目录
枯草芽孢杆菌培养基的优化研究- 2 -
1 枯草芽孢杆菌简介及应用- 3 -
1.1 枯草芽孢杆菌简介- 3 -
1.2 枯草芽孢杆菌应用- 3 -
2材料和方法- 4 -
2.1 实验材料- 4 -
2.1.1 菌株- 4 -
2.1.2 培养基- 5 -
2.1.3 仪器与设备- 5 -
2.2 培养基的优化- 5 -
2.2.1 培养方法- 5 -
2.2.2 检测方法- 5 -
2.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -
3 结果和分析- 7 -
3.1含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -
3.2稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -
3.3氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -
3.4碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -
3.5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 -
3.6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 -
参考文献- 10 -
枯草芽孢杆菌培养基的优化研究
摘要。随着国家对农业的支持，微生物化肥有农业中的应用也越来越受到
重视。而枯草芽孢杆菌在农业方面和其它方面都有广泛的应用，因此，对
枯草芽孢杆菌的研究也越来越多，对枯草芽孢杆菌的需要也越来越大。为
了在枯草芽孢杆菌的工业生产中，降低生产成本而又能提高枯草芽孢杆菌
的产量，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行研究。
本文先就培养基的主要原料，含水量，碳源，氮源，碳氮比，pH等几个因
素作单因素实验。研究表明最佳培养基是：稻草49.05%，玉M粉2.25%，
尿素0.9%，CaCO 1.8%，KH PO 1.0% ，水含量57%，pH 7.8[1][2]。
关键词。枯草芽孢杆菌。培养基优化[3]。应用
Bacillus subtilis culture medium optimization
Abstract :along with the country the support to agriculture, microbial
fertilizer has application in agriculture has been paid more and more
attention. And Bacillus subtilis in agriculture and other aspects of a
wide range of applications, therefore, on Bacillus subtilis are studied
more and more, on Bacillus subtilis needs more and more. In order to
Bacillus subtilis in industrial production, reduce production cost and
can improve the yield of Bacillus, Bacillus subtilis fermentation
medium of.
This article first medium main raw material, water content, carbon
source, nitrogen source, carbon and nitrogen ratio, pH and several other
factors single factor experiment. Research shows that the optimum
medium was49.05%: straw, corn flour 2.25% ,urea 0.9%,CaCO 31.8%,
KH3 PO 4 1%, water content 57%, pH 7.8[1] [2].
Key words:Bacillus subtilis。 medium optimization。 application
1 枯草芽孢杆菌简介及应用
1.1 枯草芽孢杆菌简介
枯草芽孢杆菌 体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]。早在1835 年，Ehrenberg 所描述的“Vibrio subtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn 于1872 年正式命名的，现作为芽孢杆菌科(Bacillaceae> 的模式菌株[2]，芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。 1.2 枯草芽孢杆菌应用[4] 枯草杆菌(B acillus Subtilis> 是一种重要的α-淀粉酶生产菌。同时枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。随着经济的发展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的普遍关注和青睐。 ①枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用[5] 工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。 ②枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用[5]-[7] 枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA> 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。 ③枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好实验材料[5] 枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200 种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。 ④枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用[5] 枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合 物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。 ⑤枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用[5] 研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。 ⑥枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用[5] 枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体及有害气体(氨、硫化氢等> ，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等> ，后分解为更小分子的有机物，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD ，使水 体中氨基氮(NH 3-N> 、亚硝基氮(NO 2 -N> 和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质， 同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体。越来越多研究发现，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用。 2材料和方法[6]～[19] 2.1 实验材料 2.1.1 菌株 枯草芽孢杆菌 2.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，1000mL蒸馏水，pH 7.2—7.5。 牛肉膏蛋白胨固体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，20g琼脂, 1000mL蒸馏水，pH 7.2—7.5。 1号培养基：3g木屑, 0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。 2号培养基：3g稻草, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL 水。 3号培养基：3g玉M芯, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。 4号培养基：3g糠壳, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2gCaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL 水。 2.1.3 仪器与设备 高压灭菌锅、超净工作台、37℃摇床培养箱、培养箱、光学显微镜、电烘箱、电子天平、分析天平、冰箱、三角瓶、接种环、试管、培养皿、酒精灯 2.2 培养基的优化 2.2.1 培养方法 先用接种环接种1环试管菌种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，200r/min，37℃培养24h，进行扩大培养和活化，然后再取1mL液体种接种到发酵培养基中，37℃培养48h。 2.2.2 检测方法 活菌的检测方法：称量大概5g发酵48h后的培养基溶解在50mL无菌水中,200r/min，20min 摇散得10，再用5mL无菌吸管吸取5mL到45mL无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到一个适当的稀释度，取0.1mL稀释液到无菌牛肉膏蛋白胨固体培养基中并涂匀，37℃培养24h，然后数培养皿上的菌落数[7]。 芽孢率的检测方法：称量大概5g发酵48h后的培养基溶解在50mL无菌水中,200r/min，20min摇散得10，再用5mL无菌吸管吸取5mL到45mL无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到10，取0.02mL滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率。 2.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响 麦麸与稻草的比例确定以后，即可得其含水量为67%，分别以75%，71%，63%，59%，55%代替其含水量作为发酵培养基，在其它成分和条件不变的情况下培养48h，检测各处理后的活菌数和芽孢率，计算得其单位质量的干重的发酵培养基的芽孢数，以确定最佳的含水量。 2.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响 分别以稻草粗细程度为<0.5mm,0.5～1.0mm,1.0～1.5mm,>1.5mm,混合样作为发酵培养基，其它组分不变，相同发酵条件下培养48h,检测各的活菌数和芽孢率，以确定稻草的最佳粗细程度。 2.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响 在相等的N含量的条件下，分别用蛋白胨，酵母膏，豆饼粉，尿素， 2.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响 确定N源后，在保持C含量不变的情况下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉M粉，玉M淀粉，大M粉作为C源制作发酵培养基，其它组分不变，相同条件下培养48h，测定活菌数和芽孢率，确定最佳C源。 2.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响 确定好碳源和氮源之后，改变碳源和氮源的比例，分别采用0:1,1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1,1:0的C/N比(原料质量比>配制发酵培养基，其它成分不变，在相同的条件下培养 48h， 检测发酵料中和活菌数和芽孢率，以确定最佳的C/N比。 2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响 改变发酵培养基中的pH值，分别以pH值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5作为发酵培 养基，其它成分不变，在相同的发酵条件下培养48h，检测活菌数和芽孢率，得最佳pH。 3 结果和分析 3.1含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响 表1 含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响 含水量活菌数<10）芽孢率<%）单位质量培养基的活 菌数<10）75% 4.5 47.2 1.8 71% 3.4 65.5 1.2 67% 10 91.1 3.0 63% 7.6 67.6 2.1 59% 16 90.9 3.9 55% 12 49.2 2.7 通过对比观察，含水量对枯草芽孢杆菌的芽孢率影响比较大，而对单位质量发酵后的培养基中所含的活菌数影响不是很大。从上表中的活菌数和芽孢率两方面综合分析，含水量为59%时对枯草芽孢杆菌生长有利。 3.2稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响 表2 稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响 稻草粗细程度活菌数<10）芽孢率<%） <0.5mm 15 88.5 0.5～1.0mm 9.9 87.6 1.0～1.5mm 14 87.6 >1.5mm 9.7 89.9 混合样11 90.8 通过对比观察，可以得出稻草粗细程度对培养基的活菌数和芽孢率的影响不是很明显，基本都处于一个数极的。但是在工业化生产中，粉碎稻草并区分不同的粗细程度，需要一定的人力物力，从而提高了工厂的生产成本，不利于工业化生产，所以一般选择稻草的粗细程度为混合样，可以大大降低生产成本，而发酵培养基的活菌数和芽孢率又不低，有利于大规模化的工业生产。 