中,然后从P M D -19T 重组载体上酶切下目的片段再与同样经酶切处理的PcDNA3载体进行连接,这样就保证了重组质粒PcDNA3-h LY Z 构建的成功和准确,为研究h LY Z 基因的真核表达奠定了基础[6]。
对上述阳性克隆进行DNA 测序,结果表明扩增的5’和3’调控区与已发表的序列的同源性较高。该调控序列在牛、人和鼠的相应区域进行比较同源性均为97%～100%,说明该调控序列在人、牛和小白鼠上具有较高的保守性[7]。
对于构建特异表达载体来说,5’和3’UTR 的特异启动子和调控系列尤为重要。许多研究证实其酪蛋白基因5’端和3’端UTR 及启动子是乳腺特异表达的关键调控原件。另外,乳蛋白基因UTR 是构建乳腺生物反应器表达载体的核心生物元件[8]。目前已经用于转基因动物乳腺生物反应器的调控元件主要有:β-乳球蛋白基因、aS1和β-酪蛋白调控序列、乳清酸
蛋白基因调控序列和乳清白蛋白基因调控序列[9]
。近二十年的研究证明,以β-乳球蛋白和β-酪蛋白基因调控序列构建的乳腺生物反应器表达载体在绵羊、山羊和奶牛上获得高水平表达,而乳清酸蛋白基因调控序列指导的蛋白则在兔和猪等动物上有较高水平的表达,但各有优缺点[3]。国外研究报道表明酪蛋白是在乳腺的特异表达的蛋白质,是乳腺的主要
蛋白[10]。pC -h LY Z 载体的成功建立为研究酪蛋白基因5’端和3’端的调控序列的调控机理和调控特性提供了一个平台;并用上述牛乳腺特异表达载体表达药用蛋白,建立具有产业开发价值的牛乳腺高效表达技术体系和进一步制作转基因动物奠定了基础。
参考文献:
[1]楼善贤,苗得林.溶菌酶的研究进展[J ].中国肿瘤临床,1994,21
(9):709.
[2]荣晓花,凌沛学.溶菌酶的研究进展[J ].中国生化药物杂志,1999,20(6):319-320.
[3]M aga E A ,Murray J D.M ammary gland expression of transgenes and the po 2tential for altering the properties of m ilk [J ].Biotechnol ,1995,13:1452-1456.
[4]朱秋菊,孙怀昌.鸡输卵管暂态表达人溶菌酶的研究[J ].生物技术通讯,2006,6:11-12.
[5]孙怀昌,于峰,苏建华,等.人溶菌酶基因治疗奶牛乳腺炎的初步研究[J ].畜牧兽医学报,2004,35(2):227-232.
[6]李辉,王希彪.中国动物遗传育种研究进展[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005,08:111.
[7]史瀛仙,季肖东,李光三,等.转基因小鼠的研究[J ].生物工程学报,1999,6(3):205-211.
[8]李宁,昊常信,陈永福.牛aS1酪蛋白基因启动区的克隆和序列分析[J ].遗传,1997,19(1):4-8.
[9]Liu J ,Lin A ,Zhou Y,et al.Expression control of beta -lac -toglobulin gene and iapplication[J ].Biotechnol I nform ation ,2001,3:23-27.
[10]薛京伦,卢大儒.乳腺生物反应器的研究现状[J ].生物技术通报,1998,(3):17-20.
高效表达可溶性重组蛋白表达载体———pHisSUM O
李璐1
,尹成凯2
,李德山
23
(1.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,黑龙江哈尔滨150030;2.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030)
摘要:目的:构建含有I L -1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验证pHisS UM O 表达载体的高效可溶性表达。方法:以质粒pM D18-T -I L -1为模板,利用PCR 获得I L -1基因克隆并将其与表达载体pET 、pTY B 、pHisS UM O 连接,重组质
粒经鉴定后转化到大肠杆菌DH5
α中,并检测其蛋白表达情况。结果:仅在pHisS UM O 表达系统获得了I L -1融合蛋白的高效可溶性表达。利用Ni -NT A 纯化后的融合蛋白经S UM O 蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟蛋白且不残留任何氨基酸残基。结论:实验证明pHisS UM O 表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量。
关键词:pHisS UM O ;高效表达载体;S UM O 蛋白酶
中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2009)03-0011-04
An Expression V ector for E fficient Expression of Soluble R ecombinant
Proteins ———pH isSUMO
LI Lu 1
,YI N Cheng -kai 2
,LI De -shan
23
(1.Life Science and Biotechnique Research Center ,N ortheast Agricutural University ,Harbin 150030,China ;
2.C ollege of Life Science ,N ortheast Agricutural University ,Harbin 150030,China )
Abstract :Objective :T o construct the prokary otic expression plasmid included I L -1gene and detect the result of expression ,to verify pHisS UM O for efficient expression of s oluble recombinant proteins.Method :Plasmid pM D18-T -I L -1was taken as the tem plate firstly ,I L -1gene was cloned by PCR and connected to the expression vector pET ,pTY B and pHisS UM O ,then the recombinant plasmid was identified and trans formed
into E .coli DH5
αcom petence cell ,and the expressed protein w ould be detected.R esult :High yield of the fusion protein was only acquired in pHisS UM O expression system in s oluble form.The human I L -1with high purity was harvested without any additional amino acid residue ,after Ni -affinity chromatography purification and cleavage by S UM O protease Ⅰ.Conclusion :The data show that pHisS UM O expression system is help 2ful to enhance the s olubility and yield of interested proteins.
