实验十二蛋白质的等电点测定
目的和要求
了解蛋白质的两性解离性质，初步学会测定蛋白质等电点的方法。
原理
蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键组合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基、巯基、胍基、咪唑基等酸碱基团。因此蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。在不同的 pH水溶液中解离所带正、负电荷不同。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态出现，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点(pI)。当溶液的pH低于蛋白质的等电点时，即在H＋较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液pH大于等电点时，即在OH—较多的条件下，蛋白质分子带负电荷，成为阴离子。
不同的蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
本实验借助观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
操作步骤
一.蛋白质的两性反应
1.取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.01%溴甲酚绿指示剂5～7滴（溴甲酚绿指示剂变色的pH范围是3.8～5.4，指示剂的酸型色为黄色，碱型色为蓝色。），混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。
2.用细滴管缓慢加入0.02mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH接近于酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。
3.继续滴入0.02mol/L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明其原因。
4.再滴入0.02mol/L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。继续加入0.02mol/L氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶解?溶液的颜色如何变化?说明了什么问题?
二.酪蛋白等电点的测定
试管号
蒸馏水（ml）
0.01mol/L醋酸（ml）
0.1 mol/L醋酸（ml）
1.0 mol/L醋酸（ml）
1
8.4
0.6
—
—
2
8.7
—
0.3
—
3
8.0
—
1.0
—
4
7.4
—
—
1.6
取同样规格的试管4支，按上表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
向以上试管中加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
试剂和器材
一、试剂
1.0.5%
酪蛋白溶液(以0.01mol/L氢氧化钠溶液作溶剂)。
2.酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25g，加蒸馏水20mL及1.00mol/L氢氧化钠溶液5mL (必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00mol/L醋酸5mL(必须准确)，倒入50mL容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.01mol/L醋酸钠溶液内，酪蛋白的浓度为0.5%。
3.0.01%溴甲酚绿指示剂。
4.0.02mol/L盐酸溶液。
5.0.10mol/L醋酸溶液。
6.0.02mol/L氢氧化钠溶液。
7.0.01mol/L醋酸溶液。
8.1.00mol/L醋酸溶液。
二、器材
1.试管及试管架。
2.滴管。
3.吸量管(1mL和5mL)。
思考题
1.何谓蛋白质的等电点?
2.在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低?请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。
3. 在本试验中，酪蛋白处于等电点时则从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白质在等电点时必然沉淀出来。上面这种结论对吗 ? 为什么 ? 请举例说明。