细胞划痕实验
一、实验原理
细胞划痕（wound healing）法是简捷测定细胞迁移运动和修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。
二、实验步骤
1、所有要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min。
2、 1）先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。
2）在空中加入约5×105个细胞（具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满），37℃培养箱培养。
3）第二天用10μl枪头比着直尺，与标记线垂直的方向划两条平行线，枪头要垂直，不能倾斜。
4）用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。
培养箱，按0、6、12、24h倒置显微镜观察，拍照。
5）放入37℃ 5% CO
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三、注意事项
1、在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。
2、一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%），否则细胞增殖就不能忽略。（也可用丝裂酶处理一小时）
3、按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
直尺20微升枪头（灭菌）无血清培养基PBS 准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内） 流程： 1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。 3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。 4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。 NOTE 6空板可以保证有相当距离的平直划痕，我觉得挺不错的。而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。 如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素（1ug/ml）处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。 照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。 无血清的话，应该一个细胞周期内，增殖可以忽略吧。而且我定点监测的话，差不多可以对应到每个细胞。好像没有看见很明显的增殖现象。丝裂霉素貌似很贵的说。。。如果用这个还不如直接用transwell呢。 另，image J 哪里有下载么？谢谢。 ImageJ 下载网址：https://www.doczj.com/doc/9318055726.html,/ij/download.html 无血清培养，确实细胞增殖可以忽略了，不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢？目前最好的方法还是transwell法 一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（《2%）否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时，但对于一些特殊的细胞系来说，生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养，短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。 划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。） 划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为1。这些细胞本身有迁移能力，且较强。 2。细胞有极性，方便测量，观察。 3。细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。
实验室细胞划痕实验简介 细胞划痕实验是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。 基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。特点： 1，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2, 非常适合研究细胞与胞外基质（ECM），细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。 3，与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。4，研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。 传统实验方法 实验步骤： 1，培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记（方便拍照时定位同一个视野）。 2，细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜（数量少时可培养一段时间至铺满板底）。 3, 细胞铺满板底后，用1ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。（人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷。） 4，吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。 5，加入无血清培养基，拍照记录。 6，将培养板放入培养箱培养，每隔4-6小时取出拍照 7，根据收集图片数据分析实验结果。 德国IBIDI（易必迪）公司Culture Insert方法 1，准备细胞，培养液，culture Insert。 2，如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500μm宽度的划痕。 3，每隔4-6小时拍照记录。 4，根据收集图片数据分析实验结果。
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
划痕实验（全部资料） 课前准备： 工具箱材料： 教师另外准备的材料：17支粉笔，32个硬币 准备工具包：为每组学生准备一个划痕实验用的工具箱。在8个带拉链的袋子里分别放4个大号的回形针和4个硬币。 探究部分 探究2：划痕实验 目标 在划痕实验的过程中，学生将学会： ·探究一组矿物的特性； ·探究矿物的硬度； ·通过矿物的硬度进行分类； ·用科学的思考过程实施探究并建立解释模型：观察、交流、比较、组织。 来源 地球科学 科学概念 ·矿物是地球物质最基本的组成成分，用物理的方法不能够再分。 ·硬度是矿物的一种特性，是矿物能够被刻划的软硬程度。 探究2：划痕实验 第一部分：观察矿物。 第二部分：测量硬度。 探究主题探究总结科学内容评价机会 第一部分：观察矿物·我们用哪些特征来鉴别岩石？ 时间：30~40分钟学生观察四种未知的 矿物，记录观察的结 果并发现要鉴定矿物 还需要更多的信息。 仅仅是靠可见的特性 进行鉴别是不够的。 ·矿物是地球物质最 基本的组成成分，用 物理的方法不能够再 分。 ·矿物是造成岩石的 成分。 ·为了能够鉴别矿物 我们必须理解矿物的 一些特性。 学生单 给学生一套矿物卡 片，请学生按照某一 特性分类，然后同时 考虑两种特性进行分 类。 矿物特性 第二部分：划痕实验·我们用哪些特性来鉴别矿物？ ·用指甲、硬币、裁纸刀来确定硬度如何？ 时间：30~40分钟向学生介绍地质学家 利用硬度来鉴别矿 物。他们用裁纸刀、 硬币和指甲钳在矿物 表面刻划，通过比较 划痕来确定矿物的硬 度。利用这一知识， 他们规定了4种矿物 的硬度做参考。 ·硬度是矿物的一种 特性，是矿物能够被 刻划的软硬程度。 ·矿物可以通过硬度 分类。 ·当两种物质的硬度 相比较时，硬的可以 刻划软的。 反馈单 学生相互之间拿出两 块矿物，请对方比较 相对硬度。
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