3.3氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响 表3 氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响 培养基活菌数芽孢率 一 1.2×1090.6% 二 5.8×1090.2% 三 1.2×1089.6% 四7.4×1088.4% 五 1.0×1033.5% 六 1.1×1091.2% 七8.9×1068.8% 通过对比观察，可以发现 3.4碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响 表4 碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响 碳源活菌数<109）芽孢率<%） 葡萄糖12 90.7 蔗糖11 89.8 玉M粉24 92.3 玉M淀粉 4.9 60.5 大M粉37 37.6 通过对比观察，可以得出葡萄糖和蔗糖对培养基中的活菌数和芽孢率的影响差不多，而大M粉有利于枯草芽孢杆菌的生长，但产生芽孢少，发酵后培养基的芽孢率低。综合考虑发酵后培养基中的活菌数和芽孢率，可以明显地得出玉M粉作为碳源时对枯草孢芽杆菌的生长和产芽孢都有利，适合于大规模化的工业化生产。 3.5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响 表5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响 碳氮比活菌数<10）芽孢率(%> 0:1 0.000004 20.1 1:3 1.7 91.2 1:2 2.4 90.8 1:1 3.0 92.7 2:1 4.1 93.5 3:1 2.8 91.7 4:1 2.5 92.1 5:1 2.2 92.6 7:1 1.5 93.1 1:0 0.000003 19.2 通过对比观察，可以发现当发酵培养基中只有碳源和氮源中的一种时，发酵后检测出的活菌数和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生产；而如果培养基中碳源和氮源都有时，可以看出发酵后培养基的芽孢率相差不大。而对于大规模化的工业生产，需要的是活菌数和芽孢率都高的生产配方，当碳氮比为2:1可以满足生产需求。 3.6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响 表6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响 pH 活菌数(109> 芽孢率(%> 5.5 1.2 87.5 6.0 8.8 90.4 6.5 18 91.3 7.0 32 92.8 7.5 53 94.5 8.0 21 94.9 8.5 8.9 95.2 通过对比观察，可以发现pH值对培养基的芽孢率影响不大，基本上都在90%左右，pH值主要是影响培养基的活菌数。综合表中的活菌数和芽孢率两项指标，得出pH值为7.5时培养基的活菌数和芽孢率都很高，符合规模化的工业生产。 4 讨论 本课题以农作物的副产品为培养基的基础物料，在前人研究的基础上，采用单因素实验和正交实验相结合的方法，对枯草芽孢杆菌的固体发酵培养基进行研究。研究表明枯草芽孢杆菌的最佳发酵培养基为麦麸45%，稻草49.05%，玉M粉2.25%，尿素0.9%，CaCO 1.8%，KH PO 1.0%，水含量57%，pH 7.8. 枯草芽孢杆菌的应用非常广泛，在工业和农业上都有非常好的发展前景，对枯草芽孢杆菌培养基的研究也有很大的空间。 参考文献 [1]刘惠知，孔利华，周映华，黄建军. 益生菌枯草芽孢杆菌发酵培养基及条件的优化[M]. 科技动态. 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Biochem ical Engineering Journ a, l 2004, 21: 1412148. 青海师范大学生命与地理学学院 枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物10-2 姓名：姜霞 摘要 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一,其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等 关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510320760.5(22)申请日 2015.06.11 C12N 1/20(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (71)申请人山东西王糖业有限公司 地址256209 山东省滨州市邹平县韩店镇驻 地西王工业园电厂路南侧(72)发明人王棣 王居亮 李伟 杨荣玉 唐海静 夏颖颖(74)专利代理机构济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人宋玉霞(54)发明名称 一种用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法(57)摘要 本发明提供一种以玉米淀粉生产过程中的副产品玉米粗蛋白粉为原料生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产方法，采用本方法在不添加其它碳源和氮源的条件下，单纯以玉米粗蛋白粉为营养源经过固态培养可以生产出活菌数为3000亿-5000亿/g 的枯草芽孢杆菌微生态制剂。生产过程不需要通压缩空气，不产生任何废水废气。减少了枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产成本。且所得产品以玉米纤维低聚糖为载体具有益生元的功能提高了产品质量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号CN 104988088 A (43)申请公布日2015.10.21 C N 104988088 A 1.一种用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，步骤如下： (1)取玉米粗蛋白粉移入固体发酵罐中，加水调到料水比为1：0.7-0.9，加氧化钙调pH 到6.0-7.0； (2)打开循环水使固体发酵罐温度上升到80-90℃后，通入蒸汽消毒30分钟； (3)待原料冷却到40℃-44℃后，加入物料干基重量1/9-1/10培养15h以后的种子液，固含量为5％； (4)维持30-40℃培养50-60h，24h后每隔6h搅拌一次物料； (5)培养到50-60h后，物料明显粘湿，有较浓的枯草芽孢杆菌特有气味，升温到44-56℃继续培养12-22h； (6)共计培养72h后移出物料，65-80℃烘干物料； (7)烘干物料水份到小于6％后，粉碎物料； (8)将粉碎的物料进行包装，取样检测产品质量。 2.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，料水比是指：物料干基质量即无水的物料质量。 3.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的种子液为将枯草芽孢杆菌菌种在液体培养基中通气搅拌培养15小时以后的液体培养基和菌种的混合物，所述的液体培养基为：葡萄糖5％w/w，玉米浆10％w/w,硫酸镁0.03％w/w,碳酸钙调pH到7.0，其余为黄河水，所述的玉米浆干基含量为26％。 4.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，维持温度为33-38℃。 