重组蛋白的概述
1.概述
分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点
表达策略优点缺点
分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成
降低蛋白酶对表达蛋白的降解
可获得确定的N末端
显著减少杂蛋白水平，简化纯化
不需要细胞破碎
表达水平低
多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩
细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成
可获得确定的N末端
显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空
间蛋白的技术
周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解
胞内包涵体表达包涵体易于分离
保护蛋白质不被降解
蛋白质不具有活性对宿主细胞生
长没有大的影响，通常可获得高的
表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端
胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠
一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化
可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端
在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。
蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的
初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/mol范围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋白质内在的不稳定性，保留蛋白的活性。这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要，影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等，这些因素对折叠的影响有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之间也有影响，在实际处理中应选择合适的条件，尽量避免不利因素的影响（2），并利用活性跟踪的方法对处理进行评价，指导分离纯化。
在进行任何纯化工作时，第一步必须针对目标蛋白建立特异性的分析方法。这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫学活性，物理特性（如分子量、等电点、光谱学特征等），生物学活性。在理想的情况下，我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏和可定量的特点。特异性要求分析方法反映目标蛋白的独特性，以排除假阳性。快速则要求能很快的给出定性和定量结果，以便更好的与分离纯化的工作相衔接。灵敏的分析方法仅需要少量的样品，这就给操作带来了极大的方便。在分离纯化的每一步，都需要对蛋白和活性进行定量，这就要求分析方法有准确可定量的特点，以对分离纯化的效果进行评价。如通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质，由于电泳的分辨率限制，常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或目标蛋白是否得到了富集，这时就需要运用更特异的分析方法，如Western blotting 就可以从复杂的混合物中描述蛋白的分子量，并对蛋白进行定量。另外当一些蛋白没有方便可用的生物学活性测定方法，或者由于干扰物质的存在不能测活，可应用一些免疫学的方法进行检测。在纯化的过程中，需要监测以下几个参数：总的样品体积，样品中总的蛋白，目标蛋白的活性单位，通过这些基本的信息，就可以跟踪每步纯化的效率，计算出目标蛋白的回收率，目标蛋白的比活性，以及纯化的倍数，从而对纯化的每一步，乃至整个流程进行定量评价。Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶σ32亚基的工作中给出了很好的范例，在定量测定项中，包括了蛋白质的定量测定、定量SDS-PAGE、定量蛋白质斑点印迹和酶活测定，使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价，从而确保每一步纯化的有效性（1）。正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用，所以有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。
重组蛋白表达纯化的基本策略
的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
分离方法的选择
根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：
每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。
处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。
速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。
回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：
技
主要特点
捕获 中度纯精制 样品起始状样品最终状
蛋白质的性质
方法 特异性结合
亲和（AC ）
RPC 高分辨率★★★
★
需要有机溶
剂
在有机溶剂
中，有损失
生物活性的
风险
1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。
2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。
3、GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，
但不受缓冲液条件的影响。
4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法
5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。
6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。
注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。
1.分离纯化的方法策略及其应用
下游的分离纯化步骤不仅要在可替换的分离技术间进行选择，如细胞的破碎可选择高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎或酶溶法，分离细胞、细胞碎片、包涵体和沉淀物，可选择离心或过滤，需要进行浓缩的时候，可选择沉淀或超滤；另一方面，设计的纯化工艺包括特定的层析步骤，及层析的先后顺序，以期得到最大的得率。吸附层析，如离子交换层析，疏水层析和亲和层析，可基于特定的选择性达到对目标蛋白的纯化，适用于大量样品的处理。凝胶过滤层析用于后续的精制步骤，如去除少量的杂蛋白或聚合体，在纯化过程中用于脱盐和缓冲液交换。在分离纯化中对每个步骤的选择，可以遵循以下原则：1 应尽可能的利用蛋白质的不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同的技术进行多次纯化；2不同的蛋白质在性质上有很大的不同，这是能从复杂的混合物中纯化出目标蛋白的依据，每一步纯化步骤应当充分利用目标蛋白和杂质成分物理性质的差异。所以在分离纯化的开始阶段，要尽可能的了解目标蛋白的特性，不仅如此还要了解所存在杂质成分的性质，如大肠杆菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（<50000Da），而且
