蛋白质等电点测定及性质实验
一、目的:
了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法,了解蛋白质的性质。
二、原理:
固体颗粒在液体中为什么能够带电？
当固体与液体接触时,固体可以从溶液中选择性吸附某种离子,也可以就是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液,以致使固液两相分别带有不同符号的电荷,由于电中性的要求,带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上带电表面与反离子形成了双电层的结构。在两种不同物质的界面上,正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构,一百多年来不同学者提出了不同的瞧法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型;1910年Gouy与1913年Chapman修正了平板型模型,提出了扩散双电层模型;后来Stern又提出了Stern模型。
根据O、斯特恩的观点,一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用(例如范德华力)而与表面紧密结合,构成吸附层(或称紧密层、斯特恩层)。其余的离子则扩散地分布在溶液中,构成双电层的扩散层(或称滑移面)。由于带电表面的吸引作用,在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。离表面越远,过剩的反离子越少,直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层:溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力,范德华力或特性吸附力,而紧密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。
滑动面:指固液两相发生相对移动的界面,就是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？
ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。ζ电势的大小由Zeta电位表示,其数值的大小反映了胶粒带电的程度,其数值越高表明胶粒带电越多,扩散层越厚。一般来说,以pH值为横坐标,Zeta电位为纵坐标作图,Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说:
蛋白质分子的大小在胶粒范围内,约1～100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团,这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用,使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜,具有亲水性;又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷,会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜与双电层的存在,使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚,成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素,蛋白质溶液就会变得不稳定,两种因素都消除时,蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中,常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就就是利用蛋白质的胶凝作用。
蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系,蛋白质就是两性电解质,在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正电,在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电:
蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点(PI)。其定义为:在某一pH 的溶液中,蛋白质解离成阳离子与阴离子的趋势或程度相等时,呈电中性,此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。
等电点的应用:主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯与电泳。
蛋白质等电点的测量方式:溶解度最低时的溶液pH。
在等电点时,蛋白质分子在电场中不向任何一极移动,而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加,所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低,且溶液变混浊。蛋白质在等电点时溶解度最小,最容易沉淀析出。
蛋白质等电点的测定
各种蛋白质的等电点都不相同,但偏酸性的较多,如牛乳中的酪蛋白的等电点就是4、7~4、8,血红蛋白等电点为6、7~6、8,胰岛素就是5、3~5、4,鱼精蛋白就是一个典型的碱性蛋白,其等电点在pH 12、0~12、4。
本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定,即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值,这个方法虽然不很准确,但在一般实验条件下都能进行,操作也简便。蛋白质的等电点比较准确的方法就是采用等电聚焦技术加以准确测定,但需一定的实验条件。
等电聚焦电泳(IEF,isoelectric focusing electrophoresis)
利用特殊的一种缓冲液(两性电解质)在凝胶(常用聚丙烯酰胺凝胶)内制造一个pH梯度,电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点(pI)的pH处(此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷),形成一个很窄的区带。
IEF的基本原理
在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布就是从阳极到阴极,pH值逐渐增大。如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pl)。同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中,等电点就是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带。
沉淀反应:蛋白质在某种理化条件下,蛋白胶体溶液的水化层或者电荷层破坏,蛋白胶体相互聚集的现象。主要的沉淀现象有(1)盐析:在蛋白质水溶液中加入足量的盐类(如硫酸铵),可析出沉淀,稀释后能溶解并仍保持原来的性质,不影响蛋白质的活性。这就是一个可逆的过程,可用于蛋白质的分离与初级提纯。(2)变性:在重金属盐、强酸、强碱、加热、紫外线等作用下,引起蛋白质某些理性质改变与生物学功能丧失。这就是一个不可逆过程。
(3)加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮,它们与蛋白质分子争夺水分子,破坏水化膜,短时间内就是可逆反应;(4)加入生物碱试剂(含氮的碱性物质):能使生物碱沉淀或作用产生颜色反应的物质,