K ey w ords :pHisS UM O ;high efficient expressive vector ;S UM O protease
收稿日期:2008-11-07;修回日期:2009-03-20基金项目:黑龙江省科技攻关重点项目资助(G B06C315)
作者简介:李璐(1975-),女,硕士,实验师,研究方向:生物制药学;3通讯作者:李德山(1950-),男,博士生导师,教授,从事生物制药学研究,Email :deshanli @https://www.doczj.com/doc/957511139.html, 。
目前,重组蛋白的表达主要是利用大肠杆菌,其具有使用安全、操作简便、周期短且不存在病毒致癌基因污染等优点,是重组蛋白药物研究和生产中使用最广泛的表达系统[1,2]。重组蛋白表达关键的问题是选用合适的表达载体,现已建立
的大肠杆菌表达系统有融合表达、非融合表达、分泌表达、带纯化标签的表达载体等,而融合表达载体又有pET 系列、pTY B 、pGE M 及pGEX 等。表达载体的类型虽多,但选择合适的、满足人们需求的表达载体却很难,如pET 系列载体虽然应用较广泛,但对有些蛋白的表达却不是很理想。而其它一些融合蛋白表达系统蛋白表达量虽然很高,但多数表达的目的蛋白可溶性较差。这就要求我们去寻找更多的高效稳定、可溶性较好的表达系统以满足不同类型基因的表达。
我们在表达I L -1的过程中,发现在大肠杆菌中难以获得高效稳定的可溶性表达,其原因可能在于该蛋白在大肠杆菌
中较易被蛋白酶降解。我们试验过很多表达载体表达效果均不理想,如pET系列表达载体、pTY B-11等表达系统对以上蛋白的表达量极低或者几乎不表达,pGEX6p-1虽然表达量较高,但可溶性目的蛋白所占比例较小。
S UM O(small ubiquitin-like m odifier-1)是一种小分子泛素样修饰蛋白[3,4],广泛存在于各种真核细胞中,参与调节细胞凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周期等多种生理进程[5]。近年来,S UM O被发现可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣,具有抗蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量以及促进靶蛋白正确折叠,提高可溶性等功能[6-8]。小分子泛素样修饰蛋白(S UM O)和泛素(Ub)在一级结构上只有18%的同源性,然而,两者的三级结构及其生物学功能却十分相似[9],研究表明其作为重组蛋白的融合标签可以增加蛋白的稳定性。现本文以I L-1为例,试验pHisS UM O蛋白融合表达系统的应用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:质粒和受体菌:质粒pM D18-T-His-I L-1 (pM D18-T为T aK aRa公司的T载体);pHisS UM O(购于lifeSen2 s ors公司)、pET-30a(+)、PTY B-11载体由本实验室提供;受体菌E.coli DH5α、R osetta(含DE3)由本实验室提供。
克隆pET30a(+)-I L-1引物:
P1上游:5’GGGG AATT C ATGG C ACCTG T ACG A3’Eco RⅠ;
P2下游:5’CCCG T CG ACTT AGG AAG AC AC AAA3’SalⅠ。
克隆pTY B11-I L-1引物:
P3上游:5’AAC AG AAG AG C ACCTG T ACG AT C ACTG AAC3’SapⅠ;
P4下游:5’ACG CG T CG ACTT CC AC ATT C AG C AC A3’SalⅠ。
克隆pHisS UM O-I L-1引物:
P5上游:5’GG T CT C AAGG TG C ACCTG T ACG A T C ACT3’BsaⅠ;
P6下游:5’CGGG AT CCG T AC AG CT CT CTTT A3’Bam HⅠ。1.1.2 试剂
BsaⅠ、Bam HⅠ、SapⅠ、SalⅠ、Eco RⅠ购自New England Bio Labs公司;pM D18-T、dNTPs、其它限制性内切酶、T4DNA连接酶购自T aK aRa公司,S UM O蛋白酶Ⅰ购自Life Sens ors公司。IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷),溶菌酶,卡那霉素购自T aK aRa公司。DNA回收试剂盒,购自上海华舜生物工程有限公司。Ni-NT A琼脂糖颗粒购自QI AGE N公司。
1.1.3 仪器
M illi-QⅡ型纯水仪(美国密理博公司)、-70℃超低温冰箱(日本三洋公司)、Avanti T M30型高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)、DU640紫外分光光度计(美国贝克曼公司)、PT C-200梯度PCR仪(美国伯乐公司)、Cham pgel T M5000凝胶成像系统(美国阿尔法公司)、M A120型垂直板电泳系统(美国伯乐公司)、Labo Autoclave高压灭菌锅(日本三洋公司)、721分光光度计(中国上海第三分析仪器厂)、-20℃冷冻冰柜和4℃冷藏冰箱(中国海尔)。
1.2 方法
1.2.1 融合蛋白表达载体的构建
1.2.1.1 pET-30a(+)表达质粒的构建
以质粒pM D18-T-I L-1为模板,以P1、P2为引物,用rT aq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用SalⅠ和Eco RⅠ双酶切,回收酶切片段;将pET-30a(+)表达载体用SalⅠ和EcoR Ⅰ双酶切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的I L-1PCR产物与pET-30a(+)表达载体的回收产物利用T
4
连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,SalⅠ和Eco RⅠ双酶切鉴定阳性克隆。
1.2.1.2 pTY B-11表达质粒的构建
以质粒pM D18-T-I L-1为模板,以P3、P4为引物,用rT aq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用SapⅠ和SalⅠ双酶切,回收酶切片段;将pTY B-11表达载体用SapI和SalⅠ双酶切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的I L-1PCR产物与pTY B-11表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,SapⅠ和SalⅠ双酶切鉴定阳性克隆。
1.2.1.3 pHisS UM O表达质粒的构建
以质粒pM D18-T-I L-1为模板,以P5、P6为引物,用rT aq酶进行PCR扩增。扩增产物分别用BsaⅠ和Bam HⅠ双酶切,回收酶切片段;将pHisS UM O表达载体用BsaⅠ和Bam H Ⅰ双酶切,回收酶切载体片段,将酶切回收后的I L-1PCR产物与pHisS UM O表达载体的回收产物利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒, XbaⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定阳性克隆。
阳性克隆测序,具体测序方法见CE Q8000操作流程。
1.2.2 目的基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的纯化