划痕攻略之如何使用Image-Pro Plus分析划痕实验划痕实验大家做了不少，但是如何能快速地将实验结果量化呢？今天给大家介绍如何用Image-Pro Plus分析划痕实验。 我们先回顾一下划痕实验的实验原理和步骤 实验原理：细胞划痕法是测定肿瘤细胞的运动特性的方法之一，是在体外培养的单层细胞上划痕致伤，观察肿瘤细胞的迁移情况。 实验步骤：1、培养板接种细胞之前先用marker笔在6孔板背面画横线标记（方便拍照时定位同一个视野）。 2、细胞消化后接入6孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜（数量少时 可培养一段时间至铺满板底）。 3、细胞铺满板底后，用10μL枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量 保证各个划痕宽度一致。 4、吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎 片。 5、加入含有4μg/m L丝裂霉素（防止细胞增殖过快）的完全/基础培 养基，拍照记录。 6、将培养板放入培养箱培养，不同时间点取出拍照。 7、Image-Pro Plus分析实验结果。 划痕实验的结果是以照片的形式呈现的，那么如何将这一大批的图片进行量化呢？下面我给大家介绍一下运用Image-Pro Plus来分析划划痕实验结果。 我用的是Image-Pro Plus 6.0版本（需要的小伙伴可以私信拿安装包） 1.首先打开Image-Pro Plus，在File菜单栏下的open那里选择你要分析的图片或者把你要分析的图片直接拖入软件中（fig.1）。
Fig.1 2.选择工具栏里的计算和测量工具即红色箭头所指（Fig.2） Fig.2 3.在count/Size小窗口里选择measure下拉栏里的select measurements 选择我们要分析的面积（Area）和宽度（Box width）（Fig.3）
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
细胞迁移实验技术 —划痕实验 一、基本原理 细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如72h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。 二、操作步骤 1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2．在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%。 3．第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)。 4．PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 5．放入37℃5%CO2培养箱，培养。可按0，6，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)。 6.统计方法：使用ImageJ软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。
三、注意事项： 1.在用PBS 缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖就不能忽略。 3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。
WS-2005涂层附着力自动划痕仪 使用说明书 一.概述 近二十多年来,耐磨、防腐涂层特别是各种功能涂层在工业、农业、国防、航天科技上得到广泛应用,收到了很大的经济效益和社会效益。而任何涂层要发挥其功能的前提是附着强度的高低。附着强度不高的涂层,谈论其它质量指标是没有意义的，涂层附着强度的检验,就成了涂层产品供需双方首先关注的问题。涂层附着强度的检验方法有很多,如摩擦抛光试验,钢球滚光试验,粘接-剥离试验,锉刀试验,划线划格试验和划痕试验等,其中划痕试验是目前检验硬质涂层最常用也是较好的一种检验方法。它是用具有光滑圆锥顶尖的标准金刚石划针,在逐渐增加载荷下刻划涂层表面,直至涂层被破坏,涂层破坏时所加的载荷称为临界载荷,并以此作为涂层与基体附着强度的度量。 二．仪器工作原理 涂层附着力划痕试验仪运用声发射检测技术、摩擦力检测技术及微机自控技术，通过自动加载机构将负荷连续加至划针（金刚石压头）上，同时移动试样，使划针刻划涂层表面。通过各传感器获取划痕时的声发射信号、载荷的变化量、摩擦力的变化量，输入计算机进行数据转换，将测量结果绘制成图形，最终得到涂层与基体的结合强度（涂层破坏瞬间的临界载荷）。 涂层附着力划痕试验仪有两种检测模式,一种是利用声发射方法,主要适用于0.5-100um 的硬质涂层的检测。当划针将涂层划破或剥落时会发出微弱的声信号,此时载荷即为涂层的临界载荷,由此可得到涂层与基底的临界载荷值。另一种是摩擦力方法，是对涂层与基底的摩擦系数差别较大的材料的测试,划针将涂层划破或脱落时,摩擦力将发生较大变化,摩擦力曲线会产生拐点,以此判定涂层的临界载荷值，此方法主要用于较软涂层。 三．仪器的测量方法 1.声发射测量方式： 计算机控制系统按设定的加载载荷、加载速率和划痕长度，自动连续加载，随着金刚石划针施加于样品表面载荷的不断增大和样品的连续移动，检测出划痕过程中样品表面涂层破损剥落时产生的声发射信号，同时绘制出声发射信号与载荷变化的对应曲线。 2．摩擦力测量方法： 当涂层较软或与基底摩擦系数差别较大时，在载荷的作用下，金刚石划针划开表面涂层与基底接触时，摩擦力将发生突变或出现拐点。该方法适用于软质或较薄涂层。 3.恒载荷测量方法：
实验一：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。 由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【实验报告】 1．简图表示凝集素使血细胞凝集原理 2．怎样根据细胞膜渗透性实验结果分析确定物质进入细胞的速度？物质进入细胞的快慢有什么规律？ 实验二：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 【基本原理】 两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。 人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。 细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 膜基结合力的划痕法实验分析(1) 用划痕实验探索了综合表征膜基结合力的方法。在瑞士CSM 仪器的微划痕测试仪(Micro2Scratch Tester,MST 划痕仪) 对真空多弧离子镀设备制备的WC2Co/TiN 膜基结合力进行划痕实验,系统地介绍了如何利用MST 划痕仪所测的声发射数据、摩擦力数据及光学、电子扫描划痕形貌来综合评定膜基结合力, 并用WS292 划痕仪对评定结果进行验证。 在金刚石压头沿着薄膜表面线性加载法向载荷的过程中,薄膜会出现微裂纹、破裂、从基体剥离、塑性失效(犁沟) 等(以下称之为结合失效) 。当薄膜出现结合失效时,声发射信号峰会突然增强,然而干扰声信号、弧离子镀薄膜中大颗粒的存在等也可能产生声发射信号峰,因而出现声发射信号峰值处的法向载荷可作为 临界载荷的初步评定值。当摩擦因子为常量时,摩擦力- 法向载荷曲线为直线;当划痕过程中膜基结合失效时,摩擦因子发生变化,摩擦力突然变大或变小,在曲线上出现拐点,但拐点也会出现在大颗粒等异常位置加载处。在MST 划痕仪上,采用光学显微镜可以跟踪观察声发射信号峰或拐点处的划痕形貌,用于修正临界载荷。本研究采用声发射强度突然变化、切向摩擦力变化拐点及划痕形貌三种方 法综合评定临界载荷。 1、声发射强度突变时的临界载荷 图1 是不同磁过滤电流下沉积的TiN 膜样品,在MST 划痕仪划痕过程的声发射图谱。从图可见,根据纵坐标的声发射信号峰值所对应的横坐标,初步判定A、B 样品的TiN 膜的临界载荷分别为2612N、28N。但C 样品与D 样品的各存在三处声发射信号峰值,分别对应的横坐标为2414N、2514N、2613N 与917N、2510N、2713N。声发射图谱存在多个峰值,声发射强度的突变异常问题
一、培养细胞常用配置 培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管 所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精…… 实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min