5.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，升温到45-50℃。 6.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(4)(5)中，发酵过程罐体与空气相通，有空气过滤器装置过滤掉空气中的杂菌。 7.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，得到的枯草芽孢杆菌微生态制剂，活菌数3000-5000亿/g。 8.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，采用的玉米粗蛋白粉的情况见表1， 表1 玉米粗蛋白粉指标 蛋白质％脂肪％纤维质％淀粉％灰分％木质素％水份％玉米皮1125412 2.612 粗蛋白10 2.41250 4.6—10 胚芽粕1825314 2.3— 。 芽孢杆菌常用培养基配方 （按理说，该实验的所有培养基都在这了，后红字更为清楚些。。。摘自百度） 一、肉汤琼脂培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏15g ，NACL15g ，蒸 馏水1000ml ，琼脂18g 。调节PH7.2,0.1MPA20min 灭菌。如果用液体做培养基，则去掉琼脂即可。100 mL/组，其中20 mL 液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 2、或是（J-琼脂培养基：胰蛋白胨5g,酵母膏15g,磷酸 氢二钾3g,葡萄糖2g, 琼脂20g, 蒸馏水1000ml。调节PH7.3 —7.5Mpa 30min灭菌。） 二、过氧化氢酶测定 1、试剂：3-10%过氧化氢 2、接种与培养：一般将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30度下 培养1-2天。 3、试验方法：取一干净载玻片，在上面加一滴3-10%的双氧水， 挑取1环1-2天的的菌苔，在双氧水溶液中涂抹，如有气泡出 现（O2），作为过氧化氢酶阳性，无泡为阴性。也可以将过氧 化氢液直接加入斜面上，观察气泡的产生。 三、需氧性测定 1、培养基：酪素水解物20g,葡萄糖 10g, ,NACL5g,HOCH2SO3Na1g,HSCH2COONa2g,琼脂15g,蒸馏水1L。调节PH7.2，分装试管，0.06Mpa，30min灭菌，培养基不摆斜面。 2、接种与观察：用一小环的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中 （穿刺管底），一般与30 度培养3-7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿穿刺线生长则为厌氧菌。四、酪素水解（用于检测不同种类的芽孢杆菌是否具有分解酪素的 特点） 1、培养基 （1）脱脂牛奶制备取新鲜牛奶，煮沸后去掉上层油脂，再经离心脱脂（3000r/min,10min）,除去上层油脂，即为脱脂牛奶。（2）牛奶平板的制备取50ml的脱脂牛奶放入一只三角瓶中，另外称1.5g琼脂置于含有50ml蒸馏水的另外3只三角瓶中，然后将两液分开灭菌，0.06Mpa-20min，带冷至45-50摄氏度时， 速将两液混匀倒平板，即为牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥。 2、接种与观察 枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务 目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7) 2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27) 摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910196065.0 (22)申请日 2019.03.15 (71)申请人 河南科技大学 地址 471000 河南省洛阳市涧西区西苑路 48号 (72)发明人 吴影 田晶晶 古绍彬 孙建瑞 李长福 周艳林 周子吕 (74)专利代理机构 洛阳公信知识产权事务所 (普通合伙) 41120 代理人 时亚娟 (51)Int.Cl. C12N 1/38(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法 (57)摘要 本发明涉及一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形 成的方法，属于生物发酵技术领域，所述方法是 在凝结芽孢杆菌发酵培养的对数生长初期向培 养基中依次间隔流加葡萄糖溶液和碳酸钙，促进 芽孢的形成。与现有技术相比，所述方法碳源的 补充能够促进活菌数的增加，提高菌体密度，加 快芽孢的形成，而碳酸钙的添加能够有效地缩短 芽孢形成时间，提高芽孢数量的同时增加了芽孢 的耐受性。权利要求书1页 说明书6页CN 109880786 A 2019.06.14 C N 109880786 A 1.一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于：在凝结芽孢杆菌发酵培养的对数生长初期向培养基中依次间隔流加碳源和碳酸钙。 2.如权利要求1所述的一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖。 3.如权利要求2所述的一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于：包括以下步骤： 步骤一：将凝结芽孢杆菌原始菌种按照体积比为1:15 ~25的接种量接种于一级培养基 中进行活化培养，培养条件为：摇床转速200～220rpm、温度35～38℃、时间20～22h，培养结束得一级菌种；所述一级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖 1.6～1.8%、蛋白胨 1.0～1.4%、酵母粉 0.6～1.0%、硫酸镁 0.4～0.6%，余量为水；pH 7.8～8.2； 步骤二、将步骤一所得一级菌种按照体积比为1:30的接种量接种于二级培养基中进行发酵培养，培养条件为：摇床转速200～240rpm、温度35～38℃，时间为40-50h；当培养至第8～10h时一次性补入葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液的补入量为二级培养基总体积的1.2～1.6%，所述葡萄糖溶液的浓度为1.0g/mL；继续培养发酵至第14～18h时一次性补入终浓度为40～80g/L的碳酸钙固体； 所述二级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖 1.2～1.6%、蛋白胨 1.2～1.6%、酵母粉 0.8～1.2%、硫酸镁 0.4～0.6%，余量为水；pH 7.8～8.2。 4.如权利要求3所述的一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于：将经步骤一活化的一级菌种接种于二级培养基中经至少一次扩大培养后再进行步骤二所述发酵培养；所述扩大培养的培养条件为：接种量体积比为1:30、摇床转速200～240rpm、温度35～38℃、时间16～20h。 