酸性蛋白较多；3 在纯化的早期阶段要尽量减少处理的体积，方便后续的纯化；4 在纯化的后期阶段，再使用造价高的纯化方法，这是因为处理的量和杂质的量都已减少，有利于昂贵纯化材料的重复使用，减少再生的复杂性（84）。
在下游的纯化工艺中为了提高蛋白的得率和处理的效率，应当使用最少的纯化步骤，经典的纯化过程如图1 所示。在初始的纯化阶段，除了使目标蛋白和细胞内的DNA、RNA、多糖以及性质差别较大的蛋白质成分分离，采用的分离方法要能除去影响目标蛋白稳定性的杂质，保护目标蛋白不被蛋白酶降解，进行目标蛋白的捕获和浓缩。在这一阶段的纯化中，盐析沉淀仍然应用，但共沉淀的杂质常常很多，离子交换层析和疏水层析具有操作上的优点，可以再生使用，成为这一步通常选用的层析方法；中间阶段纯化是最为关键的阶段，这时要能达到和大量的杂蛋白分离，利用蛋白质不同的性质选择不同的纯化方法，每一步的方法要有足够的选择性，提高目标蛋白质的纯度；最后进行精制纯化，常用凝胶层析，使目标蛋白的纯度进一步提高达到要求。对于包涵体蛋白质，由于涉及包涵体蛋白质的变复性，其纯化步骤和方法与可溶性蛋白不同，需要对每一种包涵体蛋白质建立相应的复性方法，将在后面作介绍。
图1 经典的蛋白质纯化流程图
在工业上，为了尽可能提高过程的通量和减少生产的成本，发展的方法与传统的方法不同。双水相萃取和扩张床吸附技术，可以处理全细胞培养液，通过整合技术的使用，能达到萃取、浓缩和初步纯化的目的。另外这两种技术和亲和相互作用结合可进一步提高处理的选择性。相似的，亲和相互作用还可以整合进其它的高通量处理，如亲和膜过滤和亲和沉淀（2）。生产上使用的非线性色谱，如置换色谱，一次层析的载量很大，得到的蛋白纯度很高，近年来也有很大的发展和应用（85,36）。
2.1 包涵体蛋白质的折叠复性
在过去几十年的发展过程中，重组DNA技术为大规模生产目标蛋白提供了新的途径，尽管有不同的宿主系统可供选择，如果翻译后修饰不是蛋白质功能所必需的话，大肠杆菌和其它的原核宿主系统仍然是生产重组蛋白的首选(17)。细菌如大肠杆菌可以在短时间里得到高水平表达的蛋白质，但同时表达的蛋白质常常形成非活性的包涵体。包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关（35）。强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合标签，相对的疏水性。尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低（45）。蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集（4）。
蛋白质进行可溶性表达和表达形成包涵体各有利弊，对许多蛋白，再折叠很困难，或者不可能，进行可溶性的表达就是首选。现在发展了许多方法减少包涵体的形成，如使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达(49)，与伴侣分子和折叠酶共表达(3,5)，表达定位于不同的空间(7,58)，选择突变的菌株（6,43）或其他的原核表达系统(34)。由于影响蛋白质细胞合成和折叠的因素太多，优化结果不可预测，如对于抗体Fab片段，尽管只有可变区序列不同，也不能预测新的Fab片段在体内是否可以正确折叠（4），所以即使采用了促进可溶性表达的方法，也不能保证不形成包涵体。
从另一方面来讲形成的包涵体易于和细胞的其它成分分离，而且过量表达的目标蛋白在包涵体中得到了富集，提高了纯度，降低了分离纯化的难度。所以如果包涵体蛋白可以进行体外的正确折
叠，那么形成包涵体就可以接受，对易受细菌蛋白酶降解的蛋白质或对细菌有毒性的蛋白质来说，表达产生包涵体是绝对必要的。内皮抑素（endostatin）可以特异性的抑制内皮细胞的增殖，具有抑制新生血管生成和抑制肿瘤生长的作用，已进入临床研究阶段。采用酵母表达系统，可直接产生具有活性的蛋白质，但是表达的水平和蛋白质的回收率较低，采用大肠杆菌表达则形成包涵体，包涵体蛋白质的折叠复性非常困难，改善蛋白质的折叠复性具有实际的应用意义。通过对内皮抑素折叠机制的研究表明，紧密折叠的内皮抑素对酸耐受，在酸性条件下有可能得到大量的正确折叠的蛋白质（15）。所以如果对于包涵体蛋白质，通过机制的研究，能够解决折叠复性的问题，那么利用包涵体的高水平表达，就可以得到大量的蛋白质，降低生产的成本。
在包涵体蛋白质的变复性中，不管是采用什么方法进行折叠，都要用变性剂溶解包涵体，最终又都要去除变性剂，理解变性剂对蛋白质的影响可以指导我们设计复性过程。
图2：在各种变性剂浓度条件下蛋白质的溶解性和构象。
如图2所示，随着变性剂浓度的变化，不仅具有天然构象状态蛋白质的比率在改变，而且蛋白质的溶解性也在改变。在高的变性剂浓度条件下，蛋白质的极性和非极性侧链都是可溶的，但是蛋白质却是去折叠的，如图2中d所标的区段。在低的变性剂浓度条件下，如图2中a区段所示，天然构象的蛋白质是稳定的，但也会稳定部分折叠的中间体，这些部分折叠的中间体易于自我缔合形成沉淀。所以选择b区段所在的变性剂浓度来进行蛋白质的折叠更为有效，这一区段即可以稳定蛋白质的天然构象，而且可以增加天然构象蛋白质的溶解性，对于部分折叠的中间体却没有稳定作用。避免选择c区段所在的条件进行折叠，因为这一区段天然和变性的蛋白质都只有有限的溶解性，折叠速度也很慢（13）。这一图示所展示的规律对所有蛋白并不是统一的，但它向我们描述了一个大概的情况，在这一过程，不仅仅要考虑变性剂对天然构象和折叠中间体的稳定作用，还要考虑对蛋白溶解性的影响。在高的变性剂浓度，蛋白质是去折叠的，充分溶剂化的，柔性的，在折叠缓冲溶液中，蛋白质是折叠的，具有刚性的，将蛋白质从高变性剂浓度条件变为折叠缓冲溶液，就会使蛋白质坍塌形成紧凑的结构，但蛋白的这一过程不总能有效进行，常常存在错误折叠和聚集，所以在包涵体的变复性过程中，除了要控制上面所讲的参数，还有两方面的参数需要控制，一是应用添加剂，来促进折叠、减少聚集，二是控制溶液的氧化还原状态促进二硫键的正确配对。
通常从包涵体中回收活性蛋白质包括三个步骤：包涵体的分离和洗涤，包涵体蛋白质的溶解和溶解蛋白质的再折叠。前两个步骤效率较高，但是再折叠的效率率常常不能令人满意，折叠的方法和折叠的条件需要通过实验来进行筛选。
2.1.1 蛋白质折叠的过程和机理
对蛋白质折叠机理的研究，对保留蛋白质活性，维持蛋白质稳定性和包涵体蛋白质折叠复性都具有重要的意义(21)。早在上世纪30年代，我国生化界先驱吴宪教授就对蛋白质的变性作用进行了阐释（8），30年后，Anfinsen通过对核糖核酸酶A的经典研究表明去折叠的蛋白质在体外可以自发的进行再折叠，仅仅是序列本身已经包括了蛋白质正确折叠的所有信息（9,10），并提出蛋白质折叠的热力学假说，为此Anfinsen获得1972年诺贝尔化学奖。这一理论有两个关键点：1蛋白质的状态处于去折叠和天然构象的平衡中；2 天然构象的蛋白质处于热力学最低的能量状态。尽管蛋白质的氨基酸序列在蛋白质的正确折叠中起着核心的作用，各种各样的因素，包括信号序列，辅助因子，分子伴侣，环境条件，均会影响蛋白质的折叠，新生蛋白质折叠并组装成有功能的蛋白质，并非都是自发的，在多数情况下是需要其它蛋白质的帮助，已经鉴定了许多参与蛋白质折叠的折叠酶和分子伴侣（3,16,86），蛋白质“自发折叠”的经典概念发生了转变和更新，但这并不与折叠的热力学假说相矛盾，而是在动力学上完善了热力学观点。在蛋白质的折叠过程中，有许多作用力参与，包括一些构象的空间阻碍，范德华力，氢键的相互作用，疏水效应，离子相互作用，多肽和周围溶剂相互作用产生的熵驱动的折叠（12,52），但对于蛋白质获得天
然结构这一复杂过程的特异性，我们还知之甚少，许多实验和理论的工作都在加深我们对折叠的认识，但是问题仍然没有解决。
在折叠的机制研究上早期的理论认为，折叠是从变性状态通过中间状态到天然状态的一个逐步的过程，并对折叠中间体进行了深入研究，认为折叠是在热力学驱动下按单一的途径进行的。后来的研究表明折叠过程存在实验可测的多种中间体，折叠通过有限的路径进行。新的理论强调在折叠的初始阶段存在多样性，蛋白质通过许多的途径进入折叠漏斗（folding funnel），从而折叠在整体上被描述成一个漏斗样的图像，折叠的动力学过程被认为是部分折叠的蛋白质整体上的进行性装配，并且伴随有自由能和熵的变化，蛋白质最终寻找到自己的正确的折叠结构，这一理论称为能量图景（energy landscape），如图3所示，漏斗下方的凹凸反映蛋白质构象瞬间进入局部自由能最小区域(13,14)。