将含有正确序列的重组质粒pET-30a(+)-I L-1、pTY B -11-I L-1、pHisS UM O-I L-1转化至表达菌株R osetta。转化后的单菌落分别接种至5m L LB培养基中,37℃培养10h,以1: 100接种于500m L含卡那霉素(50mgΠm L)的LB培养基中,37℃培养2h,A
600
=0.3～0.6时,加入IPTG至终浓度为0.5mm olΠL 进行诱导,诱导3h后分别取少量菌体及未诱导的对照样品进行12%S DS-PAGE[11]电泳。收获pHisS UM O-I L-1转化至表达的菌体进行超声破碎后离心[11],分别取上清和沉淀进行12%S DS-PAGE电泳分析。加入IPTG至终浓度为0.5mm olΠL 进行诱导1h、2h、3h、4h、5h,摸索最佳诱导时间,分别加入IPTG 至终浓度为0.1mm olΠL、0.2mm olΠL、013mm olΠL、0.4mm olΠL、0.5 mm olΠL诱导3h进行浓度梯度诱导,摸索最佳诱导浓度。
菌体经超声破碎后离心,上清经Ni-NT A柱亲和层析,用杂蛋白洗脱液(30mm olΠL咪唑,300mm olΠL NaCl,50mm olΠL NaH2PO4,pH8.0)洗去杂蛋白后,用洗脱液(250mm olΠL咪唑, 300mm olΠL NaCl,50mm olΠL NaH2PO4,pH8.0)洗脱融合蛋白,收集洗脱的第一、二峰。取融合蛋白5μl进行S DS-PAGE电泳分析。
1.2.3 融合蛋白的切割
将方法1.2.2收集的pHisS UM O-I L-1融合蛋白(浓度为1mgΠml)经P BS透析24h后,以每10μg融合蛋白:1U S UM O蛋白酶Ⅰ的比例加入S UM O蛋白酶Ⅰ,DTT终浓度为2mm olΠL, 4℃切割过夜,并取样进行15%S DS-PAGE检测。
1.2.4 成熟蛋白的纯化
切割后产物经P BS缓冲液透析以除去切割液,再经Ni-NT A颗粒亲和层析,收集惟一的洗脱峰,即为I L-1成熟目的蛋白,用洗脱液(250mm olΠL咪唑,300mm olΠL NaCl,50mm olΠL NaH2PO4,pH8.0)洗脱Ni-NT A颗粒结合的小泛素相关修饰物蛋白,15%S DS-PAGE电泳检测。
2 结果与分析
2.1 pM D18-T-I L-1插入片段克隆
以质粒pM D18-T-I L-1为模板,以P1、P2为引物进行PCR扩增后,产物大小为450bp左右与预期产物大小相符(如图1)。
测序结果(略)与G enebank发表序列一致459bp。
2.2 融合蛋白表达载体的构建
将胶回收的I L-1基因序列与线性化的pET-30a(+)表达载体、pTY B-11表达载体、pHisS UM O表达载体连接。重组表达载体pHisS UM O-I L-1经XbaⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定后,获得产物为450bp左右的条带,重组表达载体pTY B-11-I L-1经SapⅠ和SalⅠ双酶切鉴定得到450bp左右的条带,重组表达载体pET30a(+)-I L-1经SalⅠ和Eco RⅠ双酶切鉴
定得到450bp 左右的条带,与预期一致(图2)。DNA 测序结果表明与G enebank 发表序列一致。融合蛋白表达载体构建成功
。
图1 I L -1基因的PCR 扩增
1:D L2000DNA ladder ;2:The PCR products with the primer P1and
P2.
图2 酶切鉴定结果
1:100bp DNA M arker ;2:pHisS UM O -I L -1;3:pHisS UM O -I L -1ΠXba Ⅰ+Bam H Ⅰ;4:pTY B -11-I L -1;5:pTY B -11-I L -1ΠSap Ⅰ+Sal Ⅰ;6:pET -30a (+);7:pET -30a (+)ΠSal Ⅰ+Eco R Ⅰ.
2.3 pHisS UM O -I L -1融合蛋白的表达
将含有重组质粒pHisS UM O -I L -1、pTY B -11-I L -1、pET -30a (+)-I L -1的R osetta 菌株接种后诱导,加入IPTG 诱导3h 后取样电泳分析,结果显示pTY B -11、pET -30a (+)系统未能表达I L -1,而融合蛋白在pHisS UM O 表达载体中表达量较高,且均为可溶性蛋白(如图3),纯化后的pHisS UM O -I L -1融合蛋白上样量为5μl (浓度约为1mg Πml ),其分子量约
为37000Da (见图4)
。
图3 I L -1在各表达系统中的蛋白表达分析
1:protein m olecular mass marker ;2:pHisS UM O ;3:supernatant of R osetta cells
harboring pHisS UM O -Express -I L -13hours after IPTGinduction ;4:precipi 2tate of R osetta cells harboring pHisS UM O -Express -I L -13hours after IPTG induction ;5:supernatant of R osetta cells harboring pTY B -11I L -13hours af 2ter IPTG induction ;6:precipitate of R osetta cells Harboring pTY B -11I L -13hours after IPTG induction ;7:supernatant of R osetta cells harboring pET 30a (+)-I L -13hours after IPTG induction ;8:precipitate of R osetta cells Har 2boring pET 30a (+)-I L -13hours after IPTG induction.
2.3.1 pHisS UM O -I L -1融合蛋白时间梯度诱导
从电泳结果分析,蛋白的表达量并不是随着时间的延长表达量逐渐增加。在未诱导时,无表达,3h 以前表达量逐渐增大,当诱导至3h 时,蛋白质的表达量最大,以后表达量无显著
增加。由此推出最佳诱导时间为3h 。2.3.2 pHisS UM O -I L -1融合蛋白IPTG
浓度梯度诱导
图4 融合蛋白表达时间梯度分析
1:supernatant of R osetta cells harboring pHisS UM O -I L -1without IPTG in 2duction ;2:supernatant of R osetta cells harboring pHisS UM O -I L -11hours after IPTG induction ;3:supernatant of R osetta cells harboring pHisS UM O -I L -12hours after IPTG induction ;4:protein m olecular mass marker ;5:super 2natant of R osetta cells harboring pHisS UM O -I L -13hours after IPTG induc 2tion ;6:supernatant of R osetta cells harboring pHisS UM O -I L -14hours after IPTG induction ;7:supernatant of R osetta cells harboring pHisS UM O -I L -15hours after IPTG induction.