权 利 要 求 书1/1页 2 CN 109880786 A 枯草芽孢杆菌酶在发酵工艺上的应用 王伟王上俞志敏丛丽娜* （大连工业大学生物工程学院辽宁大连 116034） 摘要：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶的主要生产菌种之一，由于其产酶量高、种类多、安全性好、环保等优点在现代发酵工业生产中被广泛应用，其发酵生产的酶在工业、医学、食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸、水产养殖等领域均发挥着十分重要的作用。 关键词：枯草芽孢杆菌；发酵；酶 B. subtilis enzyme used in the fermentation process WANG Wei WANG Shang YU Zhi-Min CONG Li-Na* (School of Biological Engineering,Dalian polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034, China) Abstract:Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) is one of today's major producing strain of industrial enzymes,enzyme production because of its high volume,variety,safety, environmental protection,etc.are widely used in modern industrial production fermentation,fermentation enzymes produced in the fields of industry,medicine,food, feed,wash,textile,leather,paper,aquaculture and other have played a very important role. Keywords:Bacillus subtilis; fermentation; Enzyme 长期以来，枯草芽孢杆菌一直是工业微生物的主力军之一，它的使用可追溯到一千多年前，早在日本平安时代（794～1192年）日本人就已经利用枯草芽孢杆菌在大豆中采用固态发酵的方法生产他们的传统食品——纳豆，开创了利用枯草芽孢杆菌的历史[1]。由于其具有发酵周期短、产物丰富、可利用开发价值高以及作为食品药品安全性好等显著优点，使得它的应用一直延续至今，并在过去的一百多年中有了长足的进步。近年来，由于分子生物学的飞速发展，新的分子手段和技术的不断介入使得枯草芽孢杆菌的研究利用进入了新时期，在食品加工、农业生产、能源开发等方面不断地涌现新突破，在工业微生物中的地位不断得到 枯草芽孢杆菌表达载体 产品信息和说明 2005年11月 目录 1.简介 (3) 2. pHT 载体 (3) 2.1. pHT01载体图谱 (4) 2.2. pHT43载体图谱 (5) 2.3. pHT01衍生物中标签的定位 (5) 3. 实验方案 (6) 4. 参考文献 (6) 5. 订单信息，运输和存储 (6) 本载体系统由德国拜罗伊特大学遗传研究所的沃尔夫冈·舒曼实验室 开发。 仅用于科研！ 本手册由wy135033405翻译百度文库首发任何意见请PM 枯草芽孢杆菌表达载体 通过质粒在枯草芽孢杆菌中高效表达胞内/胞外重组蛋白 1.简介 革兰氏阳性菌因其在农业，医疗和食品生物技术和重组蛋白生产等方面的贡献而广为人知。在所有革兰氏阳性菌中，枯草芽孢杆菌载体因下列原因尤为引人瞩目。（一）无致病性，且一般认为安全的有机体；（二）无明显的密码子偏好性；（三）可直接将功能性胞外蛋白分泌到培养基中（目前，大约60％的市售酶由芽孢杆菌生产）；（四）具备包含转录，翻译，蛋白质折叠、分泌机制，遗传操作和大规模发酵的大信息量机体。 但是下述两个障碍减少了枯草芽孢杆菌的使用：（一）产生一定数目的识别并降解外源蛋白的胞外蛋白酶；（二）载体质粒稳定性。第一个障碍已因蛋白酶缺失株的构建而基本解决。第二个因引入使用θ-复制模式质粒被完全克服，如由天然质粒pAMβ1和pBS72衍生的一些质粒（Jannière等，1990；Titok等，2003）。 最近，基于大肠杆菌 - 枯草杆菌穿梭质粒pMTLBS72的四种不同表达载体的构建和使用展示出全面的结构稳定性，业已出版（Nguyen等，2005）。 两个新的载体pHT01和pHT43允许在细胞质中高水平表达重组蛋白，其中pHT43载体引导重组蛋白到培养基。这两个载体基于强σA-依赖性启动子的枯草杆菌gro E操纵子通过添加lac操纵子改造成为一种高效可控的（IPTG诱导的）启动子。pHT01衍生载体可与8×His 标签（pHT08），链球菌标签（pHT9）或C - Myc的标签（pHT10）相结合。 2. pHT 载体 所有在枯草芽孢杆菌的gro ESL操纵子之前使强启动子与lac操纵子融合的载体都可通过加入IPTG进行诱导。尽管当未添加诱导物时表达组件的背景表达水平很低，还是成功从约1300种诱导因子中筛选出一种来使用bga B报道基因（Phan等，2005）。当分别将htp G 和pbp E基因融合到gro E启动子时，加入IPTG后，表达的重组蛋白可能分别占细胞总蛋白的10%和13%（Phan等，2005）。热纤梭菌的amyQα-淀粉酶和纤维素酶A、B的高水平表达实验证实。该载体还插入了一个高效SD序列以及一个多克隆位点（BamH I, Xba I, Aat II, Sma I）。编码α-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域与pHT01的SD序列融合，构成了pHT43，以此获得分泌的重组蛋白。 2010No．5Serial No．218 China Brewing FPA 分别达到7105.92U/g 和1463.97U/g 。参考文献： [1]李亚澜，张建强.纤维素高效降解菌的分离鉴定及固态发酵条件的研究[D].西南交通大学硕士论文，2005. [2]姜绪林，张星元.绿色木霉固态发酵产纤维素酶的研究[D].江南大学硕士论文， 2005.[3]马旭光，张宗舟，刘星斌.航天诱变黑曲霉菌株ZM-8产纤维素酶的固态发酵条件研究[J].中国酿造，2008（23）：37-40. [4]邬敏辰， 李江华.里氏木霉固体发酵生产纤维素的研究[J].江苏食品与发酵，1998（2）：2-6. [5]GHOSE T K.Measurement of cellulose activities[J].Pure and Apply Chem,1987,58(2):257-268. [6]范艳丽，邵林广.纤维素降解菌的筛选及特性研究[D].武汉科技大学硕士论文，2004. [7]王艳昆，张建强.纤维素高效降解混合菌的筛选及其糖化发酵条件研究[D].西南交通大学硕士论文，2007. 乳酸菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称[1]。普通乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等）不易存活，不能耐受强酸、强碱和高温，不是理想的微生物制剂。于是，寻找一种抗逆性强的乳酸菌便成了研究的重点。其中最突出的是凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans ），1989年美国FDA 公布的41种可用于饲料的安 全菌株及1992年再次批准42种中包括的5种芽孢杆菌中，凝结芽孢杆菌排在第一位，其是一种可以产生乳酸的芽孢杆菌，兼具芽孢杆菌和乳酸菌的优点，且抗逆性强，能调节动物肠道微生态平衡，促进动物消化和提高动物免疫力等，现已应用于饲料工业中[2-3]。