图 3：能量图景（The energy landscape）的示意图，高度代表能量尺度，宽度代表构象尺度，在漏斗（funnel）的下方存在别的低能量状态，共存的不同能量状态的蛋白质种类也降到最小(14)。
这一理论认为结构同源的蛋白质可以通过不同的折叠途径形成相似的天然构象，人酸性成纤维生长因子（hFGF-1）和蝾螈酸性成纤维生长因子（nFGF-1）氨基酸序列具有约80%同源性，并且具有结构同源性（12个β折叠反向平行排列形成β折叠桶），在盐酸胍诱导去折叠的过程中，hFGF-1可以监测到具有熔球体样的折叠中间体，而nFGF-1经由两态（天然状态到变性状态）去折叠，没有检测到中间体的存在，折叠的动力学研究也表明两种蛋白采用不同的折叠机制（38）。对于同一蛋白质，采用的渗透压调节剂（osmolytes）不同，蛋白质折叠的途径也不相同，说明不同的渗透压调节剂对蛋白质的稳定效应不同（11）。这两个例子都说明折叠机制的复杂性，也与上面所介绍的理论相吻合。
2.1.2 包涵体的分离和溶解
分离包涵体的第一步是对细菌进行最大限度的溶解，将几种细胞破碎技术相结合，如联合使用溶菌酶处理，高压匀浆细胞破碎和含表面活性剂的高盐溶液处理，可以使膜碎片和细胞壁碎片最大限度的分解。细胞破碎后，通过离心的方法可以很方便的回收包涵体，再用洗涤液（通常含有低浓度的变性剂，表面活性剂，还原剂，EDTA）对包涵体进行清洗，就可以得到较纯的包涵体（4，74）。通常要选用强的变性剂使蛋白质完全变性溶解，如6 M的盐酸胍和8 M 的尿素，蛋白质浓度多采用1-10mg/ml（22）。由于盐酸胍溶解包涵体蛋白质能力比尿素强，而且尿素中的异氰酸酯可以使自由氨基氨甲酰化（这种作用在碱性条件下表现的更强），所以常常首选盐酸胍作为解离剂。对含有分子间二硫键或非天然二硫键的包涵体蛋白质，在溶解过程中需要加入还原剂，如二硫苏糖醇，β-巯基乙醇，还原型谷胱甘肽，加入螯和剂，如EDTA，可以防止金属催化的半胱氨酸氧化。除此之外，改变pH和使用表面活性剂也被用于溶解包涵体蛋白质（22），相对而言，这两种方法的应用较少，而且只有具有正确二硫键的包涵体蛋白质才可以用表面活性剂进行溶解，否则可同时形成正确的和非正确的二硫键，表明用尿素、盐酸胍变性和用表面活性剂变性对蛋白质的结构和动力学有不同的影响，Tsumoto在这方面做了详细的论述（25）。
Panda等在高pH 条件下使用低浓度的尿素溶解包涵体蛋白质，用于重组牛生长激素、重组人生长激素和猕猴透明带糖蛋白的变复性，认为在变性时蛋白质所保留的天然二级结构有助于蛋白的折叠，减少蛋白质的聚集。但采用的高pH条件可以使氨基酸残基发生化学修饰，还需要更多的验证（73）。
以上变性的方法属于化学变性，使用高的静力压提供了蛋白质变性的另外一种物理变性方法，静力压促进蛋白质变性解离，是因为蛋白质在变性条件下，系统整体趋向于更小的体积。联合使用高压和低浓度的变性剂已用于包涵体蛋白质和蛋白质聚集体的变性，是一种有前景的变性方法（31,83)。
2.1.3 溶解后包涵体蛋白质的折叠复性
蛋白质分子变性后，通过改变折叠的条件使蛋白质恢复其天然构象的过程，称为复性。已经发展了很多的方法用于包涵体的折叠复性，但是这些方法的结果并不可预测，每一种方法都需要对各种实验条件，如变性剂浓度、pH、温度、蛋白质浓度、离子强度、添加剂的浓度，进行优化选择。通常包涵体在变性溶解后具有高的纯度，可以直接进行复性。但由于包涵体还含有其它的细胞成分，如膜蛋白、磷脂、核酸，可能影响蛋白质的复性（53,54），为了进一步提高纯度，有些研究工作在包涵体变性后先进行蛋白的纯化，如亲和层析（47,55,57,60,63,64,65, 68）、离子交换层析（47,56）、凝胶过滤层析、反相层析（62），再进行变性蛋白质的复性，层析在变性条件下应用为这一策略提供了技术支持。
为了控制折叠、错误折叠和聚集的速率，一种方法是降低变性剂的浓度，降低的速度和操作的时间都决定折叠的效率。另一种方法就是加入添加剂来减少聚集，促进折叠，如L-精氨酸，盐，有机溶剂，一些表面活性剂，渗透压调节剂（osmolytes），硫代甜菜碱类物质（NDSBs），这些物质或稳定蛋白质的天然构象，或使部分折叠的中间体不稳定，表2 列出了这些化合物和它们可能的作用机制，它们在蛋白质的折叠中起着重要的作用，已得到广泛的应用（13,25,32,4,74），但对于其中的好些化合物参与折叠的作用机制我们还了解不多。
表 2 增加蛋白质折叠的添加剂
添加剂可能的作用机制
甘油对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度L-精氨酸两亲分子/渗压剂
甘氨酰甜菜碱/山梨糖醇对蛋白质具有优先的水合作用
阿拉伯聚糖增加黏度
木糖醇增加黏度
乙醇调节极性
DMSO调节极性
保护非极性表面两性离子表面活性剂（Zwitterionic
detergents）
Triton X-100保护非极性表面
硫代甜菜碱类物质（NDSBs）保护非极性表面
蔗糖/海藻糖对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度N-氧化三甲胺（TMAO）对蛋白质具有优先的水合作用/渗压剂三氟乙醇（TFE）促进二级结构的形成
低浓度盐酸胍使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋
白质的溶解性
低浓度尿素使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋
白质的溶解性
配体稳定天然结构状态
聚乙二醇保护熔球体（molten globule）/增加黏度
在折叠过程中另一个关键的问题是正确二硫键的形成，一旦形成了错误的二硫键，就不能再折叠形成正确的结构，所以在折叠时不仅要氧化促进二硫键的形成，还要加入还原剂促进二硫键改组（disulfide-bond reshuffling），使蛋白质最终折叠成正确的结构。常用的方法有：1 使用金属催化的空气氧化，并添加还原剂促进二硫键改组，由于氧在蛋白质溶液中溶解性低，这种方法的效率较低，改用搅拌促进氧的质量传输，又会造成蛋白质的聚集；2 使用小分子还原型和氧化型的巯基试剂对，包括还原型和氧化型的谷胱甘肽（GSH/GSSG）、半胱氨酸和胱氨酸
（cysteine/cystine）、半胱胺和胱胺（cysteamine/cystamine）、二硫苏糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTT/GSSG），二流赤藓糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTE/GSSG），这一方法是目前常用的方法，通常使用的巯基试剂总浓度为5-15mM，还原剂和氧化剂的比为5:1―1:1（4,74）。3 在复性前将巯基保护起来，有两种方法可以选择，一是通过谷胱甘肽和蛋白的半胱氨酸残基形成二硫键来保护巯基，二是进行半胱氨酸磺酸化，从而减少复性过程中不正确的二硫键的形成，复性后再加入还原剂使形成正确二硫键。人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）含有35个半胱氨酸残基，可形成17对二硫键，即使在天然状态下也只具有低的溶解性，进行原核表达时这两种巯基保护方法都被用于该蛋白质的折叠复性，由于在蛋白质的巯基上引入了带电荷的残基，增加了变性蛋白和部分折叠中间体的溶解性，减少了复性过程中蛋白质的聚集，可获得较高的复性效率（25,32,33）。人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCGβ）含有12个半胱氨酸残基，如果不进行巯基保护，在折叠复性中会形成寡聚体和大量沉淀，变性蛋白质磺酸化后再折叠复性可形成几乎100%单体蛋白，同时提高了得率和纯度（37）。此外，在前胰岛素的折叠复性中也应用了磺酸化保护（44,47,48），所以这一方法在进行复杂蛋白的变复性时可以采用。
2.1.