从IPTG 浓度梯度诱导表达结果分析,随着IPTG 终浓度的
增加,融合蛋白的表达量也逐渐增加,当增加到0.5mm ol ΠL 时,蛋白的表达基本稳定不再增加,确定IPTG 终浓度015mm ol ΠL 为最佳诱导剂量
。
图5 融合蛋白表达IPTG 浓度梯度分析
1,2,3:pHisS UM O -I L -1induced at concentration IPTG 0.1mm ol ΠL ,0.2mm ol ΠL ,0.3mm ol ΠL f or 3h ;Lane 4:Protein m olecular weight standards ;Lane 5,6:pHisS UM O -I L -1induced at concentration IPTG0.4mm ol ΠL ,0.5mm ol ΠL for 3h ;Lane 7:pHisS UM O induced at concentration IPTG 1.0mm ol ΠL for 3h.
2.4 pHisS UM O -I L -1
融合蛋白的纯化
图6 pHisS UM O -I L -1的纯化
1:Purified pHisS UM O -I L -1protein ;2:Protein M arker.
2.5 融合蛋白的切割与成熟蛋白的纯化
pHisS UM O -I L -1融合蛋白经蛋白酶切割效率较高,切割后的产物,置于P BS 缓冲液中透析24h ,再经Ni -NT A 颗粒亲和层析,收集惟一的洗脱峰,即为I L -1成熟蛋白,15%S DS -PAGE 电泳检测。(图7)。
图7 S UM O融合蛋白切割后的S DS-PAGE电泳分析
1:pHisS UM O-I L-1fusion protein;2:Protein M arker;3:The products of pHisS UM O-I L-1fusion protein after cut with S UM O proteaseⅠ;4:Purified I L-1.
3 讨论
本实验构建了pET、pTY B和pHisS UM O表达系统,并利用pHisS UM O表达系统成功地表达和纯化了I L-1,利用S UM O蛋白酶Ⅰ切割获得了具有纯度较高的成熟蛋白。由于S UM O蛋白酶Ⅰ和S UM O蛋白引入了多聚组氨酸,可以与Ni-NT A琼脂糖颗粒结合,因此可以利用Ni-NT A亲和层析分离出有活性的成熟蛋白。
I L-1在大肠杆菌中难以获得高效可溶性表达,最初我们使用pET系列和pTY B表达系统,但目的蛋白表达量极低。而通过分子伴侣进行融合表达如pGEX表达系统(结果略),尽管可以提高蛋白的表达量以及成熟蛋白的收获率,但多数融合蛋白是以包涵体的形式表达,复性比较困难,在此过程中我们也摸索了很多诱导条件,但表达效果均不理想。
S UM O近年来被发现可用作分子伴侣来增加外源蛋白的稳定性和可溶性,其作用机理可能是S UM O蛋白作为一个高度疏水的核心为目的蛋白的折叠提供成核位点[11-13],促进蛋白间的相互作用并使其正确折叠,最终增强了融合蛋白的可溶性[14]。时间对于融合蛋白pHisS UM O-I L-1的诱导表达量影响较大、诱导3h,4h时蛋白表达量较高,当诱导过夜时融合蛋白含量较少推测可能被菌体内的蛋白酶降解了。为避免纯化时杂蛋白含量较高,我们选择了诱导3h,并制备出纯度较高的融合蛋白。并且该融合蛋白在利用S UM O蛋白酶Ⅰ进行切割时可保证无氨基酸残留,不影响蛋白活性。
pHisS UM O表达载体是蛋白表达纯化领域中的一个新的表达体系,其优点为表达产物可溶且表达量高,现已成功地表达了很多传统情况下难以表达或可溶性不好的重组蛋白。为生物技术领域中重组蛋白的研究和应用提供了有用的工具。
参考文献:
[1]Baneyx F.Recombinant protein expression in E scherichia coli[J].Curr Opin Biotechnol.,1999,10:411-421.
[2]M akrides S C.S trategies for achieving high-level expression of genes in
E scherichia coli[J].Micobiol R ev,1996,60:512-538.
[3]韦玮,张浩,毛建平,等.蛋白质S UM O化修饰研究进展[J].中国生物工程杂志,2008,28(7):122-126.
[4]G resko E,M oiler A,R oscic A,et al.C ovalent m odification of human ho2 meodomain interacting protein kinase2by S UM O-1at lysine25affects its sta2 bility[J].Biochem Biophys R es Commun,2005,329:1293-1299.
[5]M arblestone J G,Edavettal SC,Lim Y,et al.C om paris on of S UM O fusion technology with traditional gene fusion systems:Enhanced expression and s olu2 bility with S UM O[J].Protein Science,2006,15:182-189.
[6]Butt TR,Edavettal SC,Hall JP,et al.S UM O fusion technology for diffi2 cult-to-express proteins[J].Protein Expr Purif.,2005,43(1):1-9. [7]X iang-D ong Li,Y ang Shen,Y a-Feng Qiu,et al.S UM Oylation:An Im2 portant P ost-translational M odification in Viv o[J].Chinese Journal of Cell Biology,2008,30:142-146.
[8]肖业臣,秦玉侠,解佳森等.Sum o分子伴侣与富含二硫键的抗真菌肽Drs基因的融合有助于其可溶性表达[J].中国生物工程杂志,2007, 27(12):22-25.
[9]M alakhov MP,M attern MR,M alakhov OA,et al.S UM O fusions and S U2 M O-specific protease for efficient expression and purification of proteins[J]. Struct Funct G en,2004,5:75-86.
[10]Sambrook J,FritschEF,M anutus T.M ogecular Cloning,A Laboratory M anual[M].2nd ed.New Y ork:C old S pring Harbor Labo-ratary Press,1989, 9:880-898.