由于最终制成的菌剂要有芽孢的形式才具有高抗性，芽孢没有新陈代谢，能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等，是较为理想的微生物制剂[4]。试验主要通过摇瓶液体发酵，优化培养基及培养条件来提高凝结芽孢杆菌菌液中芽孢数，为后期的加工制成高效的凝结芽孢杆菌制剂打下良好的基础。 1材料与检验方法1.1试验材料 菌种：凝结芽孢杆菌F5（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保存）。 培养基：YPD 培养基：葡萄糖20g ，胰蛋白胨20g ，酵母粉10g ，水1000mL ；调pH 值为7.0，115℃灭菌20min 。为菌种活化时用。1.2方法1.2.1菌种活化 将保存的凝结芽孢杆菌转接到YPD 试管斜面培养基中，40℃培养24h ，备用。1.2.2活菌计数法 活菌总数测定采用稀释平板计数法[5]，芽孢计数法是把菌液80℃水浴10min 后稀释平板计数。1.2.3种子液的制备 取1环活化的菌种，接入装有50mL YPD 液体培养基 一株凝结芽孢杆菌产芽孢条件的研究 杨立华，赵述淼，冷一非，梁运祥* （华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070） 摘要：通过培养基组成正交试验及培养条件单因素试验，对一株凝结芽孢杆菌的产芽孢条件进行了优化，优化后的培养基组成 （质量分数）为酵母粉3g/L ，蛋白胨5g/L ，牛肉膏2g/L ，MnSO 40.005g/L ，NaCl 2g/L ，K 2HPO 43g/L ，MgSO 40.02g/L 。最优的培养条件为温度40℃，初始pH 值为7.0，转速210r/min ，装液量为250mL 的三角瓶装30mL ，接种量为6%（v/v ），发酵时间为48h 。最终的芽孢数为 9.1×108 cfu/mL 。关键词：凝结芽孢杆菌；芽孢形成；培养条件；优化中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2010）05-0096-03 Spore-forming conditions of Bacillus coagulans YANG Lihua,ZHAO Shumiao,LENG Yifei,LIANG Yunxiang* (State Key Laboratory of Agromicrobiology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China) Abstract:The optimal conditions of spore-forming by Bacillus coagulan were investigated using the single factor and orthogonal tests in this paper.The optimal medium were as follows :yeast extract 3g/L,peptone 5g/L,beef extract 2g/L,MnSO 40.005g/L,NaCl 2g/L,K 2HPO 43g/L and MgSO 40.02g/L.The optimal culture conditions were obtained by single-factor test as follows:temperature 40℃,initial pH 7.0,rotation speed 210r/mim,volume of shaking flask 30ml/250ml,and fementation time 48h.Under these conditions,the number of spore reached 9.1×108cfu/ml.Key words ：Bacillus coagulans ;sporulation;culture conditions;optimization 收稿日期：2009-12-26 作者简介：杨立华（1985-）,女，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向为发酵工程；梁运祥*，教授，通讯作者。 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Research Report 96·· 枯草芽孢杆菌生产工艺-实验室操作 1. 培养基 1.1 种子培养基蛋白胨1 %，酵母浸出物0. 5 %，氯化钠1 % ，自然pH。 1.2 基础发酵培养基蔗糖1 %，蛋白胨1 %，磷酸氢二钠0. 2 %，磷酸二氢钠0. 2 %，pH 7. 0。 1.3 主要试剂 蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙。 1.4 仪器设备 控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH 测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。 2.方法 2. 1培养方法 2. 1. 1菌种活化 将保存的菌种转接到斜面培养基，37 ℃培养24 h，备用。 2. 1. 2种子液的制备 取一环活化的菌种，接入装量为50 mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃，180 r/ min 培养18 h。 2. 1. 3摇瓶培养 分别取1 mL 种子液，接入盛有50 mL 发酵培养基的200 mL三角瓶中(接种量为2 % ，V/ V) 。置摇床中，30 ℃振荡培养12 h，转速为160 r/ min 3. 培养条件 3.1碳源 以葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于可溶性淀粉和玉米淀粉。最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖。 3.2氮源 氮源为有机氮源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于无机氮源。最适氮源是酵母浸出物，从发酵成本考虑，酵母浸出物、胰蛋白胨及氯化铵组成的复合氮源较合适。 4.发酵条件 4.1生长曲线 接种12 h后细菌数量开始减少，枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此，采用8～12 h 时的菌液作为菌种较合适，此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数。 4.2 初始PH 在初始pH 5. 5～8范围内枯草芽孢杆菌均可良好生长，pH 为6. 0 时生长最好，说明枯草芽孢杆菌对pH 的适应性较宽，但随pH 的增大，活菌数呈下降趋势。 4.3温度 枯草芽孢杆菌在25～40℃均可良好生长，其生长的最适温度为35℃。 4.4装液量及接种量 枯草芽孢杆菌为需养菌，在生长过程中需要大量的氧气，装液量不可过多，培养液与容器体积比可设定为2:25；接种量3 % (V/ V) 较适合其生长。 5.干燥方式 采用喷雾干燥和低温冷冻干燥。低温冷冻干燥更利于芽孢的形成，但其操作复杂、成本高，不利于规模化工业生产。而喷雾干燥同样可产生高芽孢率，且成本相对低，更适合工业生产。 