3.1 稀释复性和透析复性
用折叠缓冲液快速稀释溶解的包涵体蛋白质溶液，达到降低变性剂浓度的目的，使去折叠的蛋白质进行再折叠，就是稀释复性。为了很快避开低溶解性变性剂区（如图2中c区段所示），减少蛋白的聚集，在进行稀释时一定要快速。折叠进行时的蛋白质浓度是体外折叠成功的关键，理想的情况是希望折叠在高浓度的条件下进行，但是在高浓度的条件下变性剂的稀释常常造成去折叠和部分折叠蛋白质的聚集。对于折叠，是一个一级的反应过程，而聚集是一个高级的反应过程，依赖蛋白质的浓度，所以需要小心的选择蛋白质的浓度，一般的蛋白质的终浓度保持在20-50μg/mL。
透析的方法不显著的改变溶液的体积，但时间较长，而且易形成蛋白质沉淀，所以透析起始的蛋白质浓度非常关键，而且仅对一些蛋白质有效。变性剂浓度的降低也可以分阶段的进行，或先经过稀释，再透析去除剩余的变性剂，由于变性剂的浓度在开始时先降到一定的水平，增加了部分折叠中间体的溶解性，常常可以提高折叠的效率，但是必须通过实验选择在不同阶段使用的变性剂浓度，避开图2 所示的c区段。除了要考虑降低变性剂的浓度，还要考虑每一阶段的氧化还原状态，以及温度、添加剂等因素。
在胰凝乳蛋白酶原的折叠复性中，如果盐酸胍稀释的浓度低于0.5 M或高于3 M都会造成大量的沉淀，在2.5 M浓度时有一半的蛋白质没有正确折叠，而在1 M时则完全折叠，说明折叠时的变性剂并不是越低越好，而是存在一个最佳浓度（13）。Tsumoto等通过分阶段透析进行了单链抗体Fv段包涵体的折叠复性，在1M盐酸胍透析时加入氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸可以使正确折叠蛋白的得率达到95% 以上（40），进一步研究表明在1M盐酸胍条件下蛋白质所具有的结构使得自由巯基容易形成正确的二硫键，加入氧化型谷胱甘肽的作用是加速了蛋白质的正确折叠、抑制蛋白质的聚集，而L-精氨酸起的作用是稳定部分折叠的中间体使其不发生聚集，所以同时加入氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸可以将蛋白质的聚集降到最低的程度（41）。这个研究小组用相同的方法进行白介素-12包涵体的折叠复性，仅加入氧化型谷胱甘肽而没有还原型谷胱甘肽只有约57%的折叠效率，当两者同时加入后则可达到90%（42），这些结果表明前一种蛋白比较容易形成正确的二硫键，而白介素-12折叠复性需要加入还原型的谷胱甘肽促进二硫键重组，使蛋白质最终选择天然的二硫键，并促进折叠。
另一种策略是将变性蛋白分成几份按一定的时间间隔逐步加入折叠缓冲液中，可以减少处理的体积、改善折叠的效率（35）。Arora等将这一方法用于人γ干扰素的复性，当添加0.5M的L-精氨酸可以使产率提高十倍，产品的得率和比活比文献报道的都要高（72）。
在已经发展的复性方法中，稀释复性仍然是应用最多的方法，但在放大时会因为处理体积太大造成成本太高。溶解复性获得的蛋白质，需要通过离心和过滤的方法去除不溶性的物质，再按可溶
性蛋白质的处理方法进行下游的分离纯化。扩张床吸附技术可以处理大量的样品，而且分离的效能不受聚集蛋白质的影响，Ferre等将蛋白质的稀释折叠和扩张床吸附捕获技术相偶联，使用STREAMLINE TM DEAE阴离子交换介质，用于包涵体蛋白质HAT-hβ2m的分离纯化，可以得到48%回收率和94%纯度的复性蛋白（23）。
2.1.