[11]Zuo X,M attern M R,T an R,et al.Expression and purification ofS ARS coronavirus proteins using S UM O-fusions[J].Protein Expression and Purifi2 cation,2005,42(1):100-110.
[12]M ossess ova E S.M olecular analysis of Ulp1protease and its substrate,the ubiquitin-likem odifier S UM O,Durham:Bell&H owell In formation and Learn2 ing C om pany,2001:21-22.
[13]Johns on E S.Protein m odification by S UM O[J].Annu al R eview of Bio2 chemistry,2004,73:355-382.
[14]M ichael PM,M ichael RM,Oxana AM,et al.S UM O fusions and S UM O-specific protease for efficient expression and purification of proteins[J].Jour2 nal of Structural and Functional G enomics,2004,5(3):75-86.
不同修饰对壳聚糖转基因效果的影响
李轶杰,蔡文萍,张富春3
(新疆大学生命科学与技术学院,新疆生物资源基因工程重点实验室,新疆乌鲁木齐830046)摘要:目的:探讨不同修饰的壳聚糖包裹的质粒(Chi-DNA)纳米复合物在口服发送中外源基因在消化道中的表达差异。方法:分别使用明胶、海藻酸钠、PEG及乙酰化修饰包裹含LacZ的质粒pC M Vβ的壳聚糖纳米颗粒,通过口服发送后经X-gal染色检测目的基因在小鼠体内的表达。结果:修饰后的Chi-DNA纳米复合物都能抵抗胃酸的降解0.5h以上,其中PEG及乙酰化修饰的Chi-DNA纳米复合物在胃酸处理1h时仍有部分残留。X-gal染色显示,修饰后的Chi-DNA纳米复合物都有β半乳糖苷酶的表达,其中PEG、海藻酸钠修饰的Chi-DNA纳米复合物在鼠胃和小肠中表达量最高。结论:PEG、海藻酸钠修饰的Chi-DNA纳米复合物有望成为高效的基因治疗用非病毒口服发送系统。
关键词:壳聚糖;修饰;纳米复合物;基因转染
中图分类号:R944 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2009)03-0014-03
E fficiency of Different Modify of Chitosan on G ene Transfection
LI Y i-jie,C AI Wen-ping,ZH ANG Fu-chun3
(X injiang K ey Laboratory of Biological Res ources and G enetic Engineering,C ollege of Life Science and T echnology,X injiang University,Urumqi830046,China) Abstract:Objective:T o investigate the efficiency of different m odification of Chitosan-DNA nanoparticles on gene trans fection by oral delivery. Method:Oral administration of DNA nanoparticles synthesized by com plexing pC M VβDNA with chitosan,which m odified with gelatin,S odium Alginate,PEG and acetylize respectively,resulted in transduced gene expression in the intestinal epithelium.The tissues were stained with X-G al according to standard protocols.R esult:C om pared with different nanoparticles to resist m ouse gastric juice showed that the m odification of DNA nanoparticles had g ood stability and although mice fed‘naked’DNA showed s ome background staining,mice fed the DNA nanoparticles m odified with S odium Alginate or PEG showed a higher level of gene expression in both the stomach and the small intestine than others.Conclu2
融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录
融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 张宁
1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物具有什么样的功能分子量和聚合状态是膜蛋白还是水溶蛋白胞内表达还是分泌表达是否需要以及需要何种翻译后修饰有没有配体、底物或产物类似物可以利用对蛋白酶是否敏感有多少分子内及分子间二硫键对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用范围。 大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞 流程简单简单复杂复杂 培养基简单简单复杂复杂 成本低低中高 产率高中中低 表达量高高较高较低 蛋白折叠中较好较好好 胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基 细胞增殖周期30min90min18H24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确 二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有 磷酸化无有有有 酰化无有有有 γ-羧基化无无无有 适用原核蛋白、简单 真核蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 复杂高等真核生 物蛋白 表1：常用表达系统比较 2. 原核表达系统 原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。 表达菌株 原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、
在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。 如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。 自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极促进了对重组蛋白的有效纯化。 根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。 短肽标签： His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