目录 第一章芽孢杆菌的简要介绍 (1) 第一节芽孢杆菌种类 (1) 第二节芽孢杆菌表达系统发展简史 (2) 第二章枯草芽孢杆菌的转化系统 (3) 第一种方法：电转化 (3) 第二种方法：Spizizen转化 (3) 第三种方法：原生质体法(Takashi) (4) 第四种方法：原生质体转化之二 (4) 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） (5) 第三章芽孢杆菌表达系统发展简史 (6) 第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） (7) 第二节芽孢杆菌的缺点 (7) 第三节助表达系统 (7) 第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点 (7) 第四章枯草芽孢杆菌转录翻译系统 (8) 第一节：转录系统 (9) 第二节：翻译系统 (9) 第五章芽孢杆菌常用的宿主和载体 (10) 第六章芽孢杆菌表达系统应用实例 (11) 1 中国 (11) 2 日本 (12) 3 加拿大 (12) 第七章芽孢杆菌其他产品 (13) 第一节核苷类产品 (13) 第二节核黄素 (13) 第三节微生物制剂/益生菌 (13) 第八章结语 (14) 附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 (14) 附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 (15) 致谢及参考文献 (15) 第一章芽孢杆菌的简要介绍 芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。 目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。 第一节芽孢杆菌种类 目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至2011年10月，在KEGG 上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有： 简称菌种名称测序时间测序链接 bsu Bacillus subtilis1997RefSeq bss Bacillus subtilis subsp. spizizenii W232010RefSeq bst Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-102011 RefSeq bsn Bacillus subtilis BSn52011RefSeq bha Bacillus halodurans2000RefSeq ban Bacillus anthracis Ames2003RefSeq bar Bacillus anthracis Ames 05812004RefSeq bat Bacillus anthracis Sterne2004 RefSeq bah Bacillus anthracis CDC 6842009 RefSeq bai Bacillus anthracis A02482009 RefSeq bal Bacillus cereus biovar anthracis CI2010RefSeq bce Bacillus cereus ATCC 145792003RefSeq bca Bacillus cereus ATCC 109872004RefSeq bcz Bacillus cereus ZK2004RefSeq bcr Bacillus cereus AH1872008 RefSeq bcb Bacillus cereus B42642008 RefSeq bcu Bacillus cereus AH8202009 RefSeq bcg Bacillus cereus G9******* RefSeq bcq Bacillus cereus Q12009RefSeq 毕业设计(论文)课题名称枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究 2014 年5 月15 日 目录 摘要 (2) Abstract (3) 1 前言 (4) 2 材料与方法 (7) 2.1 实验试剂与材料 (7) 2.2 主要仪器与设备 (7) 2.3 试验方法 (8) 3 结果与分析 (8) 3.1枯草芽孢杆菌的标准曲 (9) 3.2单因素试验结果 (10) 3.3 正交试验结果分析 ···································错误！未定义书签。 4 结论和讨论 (15) 5参考文献 (16) 6致谢 (17) 枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究 摘要 本文通过单因素实验和正交试验研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的发酵条件（PH、温度、时间、接种量）对枯草芽孢杆菌生长量的影响。本实验的枯草芽孢杆菌在BPG液体培养基上培养，通过单因实验及正交试验得到最佳的发酵培养条件为：初始pH 7.0；温度35℃；时间20h；接种量为5%。在此培养条件下的活菌液量为 3.785×107CFU/ml，相比在LB培养基下培养时的活菌液量3.2×106CFU/ml提高了10倍左右。 关键字：枯草芽孢杆菌；正交试验；生长量 Optimization study of bacillus subtilis culture conditions Abstract In this paper, we study Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) fermentation conditions (PH, temperature, time, quantity of) the impact on the growth of Bacillus subtilis. The experiment of bacillus subtilis in combined cultivated in liquid medium, is obtained by single for experiment and the orthogonal experiment the best fermentation culture conditions as follows: the initial PH 7.0. Temperature 35 ℃; Time 20 h; Inoculation quantity was 5%. Under the condition of the cultivation of the best amount of bacterium fluid is 3.785 x 107 cfu/ml, compared to when cultured in LB medium under the microbial quantity: 3.231 x 107 cfu/ml by about 10 times. Key words: Bacillus subtilis; Culture conditions; increment 微生物技术综合实验 年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201 学号：1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：刘凤霞教授 