3.2 色谱复性
色谱方法不仅在蛋白质的纯化中得到广泛应用，也成为包涵体蛋白质复性的主要手段之一。色谱复性的方法的优点是可以显著的减少处理的时间，减少变复性过程中分子的聚集，使复性的同时也达到了纯化的效果。第一类型的色谱复性就是凝胶过滤色谱复性，这一方法的原理在于通过分子筛效应可将蛋白质和小分子的变性剂分离，实现溶液交换和蛋白质的折叠。复性折叠中存在的一个问题就是蛋白质的聚集，为了减少导致蛋白质聚集的分子间相互作用，可将蛋白质结合在分离介质上，达到溶液中变性剂浓度的稀释和蛋白质的折叠，这一类型的复性为吸附型色谱复性，包括亲和色谱复性，疏水相互作用色谱复性，离子交换色谱复性。对于一些稀释法难于折叠的蛋白质，这一方法具有更好的效果，如一些膜蛋白（24,50,71）。在折叠中，吸附的位点会影响到折叠，所以要优化折叠的条件，才能得到好的折叠效果。另一种方法是在介质上固定化伴侣分子或折叠酶，使层析柱成为一个折叠反应器，固定化的优点是能够回收使用，不会引入新的杂蛋白。
A. 凝胶过滤色谱复性
凝胶过滤复性时，变性蛋白质加样于折叠缓冲液平衡好的凝胶过滤柱上，然后用折叠缓冲液进行洗脱，凝胶过滤层析有不同的分子量分级范围，有助于聚集蛋白质和正确折叠蛋白质的分离。血小板衍生的生长因子（PDGF）由两个亚基组成，Müller等用双顺反子表达载体同时表达等摩尔的A链和B链，但以包涵体的形式存在，为了得到活性的异源二聚体PDGF-AB，包涵体用盐酸胍变性后，先在变性条件下用凝胶过滤层析进行纯化，使用稀释复性，蛋白质严重聚集，即使在10μg/ml蛋白质浓度条件下，也只能得到45%可溶性蛋白，而用凝胶过滤复性，同时洗脱的A
亚基和B亚基可以缓慢二聚化产生异源二聚体，蛋白质以2.5mg/ml浓度上样,最终异源二聚体得率可达75%（26）。
在凝胶过滤复性中，发展了一种梯度复性的方法，这一方法的原理基于复性过程中，变性条件的快速改变加速了部分折叠蛋白质的聚集，导致沉淀形成和非特异性的吸附，通过梯度洗脱逐步降低变性剂的浓度，使蛋白质处于一个梯度改变的变性剂条件下，控制蛋白质的折叠和聚集速度，使蛋白质在离开层析柱时，处于折叠缓冲液中，从而改善活性蛋白的回收率。通常选择线性的梯度用于折叠复性，对于不同的蛋白质还有其它的模式，如一些蛋白在特定的变性剂浓度范围里不稳定，在此变性剂浓度范围里就需要快速降低变性剂浓度。这一复性过程中，梯度在上样前就在层析柱中已经形成，上样后使用变性缓冲液进行洗脱，由于蛋白质受到的分子排阻比变性剂大，蛋白质移动的速度比变性剂梯度移动的速度快，最终蛋白质通过整个变性剂区，离开层析柱时处于折叠缓冲液中。通过尿素线性梯度复性，变性溶菌酶以高蛋白浓度上样（17mg/ml）可以获得90%的活性回收率，与稀释复性和非梯度凝胶过滤复性相比较，显著的改善了活性回收率（27）。对单链Fv片段包涵体蛋白，使用梯度同时改变变性剂浓度和pH，比单改变变性剂浓度的梯度复性或不使用梯度的凝胶过滤复性具有更高的活性得率（28）。另外应用连续环形色谱，蛋白样品连续上样于旋转的色谱柱上，在提高折叠效率的同时，也提高了色谱复性处理的能力（29,30）。
B. 吸附型色谱复性
吸附型色谱复性是在变性条件下，利用变性蛋白质可瞬间结合在特定层析介质上的特性，进行缓冲液的交换，降低变性剂的浓度，可先改变变性剂浓度使吸附的蛋白质逐渐的折叠复性，在柱中的变性剂溶液完全被置换成折叠缓冲液后，再通过在折叠缓冲液中加入盐或其它添加剂进行原位纯化洗脱，为了获得好的折叠效率和纯化效率，常采用梯度洗脱或阶段洗脱的方法。由于蛋白质结合在固相介质上，减少了折叠过程中由于分子间相互作用所造成的聚集，所以这一方法可提高折叠的效率。在变性条件下，蛋白质能否进行离子交换色谱复性和疏水色谱复性，与蛋白质的理
化性质密切相关，仅有有限的报道（36），而给蛋白质加上一个亲和标签，表达得到的包涵体再用亲和色谱复性对不同的蛋白质有一定的通用性，应用也更为广泛，尤其是金属螯合亲和色谱复性。
多肽通过在N端或C端加上一个亲和标签，在包涵体的纯化上有两个方面的用途，其一是包涵体变性溶解后，利用亲和色谱直接进行包涵体溶液的纯化，再用稀释或透析的方法进行复性(55,57,60,64,65,68)，其二就是用于亲和色谱复性(61,66,67,69,70)。由于蛋白质或肽类标签在变性条件大多失去了与亲和介质结合的特性，目前这一技术用的最多的是组氨酸标签。Zahn 等在镍亲和层析柱（Ni-NTA argrose）上通过盐酸胍/谷胱甘肽梯度进行带有组氨酸标签的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折叠，抑制了蛋白质聚集和分子间二硫键的形成，再用咪唑缓冲液对目标蛋白进行洗脱，纯化的流程图如图4所示(20)。Stempfer等在α-葡萄糖苷酶的N端或C端加上多聚精氨酸标签，研究了变性蛋白在肝素亲和介质上的折叠复性，通过优化实验条件，蛋白质可以在5mg/ml浓度条件下高效复性(59)。
图4：利用金属螯合色谱复性纯化人朊病毒蛋白多肽片段的流程图
除了以上的应用，更令人鼓舞的是这一技术已成功用于膜蛋白的复性（24,50,71）。酮戊二酸载体蛋白是线粒体内膜上的一种转运蛋白，Smith先采用E.coli C41（DE3）作为宿主菌使C端带有组氨酸标签的目标蛋白形成包涵体获得大量表达，再用镍柱亲和色谱进行复性和纯化，获得的融合蛋白具有和天然蛋白一样的转运活性，每升的细菌培养液可获得15mg的活性蛋白（50）。
C. 由固定化伴侣分子和/或折叠酶介导的色谱复性
分子伴侣和折叠酶在蛋白质的正确折叠中起着重要的作用，是近年来的一个研究热点，它们和蛋白质在体内共表达已经成为促进蛋白质可溶性表达的重要方法。分子伴侣和折叠酶在体外有两个方面的应用，其一是在溶液中加入伴侣分子和/或折叠酶促进包涵体蛋白质的折叠和装配（39），另一方面就是通过固定化的伴侣分子和/或折叠酶来介导蛋白质的折叠复性。Altamirano等通过固定化伴侣分子GroEL的活性小片段、脯胺酰异构酶和大肠杆菌氧化还原酶DsbA将蝎子毒素蛋白Cn5的折叠得率从5%提高到87%（18）。在单链抗体Fv段的透析复性中，加入固定化的氧化还原酶DsbA和DsbC可以显著提高折叠的效率，得到的单链抗体Fv段和天然抗体Fv段具有相同的功能（46）。
2.1.