抗体制备: 合成多肽抗原 抗体制备：合成多肽抗原 synthetic peptide recombinant fragment 目前抗体制备常采用多肽抗原及重组蛋白质抗原，这两种方法各有优缺点，需结合实验需求进行选择。 重组蛋白质抗原上往往带有多个不同的抗原决定簇，其中有些是顺序决定簇，有些为结构决定簇。利用变性的抗原免疫动物获得多克隆抗体是针对各个抗原决定簇的抗体的混合物，在一般应用中能够用于检测天然结构或变性的目标蛋白。利用变性蛋白做为免疫原的一个附带的好处是变性蛋白往往有更强的免疫原性，能够刺激动物产生强的免疫应答。 用做抗原目的的蛋白质一般选择使用大肠杆菌表达体系，因为该体系时间与金钱成本最低。为了提高目标蛋白质表达的可能性与纯化的方便性，人们有时只表达目标蛋白的一个小的片段如特定的结构域。大肠杆菌系统是欣百诺最早建立的成熟表达体系，有一系列设计完美的表达载体与非常成熟的表达培养条件，能够在较短时间内获得基因表达产物，且所需的成本相对较低。 如果制备抗体的目的单纯用于wb检测，采用合成的小肽作为抗原是经济快速的，但是存在由于肽段选择不合适造成的免疫原性弱或者无反应原性的风险，由于抗体制备需要较长的周期，因此利用多肽抗原制备抗体时，常常选取两三段不同的肽段以保证实验的成功率。 ·抗体制备（合成多肽抗原）——步骤1. 多肽合成 免疫用的多肽抗原纯度要求大于80%，更高的纯度虽然理论上可以获得特异性更好的抗体，实际操作过程中动物总是要产生大量非特异性抗体，从而掩盖了抗原纯度所带来的收益。 客户需要提供的材料： 委托我们合成时请提供您的目标多肽序列或蛋白质序列，由我们与你讨论决定具体采用的序列。 提供客户：合成好的多肽，多肽高效液相图谱 时间：2周 ·抗体制备（合成多肽抗原）——步骤2. KLH交联 用小片段多肽制备抗体时必须交联到适当的载体抗原上以增强其免疫原性。我们提供KLH与白蛋白两种抗原载体。 客户需要提供的材料： 若多肽由客户提供，要求多肽量大于5毫克，N端或C端加入一个半胱氨酸，长度在10-15氨基酸。 提供客户：交联好的蛋白或直接用于下一步免疫 时间：3个工作日
原核蛋白可溶性表达策略及实验方案 可溶性表达策略 大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。 因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。 降低重组蛋白合成的速率 可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。 密码子优化 密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。 启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。 表达温度的选择
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白使用说明书 【药品名称】 通用名：注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白 商品名：强克 英文名：Recombinant Human TNF Receptor-Ig Fusion Protein for Injection 汉语拼音：Zhusheyong Chongzu Ren Erxing Zhongliuhuaisiyinzi Shouti －Kangti Ronghedanbai 【性状】 本品为无菌白色冻干粉针剂。 【主要成分】 每瓶含重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25毫克，甘露醇40毫克，蔗糖10毫克，三羟甲基氨基甲烷1.2毫克。用1毫升灭菌注射用水溶解。【药理毒理】 1.药理重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白是一个二聚体的融合蛋白，包含人75KDa肿瘤坏死因子受体（TNFR）（p75）的细胞膜外配体结合部分与人IgG1的Fc片段，包含934个氨基酸，表观分子量约为150K道尔顿（KDa）。 TNF是机体自然产生的一种细胞因子，参与正常的炎症和免疫反应。在强直性脊柱炎关节病变的炎症反应中，TNF起着重要的作用。TNF存在55KDa蛋白（p55）和75KDa蛋白（p75）两类受体，它们均以单体的形式存在于细胞表面。TNF的生物学活性取决于它与细胞表面两类受体分子的结合。 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的作用机制是竞争性地与TNF 结合，阻止TNF与细胞表面TNF受体的结合，抑制TNF的生物学活性。 2.毒理小鼠急性毒性试验结果显示，静脉注射1.09g/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见毒性反应。猴长期毒性试验结果显示，每周2次连续皮下注射180天15.0 mg/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见有明显的毒性。 【药代动力学】
重组蛋白纯化概述 蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分，尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中，上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离，充分利用上游对下游的影响，对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。是否带有亲和标签，His标签，GST标签等，不同的亲和标签选择不同的纯化方案；可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低；是否对宿主细胞具有毒性，从而选择抗毒性的表达系统；怎样选择表达系统，是大肠杆菌表达系统，酵母表达系统还是CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统；蛋白的化学性质，是否容易被蛋白酶降解，是否会和一些金属离子，化学成分发生反应；蛋白的物理性质，是否对温度敏感等。从蛋白基因的获取，蛋白基因的克隆，蛋白的表达，做好一个整体的规划，将对纯化工作的方便快捷高效带来关键的影响。 基因工程构建的纯化标记有很多，通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。GST融合载体，蛋白A融合载体，含组氨酸标记（Histidine-tagged）等，不同亲和标签的蛋白有不同的纯化方案。 一．含组氨酸标记（Histidine-tagged）重组蛋白的纯化（一）选择亲和标签时需要考虑的因素 亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，需要综合的考虑，既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。（1）亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能，大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小，而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。（2）亲和标签对蛋白质稳定性的影响，亲和标签的加入是否会影响到目标蛋白的真确折叠，是促进目标蛋白的可溶性，还是容易形成包涵体，会不会造成氨基酸C和N段地破坏，使目的蛋白表达不完全。（3）亲和标签所融合的位置，亲和标签可以加在N端，可以加在C端，也进行串联。多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要，所以在N端进行融合标签的融合常常能保留蛋白质的生物学功能。由于N 端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大，所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大，优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。可能有些蛋白纯化后需要去除亲和标签C端融合在去除融合标签后在目标蛋白的C端会有几个氨基酸残留，而小心的选择剪切特异性的氨基酸序列就可以在去除N端亲和标签后得到天然的目标蛋白。（4）亲和洗脱的条件，有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选择的亲和表达系统应该不使目标蛋白变性。 （二）含组氨酸蛋白纯化的依据 蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu 2+ ，Zn 2+ ，Ni 2+ ，Co 2+ ，Fe 3+ 形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化
重组蛋白的概述 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎 表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空 间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生 长没有大的影响，通常可获得高的 表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的