二、细胞复苏 步骤： 1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。 2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。 3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。 4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。 5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。 6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。 7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 8. 将培养瓶放入培养箱内培养 注意事项： 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。 2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。 3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基
抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞 迁移的影响 欧阳学文 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细
胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
五、Matrigel体外侵袭实验所需： 1、Transwell 小室 2、上层培养液：含10g/L BSA的无血清培养液 3、细胞：实验细胞 4、基质胶：Matrigel基质胶为了方便运输和保存，一般是在-20℃（至少保存3个月），呈固体状态。使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱冰上过夜（12h），Matrigel即融化为液体状态备用，避免反复冻融。在冰冻和解冻过程中可能会发生颜色变化属正常现象，一旦解冻，晃动瓶子使其分散均匀。Matrigel冰上维持液态，22～35℃可迅速凝结成胶，使用前接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。 5、下层培养液：含FBS或趋化因子的培养液 6、细胞培养板：12孔板，24孔板等 十二、Matrigel 体外侵袭实验 1.实验前的准备 (1)使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱过夜，溶胶。 (2)接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。 2．包被基底膜（冰上进行） (1)冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。 (2)根据使用需要，用无血清的冷细胞培养基稀释Matrigel胶（稀释比例根据不同细胞系，比例约为1：6～1：3）。 (3)将稀释胶包被于所需的Transwell上室中，包被量至少覆盖整个生长表面，例120μl稀释胶加到12孔transwell上室中。 (4)37℃孵育1小时。 (5)去除未结合的Matrigel，用无血清培养基轻轻冲洗。 3.水化基底膜 吸出培养板中残余液体，每孔加入50μl含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。 4.制备细胞悬液 (1) 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12～24h，进一步去除血清的影响。 (2)常规消化细胞，终止消化后离心收集细胞沉淀，PBS洗1～2遍，用含10g/L BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1～10×105个/ml（一般不超过5×105个/ml）。 5.接种细胞 (1)取细胞悬液加入transwell小室。不同公司不、同大小的transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200μl，12孔板加400μl。
细胞划痕实验 细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。 实验材料：细胞样品 仪器、耗材：6孔板marker笔直尺枪头 试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS 抗体：Hamster igG 3、λ抗体 实验步骤： 一.准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内） 二.流程： 1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2.在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。 3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。 4.用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 5.放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。 注意的几个问题： 1、划痕前是不倒培养基的，划痕后再倒掉培养基加PBS清洗后加无血清培养基； 细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。因此是整个培养皿都加培养基的，观察部位是划痕而已。 2、通过算每个视野的划痕面积，可以通过image J 软件计算。 3、划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。） 划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为 a.这些细胞本身有迁移能力，且较强。 b.细胞有极性，方便测量，观察。 c.细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。 4、其实在伤口弥合中，fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单，我觉得应该是综合效应，而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移，显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell+matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质，侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说，可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动，是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义。
CCK8实验 1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。 2、向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。 3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。 4、向每孔加入10μl CCK8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 PS：1% w/v SDS溶液配制方法： 组份浓度：10% (W/V)SDS 配制量：100ml 配制方法： 1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中，加入约80ml的去离子水，68℃加入溶解 2.滴加浓盐酸调节pH值至7.2 3.将溶液定容至100ml后，室温保存。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 活力计算： 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100 A（加药）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0加药）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 CCK-8 可以用于细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8，它在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 其使用方法在增殖和毒性试验中有所区别: 细胞增殖试验: 1.接种细胞悬液100微升于96孔板,预先置于37度,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养