3.3 其它的复性方法
近年，还有一些其它的方法用于蛋白质的折叠复性，如双水相萃取复性（76,77,78,79），反向胶束复性（33,75,80），高静力压复性（31,81,82,83），这些方法对特定的蛋白质可获得高的复性效率，大多还停留在研究阶段，相信随着方法的成熟和普及，将会为包涵体蛋白质的折叠复性提供更多的选择手段。
2.2可溶重组分子的分离纯化
重组蛋白在大肠杆菌中得到表达以后，首先必须从细菌释放才能进行下游的分离纯化过程。蛋白质释放的方法依赖于蛋白质最终在细胞中的定位。大部分的可溶性重组蛋白在细胞质中表达，而一些膜蛋白常常表达于细胞内膜上，还有一些则分泌到细菌的周质间隙或细胞外。将重组蛋白分泌到周质间隙或细胞外可避免破碎细胞和处理细胞碎片，而且杂蛋白的种类和量都要少得多（在周质空间大约有100种不同蛋白质，而在胞浆内有大约4000种不同的蛋白）。对于分泌到周质间隙的蛋白质，使用渗透压冲击，冻融法，溶菌酶处理方法可以使目标蛋白释放。对于表达于细胞内膜和胞内的蛋白质要经过细胞破碎，常用的方法有高压匀浆法、超声破碎法、珠磨法、化学渗透法和酶溶解法，每种方法有自己的特点，现在的研究常常将几种方法结合，并紧密结合下游固液分离过程（87）。
对于表达于细胞膜的蛋白质，先要破碎细胞后分离细胞膜，再抽提溶液进行膜蛋白的提取，由于膜蛋白具有疏水区域，在抽提溶液中需要加入表面活性剂，一方面破坏细胞膜，溶解膜结构，另
一方面促进膜蛋白的溶解和稳定，常用Triton X-100、脱氧胆酸钠、Brij等弱的表面活性剂来保留蛋白质的天然构象。表面活性剂Triton X-114的临界溶液浓度（critical solution temperature）为23℃，在此温度以下，形成均一的溶液，在此温度以上，则形成富含表面活性剂的相和低浓度表面活性剂的相，通过温度诱导的相分离可以使膜蛋白进入富含表面活性剂的相，实现表达膜蛋白的浓缩，是一种应用广泛的表面活性剂。在膜蛋白的整个分离纯化过程中，都要使用表面活性剂来模拟脂质的功能，但胶束与蛋白质的相互作用常常降低层析的分辨率，而且聚集的情况更容易发生，所以在特定的纯化阶段选择哪一种表面活性剂，以及使用多大的浓度，对分离纯化的影响最为关键（88）。
释放出目标蛋白后，再进行液相和固相细胞碎片的分离，得到澄清的蛋白质溶液就可以进行下游的分离纯化了，涉及膜分离技术、沉淀分离技术、萃取技术、层析技术、电泳分离技术，以及一些整合技术，如扩张床吸附，双水相萃取。膜分离技术和沉淀分离技术是两种传统的技术，不管在实验室研究，还是在工业的生产上都有应用，近年来功能性膜的应用和膜色谱的发展大大扩展了膜分离的应用领域，而亲和技术和沉淀分离相结合产生了亲和沉淀技术，提高了分离的特异性。扩张床吸附和双水相萃取整合了细胞碎片处理过程和初步浓缩纯化过程，在大规模纯化重组蛋白时具有很强的优势。
重组蛋白和多肽的分离纯化（3）
网络
2.2.1 层析技术在分离纯化中的应用
层析技术应用于蛋白质的分离纯化开始于60年代，现在已成为蛋白质分离纯化的高分辨的方法。在层析技术的发展过程中，首先是基质填料的发展。由于蛋白质大分子具有高的亲水性，要求分离介质具有亲水的界面，为活性大分子提供适宜的微环境，早期的离子交换介质不具有亲水的特性和大的孔结构，仅用于小分子的分离纯化，Peterson 和 Sober 等在离子交换介质的研究上进行了开拓性的工作，选择特定的纤维素作为离子交换基团的基质，合成的离子交换纤维素介质具有高的结合容量和低的不可逆性吸附，并得到实际应用（89,90）。在过去的几十年里各种层析用基质得到发展，如Sephacryl、Sepharose FF、 Sepharose HP、Superose、Superdex、SOURCE、Mono Beads、Toyopearl，这些基质都有其的物理和化学特点，在蛋白质的分离纯化中发挥着重要的作用。层析技术的另一个发展方向是功能基团的发展，适应不同的选择性要求，如各种不同亲和层析介质的合成，使一步纯化就能达到很高的纯度。层析技术的第三个发展方向是操作模式的多样化，已发展的操作模式有扩张床吸附、模拟移动床层析、置换层析、灌流层析和径向层析，这几种方法能够具有处理大体积样品的能力，适合于大规模生产应用。
在重组蛋白的分离纯化中，各种分离模式都得到应用。凝胶过滤层析是基于液相的分离方法，凝胶包裹的内环境形成固定相，凝胶的外环境形成流动相，蛋白质分子越大越不容易渗透进入固定相，所以又称为分子筛层析，层析的分辨率与介质的排阻极限和上样的体积有关，是一种易于操作的层析方法，另外凝胶过滤层析常用于缓冲液交换，此时可使用较大的载量。离子交换层析基于蛋白质与离子交换介质电荷间的相互作用，高于蛋白质等电点，蛋白质带负电荷，低于蛋白质等电点蛋白质带正电荷，不同的蛋白质在一定的pH条件下与介质上的离子之间相互作用不同，而产生不同的选择性，根据带电基团的类型和强度可分为四种类型：强阴离子交换层析、弱阴离子交换层析、强阳离子交换层析、弱阳离子交换层析，通常采用一定的平衡条件使目标蛋白选择性的吸附在介质上，也可以使杂蛋白吸附，而目标蛋白选择性的穿过。疏水层析基于蛋白质表面的疏水区和介质疏水配体间的相互作用，在高盐浓度条件下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏作用释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附，随着盐浓度的降低，疏水性相互作用也降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质最终解吸附，其它物质，如乙二醇、甘油、非离子表面活性剂也可以降低疏水相互作用，而且疏水相互作用也受pH、温度和添
加剂的影响。疏水层析的选择性依赖于疏水配体的结构，有烷基配体和芳香基配体，烷基的链越长，蛋白质的保留就越强。羟基磷灰石层析常用于抗体的分离纯化，对其分离的机制还了解的不清楚，但涉及介质上钙离子和磷酸根与蛋白上带电残基的相互作用。传统的片状羟基磷灰石物理和化学稳定性比较差，仅能在低流速条件下使用，新的球形羟基磷灰石克服了以上缺点，对于其它方法不易分离的蛋白质，可以用羟基磷灰石层析进行分离纯化。等点聚焦层析是基于蛋白质等电点不同的分离模式，以阴离子交换剂为固定相的情况为例，两性电解质缓冲液和离子交换基团相互作用形成pH梯度，蛋白质在pH 大于其等电点时吸附，在pH低于其等电点时解吸附，由于蛋白质区带后部所处微环境的pH总是低于蛋白质区带前部所处微环境的pH，处于后部区带的蛋白质先于前部开始移动，从而产生聚焦效应，因此可分离等电点仅差0.02的蛋白质。亲和层析基于蛋白质和亲和配体的特异性相互作用，是最为高效的分离纯化方法，用于亲和层析的配体可以是针对抗原的抗体、针对蛋白质分子的受体、酶的底物或抑制剂、针对糖分子的凝集素、活性染料、金属离子、天然或改造过的相互作用多肽等等。利用DNA重组技术，进行目标蛋白的融合表达，再用亲和层析进行分离纯化，已经成为蛋白质表达纯化的常用手段。
表 3 常用层析方法的分离特点和不同纯化阶段的适用性
层析方法亲和层析凝胶过滤层析离子交换层析疏水层析分离机制特异性亲和大小电荷疏水性选择性非常高中等高高→中等载量高低高高纯化速度中等中等→低高高生物相容性好非常好好中等→好目标蛋白的得率高高高中等→高捕获浓缩阶段++++++++++中间纯化阶段++++++++++精制纯化阶段+++++++++
蛋白质能否获得高效分离纯化既与层析介质的理化性质（如配基组成、配基密度、孔径、表面积、颗粒大小、颗粒分散性）有关，又与流动相参数（如有机溶剂、pH、金属离子、解离剂、氧化/还原剂、温度、缓冲液组成、离子强度、上样浓度和体积）有关，正是这些理化参数的变化使得层析技术具有更强的通用性，成为最重要的蛋白质分离纯化技术，表3 列出常用层析方法的分离特点和在不同纯化阶段的应用情况（94）。
2.2.2 亲和标签的在重组蛋白分离纯化中的应用
在重组蛋白的分离纯化中，与其它层析方法相比，亲和层析的纯化能力更为强大，一步纯化就可以得到很高的纯度，可以使蛋白质纯化100-1000倍，活性蛋白的回收率通常很高，而且可以纯化其它方法难以分离的蛋白质。从分离的机理上来讲，亲和层析是一种典型的吸附层析，分子与其介质上的配体结合具有特异性和可逆性，特异性使纯化具有选择性，而可逆性使蛋白质在适宜的条件下洗脱下来。基于重组蛋白质与配体的结合特性，一些重组蛋白质应用亲和层析进行纯化，如将抗体、受体或体外噬菌体展示技术筛选的亲和体（affibody）偶联在亲和介质上进行亲和纯化，但这类应用仅限于特定的蛋白质，而利用DNA重组技术使目标蛋白与亲和标签融合表达，控制重组分子的亲和选择性，进行融合蛋白的亲和纯化，已成为纯化重组蛋白的常用遗传策略。除了方便分离纯化，亲和标签的融合表达还有以下的优点：
1.有的亲和标签可以提高目标蛋白可溶性表达的水平。但要注意的是可溶性表达并不能保证
正确的折叠，融合蛋白可以形成可溶性的聚集体（106）。
2.加入的标签提供检测目标蛋白的高灵敏度方法，如表位标签可以使用ELISA和Western
blotting 进行定性和定量检测。
3.亲和融合策略已广泛用于蛋白质-蛋白质相互作用研究和蛋白质复合物研究（99）。
4.改善蛋白的药代和药动学特性，如一些细胞因子和免疫球蛋白G（IgG）的Fc段融合，可
以性显著增加半衰期，与白蛋白结合结构域结合也可以起到相同的效果。
蛋白质特性与分离纯化技术的选择
佚名
摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。
关键词：蛋白质分离纯化
前言
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。
能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极
大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。
可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离：1．分子大小
不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。
1．1透析和超滤
透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色
1．2离心分离置换缓冲液
许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成
分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等
1．3凝胶过滤
这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。
2．形状
蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响：对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白质要小。
3．溶解度
利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度，但在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件，控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度
3．1pH控制和等电点沉淀
蛋白质在其等电点一般较不易溶解。
3．2蛋白质的盐溶和盐析
3．3有机溶剂分级法
蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10μg/ml）直至极易溶解（＞300mg/ml）不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。
水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。
3．4温度
不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。4．电荷
蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质，
4．1电泳
不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。
等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。
2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。
4．2离子交换层析
改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子
交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。
洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。
蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同
5．电荷分布
电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。
6．疏水性
多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质
是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。
因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离
和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。
7．密度
多数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。8．基因工程构建的纯化标记
通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。8．1GST融合载体
使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
8．2蛋白A融合载体
使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose纯化。
8．3含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose 最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合