《重组结核杆菌融合蛋白（EC）临床应用专家共识》（2020）要点 结核分枝杆菌（MTB）感染和菌阴肺结核的准确诊断是结核病防控的两个难点和重要问题。重组结核杆菌融合蛋白（EC）是通过基因工程方法表达MTB特异的ESAT-6和CFP-10两种蛋白的融合蛋白，这两种蛋白在卡介苗菌株中缺失，可诱导特异的迟发型变态反应(DTH)以鉴别MTB感染状态。在传染病国家科技重大专项支持下自主研发的EC，已作为新型MTB 感染皮肤试验的检测试剂通过了国家药品监督管理局药品审批而准予上市在当前我国结核病疫情防控形势下，EC对MTB感染和菌阴肺结核的诊断具有重要的应用价值。 一、全球结核病疫情形势 结核病是由MTB感染引起的慢性传染病，严重威胁人类健康，位列全球十大死因之一，是单一传染病中的头号杀手。中国是结核病高负担国家之一。研究结核感染诊断新技术、新方法对加速结核病疫情下降、实现终止结核病目标具有十分重要的意义。 二、结核感染与发病 LTBI的定义是一种对MTB抗原刺激具有持续免疫反应的状态，但没有活动性结核病的临床表现证据，有时也叫结核感染。LTBI没有病原学诊断依据，只能通过检测机体的免疫反应来诊断。《中国结核病预防控制工作技术规范（2020年版）将结核感染检测和预防纳入结核病预防治疗的重要内容。 结核病诊断的另一个瓶颈是菌阴肺结核的诊断，而儿童结核病多表现为菌
阴肺结核。我国发布的《WS288-2017肺结核诊断》中，将TST、IGRA 和血清抗体检测都纳入了肺结核辅助诊断的方法,其目的是通过提供结核感染证据提高菌阴肺结核的诊断水平。EC是主要针对解决LTBI诊断和菌阴肺结核的辅助诊断等问题而研发的新产品。 三、现行结核感染的免疫学检测方法 （一）TST TST是基于型DTH的一种皮肤试验%常用的反应原是纯蛋白衍生物(PPD)。我国1979--2000年进行的4次全国结核病流行病学调查都采用TST作为儿童结核感染筛查的手段。由于PPD有200多种抗原成分，与卡介苗和非结核分枝杆菌（NTM）有大量相同或相似的抗原成分,导致TST 很容易发生交叉反应。因此，TST出现假阳性的可能性较大,特别是在非结核分枝杆菌（NTM）的高流行地区。 (二)IGRA 机体感染MTB以后，血液中存在着特异的效应K淋巴细胞。当机体再次接触MTB特异性抗原时，效应K淋巴细胞将特异性地产生和分泌γ干扰素(IFN-γ)通过定量检测释放的IFN-γ的水平或计数,来判定患者是否存在LTBI。由于其特异度较高，在临床菌阴肺结核和肺外结核的个体确认方面具有较高的应用价值。 (三)抗原抗体检测 该方法也已纳入我国《WS288-2017肺结核诊断》,作为菌阴肺结核的辅助诊断 技术。
3 讨论 构建真核表达载体首先要根据其用途和基本策略进行严密的实验设计,如果将目的片段和载体质粒分别双酶切后进行连接,会因酶切效果不理想导致缺失。因此本研究采取T 载体克隆的方法将目的片段连入P M D -19T 载体中,然后从P M D -19T 重组载体上酶切下目的片段再与同样经酶切处理的PcDNA3载体进行连接,这样就保证了重组质粒PcDNA3-h LY Z 构建的成功和准确,为研究h LY Z 基因的真核表达奠定了基础[6]。 对上述阳性克隆进行DNA 测序,结果表明扩增的5’和3’调控区与已发表的序列的同源性较高。该调控序列在牛、人和鼠的相应区域进行比较同源性均为97%～100%,说明该调控序列在人、牛和小白鼠上具有较高的保守性[7]。 对于构建特异表达载体来说,5’和3’UTR 的特异启动子和调控系列尤为重要。许多研究证实其酪蛋白基因5’端和3’端UTR 及启动子是乳腺特异表达的关键调控原件。另外,乳蛋白基因UTR 是构建乳腺生物反应器表达载体的核心生物元件[8]。目前已经用于转基因动物乳腺生物反应器的调控元件主要有:β-乳球蛋白基因、aS1和β-酪蛋白调控序列、乳清酸 蛋白基因调控序列和乳清白蛋白基因调控序列[9] 。近二十年的研究证明,以β-乳球蛋白和β-酪蛋白基因调控序列构建的乳腺生物反应器表达载体在绵羊、山羊和奶牛上获得高水平表达,而乳清酸蛋白基因调控序列指导的蛋白则在兔和猪等动物上有较高水平的表达,但各有优缺点[3]。国外研究报道表明酪蛋白是在乳腺的特异表达的蛋白质,是乳腺的主要 蛋白[10]。pC -h LY Z 载体的成功建立为研究酪蛋白基因5’端和3’端的调控序列的调控机理和调控特性提供了一个平台;并用上述牛乳腺特异表达载体表达药用蛋白,建立具有产业开发价值的牛乳腺高效表达技术体系和进一步制作转基因动物奠定了基础。 参考文献: [1]楼善贤,苗得林.溶菌酶的研究进展[J ].中国肿瘤临床,1994,21 (9):709. [2]荣晓花,凌沛学.溶菌酶的研究进展[J ].中国生化药物杂志,1999,20(6):319-320. [3]M aga E A ,Murray J D.M ammary gland expression of transgenes and the po 2tential for altering the properties of m ilk [J ].Biotechnol ,1995,13:1452-1456. [4]朱秋菊,孙怀昌.鸡输卵管暂态表达人溶菌酶的研究[J ].生物技术通讯,2006,6:11-12. [5]孙怀昌,于峰,苏建华,等.人溶菌酶基因治疗奶牛乳腺炎的初步研究[J ].畜牧兽医学报,2004,35(2):227-232. [6]李辉,王希彪.中国动物遗传育种研究进展[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005,08:111. [7]史瀛仙,季肖东,李光三,等.转基因小鼠的研究[J ].生物工程学报,1999,6(3):205-211. [8]李宁,昊常信,陈永福.牛aS1酪蛋白基因启动区的克隆和序列分析[J ].遗传,1997,19(1):4-8. [9]Liu J ,Lin A ,Zhou Y,et al.Expression control of beta -lac -toglobulin gene and iapplication[J ].Biotechnol I nform ation ,2001,3:23-27. [10]薛京伦,卢大儒.乳腺生物反应器的研究现状[J ].生物技术通报,1998,(3):17-20. 高效表达可溶性重组蛋白表达载体———pHisSUM O 李璐1 ,尹成凯2 ,李德山 23 (1.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,黑龙江哈尔滨150030;2.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030) 摘要:目的:构建含有I L -1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验证pHisS UM O 表达载体的高效可溶性表达。方法:以质粒pM D18-T -I L -1为模板,利用PCR 获得I L -1基因克隆并将其与表达载体pET 、pTY B 、pHisS UM O 连接,重组质 粒经鉴定后转化到大肠杆菌DH5 α中,并检测其蛋白表达情况。结果:仅在pHisS UM O 表达系统获得了I L -1融合蛋白的高效可溶性表达。利用Ni -NT A 纯化后的融合蛋白经S UM O 蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟蛋白且不残留任何氨基酸残基。结论:实验证明pHisS UM O 表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量。 关键词:pHisS UM O ;高效表达载体;S UM O 蛋白酶 中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2009)03-0011-04 An Expression V ector for E fficient Expression of Soluble R ecombinant Proteins ———pH isSUMO LI Lu 1 ,YI N Cheng -kai 2 ,LI De -shan 23 (1.Life Science and Biotechnique Research Center ,N ortheast Agricutural University ,Harbin 150030,China ; 2.C ollege of Life Science ,N ortheast Agricutural University ,Harbin 150030,China ) Abstract :Objective :T o construct the prokary otic expression plasmid included I L -1gene and detect the result of expression ,to verify pHisS UM O for efficient expression of s oluble recombinant proteins.Method :Plasmid pM D18-T -I L -1was taken as the tem plate firstly ,I L -1gene was cloned by PCR and connected to the expression vector pET ,pTY B and pHisS UM O ,then the recombinant plasmid was identified and trans formed into E .coli DH5 αcom petence cell ,and the expressed protein w ould be detected.R esult :High yield of the fusion protein was only acquired in pHisS UM O expression system in s oluble form.The human I L -1with high purity was harvested without any additional amino acid residue ,after Ni -affinity chromatography purification and cleavage by S UM O protease Ⅰ.Conclusion :The data show that pHisS UM O expression system is help 2ful to enhance the s olubility and yield of interested proteins. K ey w ords :pHisS UM O ;high efficient expressive vector ;S UM O protease 收稿日期:2008-11-07;修回日期:2009-03-20基金项目:黑龙江省科技攻关重点项目资助(G B06C315) 作者简介:李璐(1975-),女,硕士,实验师,研究方向:生物制药学;3通讯作者:李德山(1950-),男,博士生导师,教授,从事生物制药学研究,Email :deshanli @https://www.doczj.com/doc/957511139.html, 。 目前,重组蛋白的表达主要是利用大肠杆菌,其具有使用安全、操作简便、周期短且不存在病毒致癌基因污染等优点,是重组蛋白药物研究和生产中使用最广泛的表达系统[1,2]。重组蛋白表达关键的问题是选用合适的表达载体,现已建立 的大肠杆菌表达系统有融合表达、非融合表达、分泌表达、带纯化标签的表达载体等,而融合表达载体又有pET 系列、pTY B 、pGE M 及pGEX 等。表达载体的类型虽多,但选择合适的、满足人们需求的表达载体却很难,如pET 系列载体虽然应用较广泛,但对有些蛋白的表达却不是很理想。而其它一些融合蛋白表达系统蛋白表达量虽然很高,但多数表达的目的蛋白可溶性较差。这就要求我们去寻找更多的高效稳定、可溶性较好的表达系统以满足不同类型基因的表达。 我们在表达I L -1的过程中,发现在大肠杆菌中难以获得高效稳定的可溶性表达,其原因可能在于该蛋白在大肠杆菌
实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定 一、实验内容 1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。 2．重组蛋白的Western boltting鉴定。 二、实验要求 通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。 三、实验方法 1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析 （1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。 （3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。 （4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。 （5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。 （6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。 2．Western blot分析 （1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。 （2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。 a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。 b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。 c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、 凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。 d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。 （3）杂交 a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。 b.TBST漂洗3 × 10 min c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中， 室温反应1 hr。 d.TBST漂洗3 × 10 min e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建 1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon 和ompT两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL，Rosetta (DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫
1.表达工程菌 蛋白可溶性表达很大原因取决于二硫键和正确折叠的问题，所以选用利于二硫键形成的宿主菌，如Origami(DE3), Origami B(DE3),Rosetta Origami(DE3) 等更利于蛋白表达。 2.促溶标签 前文的列表中已经详细列出，并简要介绍功能特点，值得注意的是选用促溶标签时，一定要考虑载体情况和表达工程菌的配合，如Trx标签主要是促进二硫键的配对，必须配合Origami(DE3)之类的工程菌使用，如果使用BL21(DE3)通常不会使目标蛋白的可溶性得到改善。 3.分子伴侣表达 在表达工程菌内同时装入一个表达伴侣蛋白的表达质粒，表达伴侣蛋白的质粒必须与表达外源蛋白的质粒避免“质粒不相容性”。目前，常用于大肠杆菌表达的分子伴侣主要是DNak(DnaJ,GrpE)和 GroEL(GroES)等，科研人员可根据自己的实验需要构建合适的分子伴侣质粒，含分子伴侣质粒的感受态细胞已经有商业化的产品BL21(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)系列,实验人员可以根据具体情况选购。 4.启动子选择 载体的启动子对于可溶性表达影响至关重要，pET系列的 T7/T7 lac为强启动子，强启动子在提高蛋白产量的同时也增强了包涵体的形成，如果遇到此种情况可以考虑换用弱启动子的载体，如pGEX系列，还可选择含cspA启动子的pCold系列载体。 5.分泌性表达 将外源目标蛋白分泌表达到培养基中，实现这个功能需要将原核蛋白信号肽序列加到外源蛋白的上游即可；目前，福因德生物已经开发出pFRD-pelB系列载体，可以帮助实现在大肠杆菌中分泌表达。 6.培养条件的优化 最常用的优化条件为：诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间；还可以优化培养基的营养成分和离子物质，比如，我们使用营养成分稍低的LB培养基，可同时向培养基中添加葡萄糖，镁离子、氯化钠、硫酸铵等盐离子。 1）低温诱导:比如20℃,低温情况下,转录和翻译变慢,蛋白质浓度低,有更多的时间正确折叠； 2）向培养基中加入0.4M蔗糖，高渗引起了渗透性休克反应，该反应增加了细胞内谷氨酸、脯氨酸和海藻糖的水平，为蛋白的正确折叠提供了环境； 3）42℃短暂热休克，然后降温到20℃：热休克增加了DnaK/J和GroEL/ES的水平，通常的程序是37℃培养到A600nm=0.5,然后快速升温到42℃维持15min左右，然后降到20℃并诱导蛋白的表达。 4）自诱导培养基，适合于T7启动子系列的诱导表达，当工程菌增长到一定密度后，自己缓慢开启诱导开