日期：二零一三十月五号 目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3) 3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7) 6附录 (8) 枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅 生物工程 Vol.32,No.10, 2011 凝结芽孢杆菌CICIM B1821发酵生产L-乳酸的研究 田康明，石贵阳，王正祥* （江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江南大学生物资源与生物能源研究中心， 江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，江苏无锡214122） 摘 要：凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans ）CICIM B1821是一株实验室前期筛选获得的产L-乳酸的嗜热菌。该菌株在 34~55℃范围内均表现出良好的生长特性和产酸特性，50℃时获得最高的比生长速率和最大的乳酸积累量。CICIM B1821能够在pH 为5.0~7.5的范围内保持高的菌体活性。氧气的存在有利于CICIM B1821的快速生长，但会导致副产物的积累，而在不通氧的条件下该菌株也生长良好，同时产酸速率可高达5.63g/L ·h 。控制残糖浓度不高于10%的发酵条件下，发酵48h ，可积累乳酸107.5g/L ，副产物总和仅为1.05g/L ，葡萄糖对乳酸的得率为97.5%，所产L-乳酸光学纯度高于99%。此外，高浓度葡萄糖发酵实验显示，该菌株可在高渗透压下利用20%葡萄糖发酵生产L-乳酸，发酵100h ，可积累乳酸134g/L ，副产物总和仅为1.12g/L ，葡萄糖对乳酸的得率为92.0%。 关键词：凝结芽孢杆菌，嗜热菌，L-乳酸，发酵生产 Study on the production of L-lactate by Bacillus coagulans CICIM B1821 TIAN Kang-ming ，SHI Gui-yang ，WANG Zheng-xiang * （Culture and Information Center of Industrial Microorganisms of China Universities ，Center for Bioresource and Bioenergy ， Jiangnan University ，Wuxi 214122,China ）Abstract ：Bacillus coagulans CICIM B1821was selected for L-lactate production.Its optimal growth temperature and fermentation temperature were proved both at 50℃，and Bacillus coagulans CICIM B1821presents good growth and fermentation characteristics at temperature range from 34℃to 55℃.Bacillus coagulans CICIM B1821presented good growth and fermentation characteristics at pH range from 5.0to 7.5.The existence of oxygen was proved increasing both the biomass yield and the by-product concentration.The L-lactic acid purity was above 99%，the yield from glucose to lactate was 97.5%，and the total by-product amount was lower than 1.05g/liter ，while the lactic acid concentration was 107.5g/liter during the no oxygen flowing fermentation process with glucose concentration no more the 10%.While fermentation 20%glucose to lactate ，and the total by-product amount was lower than 1.12g/liter ，while the lactic acid concentration was 134g/liter ，and the yield from glucose to lactae was 92%. Key words ：Bacillus coagulans ；thermophile ；L-lactate ；fermentation 中图分类号：TS201.3文献标识码：A 文章编号：1002-0306（2011）10-0245-05收稿日期：2010－10－28 *通讯联系人 作者简介：田康明（1985-），男，在读博士研究生，研究方向：发酵工学。基金项目：中非国际合作重点项目（2009DFA31300）。 近年来，生物可降解聚合材料正在遍布日常生活和工业生产的方方面面。与石油来源的聚合材料相比，可降解、可再生的性能使得生物质的聚合材料需求量不断增加。而聚乳酸正是应用最广泛的生物质可降解聚合材料之一[1]。目前，90%的聚乳酸均由生物法发酵生产的乳酸加工聚合而成[2]。因此，建立高效的乳酸发酵生产工艺显得尤为重要。乳酸由L-乳酸和D-乳酸两种构型的单体组成。由于其构型不 同，两种单体及其聚合材料的应用领域也有所差异。因此，工业生产中对乳酸的构型提出了越来越高的要求，特别是在食品和医药及相关领域，高光学纯度L-乳酸的应用更为广泛。传统的L-乳酸生产菌种为米根霉，但所产L-乳酸光学纯度不高，发酵温度较低，发酵工艺不易操作等不足限制了传统方法生产L-乳酸的发展[3]。嗜热菌用于L-乳酸的发酵生产则弥补了上述不足。凝结芽孢杆菌就是典型的代表。该菌种对营养成分要求不高，可以节约发酵成本；代谢快，可以缩短发酵周期；耐受温度高，可以减少发酵过程中对冷却水的消耗，同时也减少了染菌的可能。众多研究中已经实现了不灭菌的情况下直接发酵生 DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.10.038枯草芽孢杆菌的发酵
枯草芽孢杆菌发酵工艺2
芽孢杆菌常用培养基配方
枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化
【CN109880786A】一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法【专利】
枯草芽孢杆菌酶在发酵工艺上的应用
枯草芽孢杆菌表达手册 个人翻译中文版
一株凝结芽孢杆菌产芽孢条件的研究
枯草芽孢杆菌生产工艺
枯草芽孢杆菌的介绍
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枯草芽孢杆菌实验报告
凝结芽孢杆菌CICIMB1821发酵生产L_乳酸的研究_田康明
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