的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。
重组蛋白在设计、构建时已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物，扩张床吸附技术STREAMLINE适合做粗分离。
9．亲和能力
结合效率高，分离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体、
吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法，洗耳恭听脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱
亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能
力不同来进行相互分离的，依亲和选择性的高低分为：基团性亲和层析，固定相上的配基对一类基团的极强的亲和力。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力；高选择性（专一性）亲和层析，配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性。如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附。
亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
与超滤结合起来，将两者优点集中形成超滤亲和纯化，具有高分离效率和大规模工业化的优点，适用于初分离。
按配基的不同可分为：
（1）金属螯合介质
蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 张宁
1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物具有什么样的功能分子量和聚合状态是膜蛋白还是水溶蛋白胞内表达还是分泌表达是否需要以及需要何种翻译后修饰有没有配体、底物或产物类似物可以利用对蛋白酶是否敏感有多少分子内及分子间二硫键对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用范围。 大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞 流程简单简单复杂复杂 培养基简单简单复杂复杂 成本低低中高 产率高中中低 表达量高高较高较低 蛋白折叠中较好较好好 胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基 细胞增殖周期30min90min18H24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确 二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有 磷酸化无有有有 酰化无有有有 γ-羧基化无无无有 适用原核蛋白、简单 真核蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 复杂高等真核生 物蛋白 表1：常用表达系统比较 2. 原核表达系统 原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。 表达菌株 原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、
1．培养基的配制 原理 wenku.baidu./link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsT WICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7 步骤 LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。 LB培养基的配制： 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g
氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min 配制方法 （1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。 （2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 （3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。 （4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。 （5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。 （6）分装、加塞、包扎。 （7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。
2、大肠杆菌菌种活化 原理 菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％溴酚蓝 10 ％甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
抗体制备: 合成多肽抗原 抗体制备：合成多肽抗原 synthetic peptide recombinant fragment 目前抗体制备常采用多肽抗原及重组蛋白质抗原，这两种方法各有优缺点，需结合实验需求进行选择。 重组蛋白质抗原上往往带有多个不同的抗原决定簇，其中有些是顺序决定簇，有些为结构决定簇。利用变性的抗原免疫动物获得多克隆抗体是针对各个抗原决定簇的抗体的混合物，在一般应用中能够用于检测天然结构或变性的目标蛋白。利用变性蛋白做为免疫原的一个附带的好处是变性蛋白往往有更强的免疫原性，能够刺激动物产生强的免疫应答。 用做抗原目的的蛋白质一般选择使用大肠杆菌表达体系，因为该体系时间与金钱成本最低。为了提高目标蛋白质表达的可能性与纯化的方便性，人们有时只表达目标蛋白的一个小的片段如特定的结构域。大肠杆菌系统是欣百诺最早建立的成熟表达体系，有一系列设计完美的表达载体与非常成熟的表达培养条件，能够在较短时间内获得基因表达产物，且所需的成本相对较低。 如果制备抗体的目的单纯用于wb检测，采用合成的小肽作为抗原是经济快速的，但是存在由于肽段选择不合适造成的免疫原性弱或者无反应原性的风险，由于抗体制备需要较长的周期，因此利用多肽抗原制备抗体时，常常选取两三段不同的肽段以保证实验的成功率。 ·抗体制备（合成多肽抗原）——步骤1. 多肽合成 免疫用的多肽抗原纯度要求大于80%，更高的纯度虽然理论上可以获得特异性更好的抗体，实际操作过程中动物总是要产生大量非特异性抗体，从而掩盖了抗原纯度所带来的收益。 客户需要提供的材料： 委托我们合成时请提供您的目标多肽序列或蛋白质序列，由我们与你讨论决定具体采用的序列。 提供客户：合成好的多肽，多肽高效液相图谱 时间：2周 ·抗体制备（合成多肽抗原）——步骤2. KLH交联 用小片段多肽制备抗体时必须交联到适当的载体抗原上以增强其免疫原性。我们提供KLH与白蛋白两种抗原载体。 客户需要提供的材料： 若多肽由客户提供，要求多肽量大于5毫克，N端或C端加入一个半胱氨酸，长度在10-15氨基酸。 提供客户：交联好的蛋白或直接用于下一步免疫 时间：3个工作日
1．培养基的配制 原理步骤 LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。 LB培养基的配制： 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g 氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉 15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约）调pH至，121℃灭菌30min 配制方法 （1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。 （2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 （3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至。 （4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。 （5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。 （6）分装、加塞、包扎。 （7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。
2、大肠杆菌菌种活化 原理 菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次； 3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面； 4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养； 5 -80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养 6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 步骤
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤 发布日期:2008-12-17 热门指数:21114 分享| 收藏 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I 序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－2 0 ℃ 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％溴酚蓝 10 ％甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
重组蛋白的概述 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎 表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空 间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生 长没有大的影响，通常可获得高的 表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的
IPTG诱导表达蛋白步骤 15-11-3 配固体培养基和液体培养基，灭菌。 配BindingBuffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。倒板：（5个灭菌的培养皿） ①微波加热溶解固体培养基 （每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。 ②超净台操作，以1?1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+(50mg/ml)，摇匀。 ③倒板。 ④培养皿放置在超净台上凝固， 凝固后将培养皿倒着放入培养箱 中 15-11-4 热转化： （将质粒导入大肠杆菌中） ①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置 30min。 ②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。③摇床上摇45min，150rp，37℃。（使菌体复苏） ④离心，
3000rpm3min。 ⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。（12~16h） 15-11-5配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。 挑单克隆：将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验） ①提前准备好几支装有 3ml 培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。 ②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培养基液澄清） ③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。 15-11-6 扩大培养、诱导表达 ①以（抗生素?培养基）1?1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。 ②摇床上放置2.5h,37℃,180rpm ③以48μl IPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导，移去牛皮纸，恒温摇床上摇6h， 30℃,180rpm。冰上放置一晚（抑制细胞生长 速率，有利于蛋白质充分折叠）
镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤，注意事项！！！ 1、过柱前的注意事项： a、样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命； b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME； c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争； 2、过Ni柱的操作步骤： a、用去离子水洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀； b、5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO4）充电； c、5×柱体积的去离子水洗涤，去游离的Ni离子； d、10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡； e、上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）； f、20×柱体积的Washing Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20-50mM咪唑，pH8.0）洗涤，至无蛋白检出，收集流出液； g、Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）； h、10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。 注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。 3、柱的清洗与保存： a、去Ni离子：a、5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤； b、10×柱体积的去离子水洗涤。 b、去沉淀的蛋白质：a、5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；b、去离子水洗涤，至流出液的pH值为7。 c、保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定 一、实验内容 1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。 2．重组蛋白的Western boltting鉴定。 二、实验要求 通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。 三、实验方法 1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析 （1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。 （3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。 （4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。 （5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。 （6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。 2．Western blot分析 （1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。 （2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。 a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。 b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。 c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、 凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。 d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。 （3）杂交 a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。 b.TBST漂洗3 × 10 min c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中， 室温反应1 hr。 d.TBST漂洗3 × 10 min e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG
第一章蛋白表达纯化 一、诱导表达分析 1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜; 2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜; 3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时; 4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。 二、蛋白纯化 2.1重组蛋白的提取 2.1.1 提取缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。 Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。 2.1.2 方法 1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30 minutes at +4 °C)。 2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬； 3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。 4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。 5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分 析。 Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。 6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。 7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。
实验总结 IPTG诱导表达蛋白 15-11-3 配固体培养基和液体培养基，灭菌。 配Binding Buffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转移到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。 倒板：（5个灭菌的培养皿） ①微波加热溶解固体培养基（每次加热30s，待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。 ②超净台操作，以1?1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+抗生素(50mg/ml)，摇匀。 ③倒板。 ④培养皿放置在超净台上凝固，凝固后将培养皿倒着放入培养箱中。 15-11-4 热转化：（将质粒导入大肠杆菌中） ①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置30min。 ②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。 ③摇床上摇45min，150rpm，37℃。（使菌体复苏）
④离心，3000rpm，3min。 ⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。（12~16h） 15-11-5 配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。 挑单克隆：（将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验） ①提前准备好几支装有3ml培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。 ②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子 【试管中培养基液澄清】 ③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】 注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。 15-11-6 扩大培养、诱导表达 ①以（抗生素?培养基）1?1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（每100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。 ②摇床上放置2.5h,37℃,180rpm。 ③以48μl IPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导，移去牛皮纸，恒温摇床上摇6h，30℃,180rpm。冰上放置一晚（抑制细胞生长速率，有利于蛋白质充分折叠）
蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、 Bl21 codon（DE3）等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当 的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。 4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。 注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解
高中组11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①抗增生
三、凝胶滞留试验（EMSA） 凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。 （一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化 以GST标签为例。 裂解液：25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM Na EDTA、1mM DTT和 2 1×Complete Protease InhibitorCocktail。 洗脱液：50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%（v/v）Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。 EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液：25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na 2 Protease InhibitorCocktail。 1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。 2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。 3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃、200 rpm培养6 h。 4 冰上放置10 min，4℃、3000×g离心1 5 min，收集菌体并称重。 5 每克菌体加入3 mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1，在冰上温和地搅动菌液30 min。 6 超声波破碎30 s（破碎10 s停10 s）。 7 4℃、12000×g离心30 min，上清液用0.45μm滤膜过滤，向滤液中加入5 M NaCl，使NaCl的浓度为200 mM。 8 去掉Glutathione Sepharose 4 Fast Flow中的储存液，用5倍树脂体积
蛋白表达纯化实验步骤 蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,K0酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切，将cDNA克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5a感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如BI21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、 Bl21 cod on (DE3)等。 7、蛋白的诱导表达
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至0D二0?6左 右,加入IPTG,浓度梯度从25 11M 到lm Mo 37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的 蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存lml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0. 22 um过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达,18 度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对困体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%勺葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50卩I 一管,每次用一管, 避免反复冻融。 8包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右，视菌种 的活性而异，也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37 度,250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h?3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当