蛋白质分离纯化与鉴定
蛋白质分离纯化与鉴定是蛋白质的关键步骤，它包括从蛋白质样品中分离出蛋白质和
去除剩余的其他杂质，从而确保得到高纯度的蛋白质，同时也可以利用这一步骤对蛋白质
进行识别和定量。蛋白质分离纯化和鉴定依赖于特定的结合机制来对蛋白质样品和它们之
间的干扰进行分离，纯化和定量，重要的是选择合适的结合机制，包括静电结合、磁性
结合和生物类比结合。
静电结合是利用离子的电荷来实现蛋白质的结合的一种方法，如逆流苯胺凝胶电泳（IEX）、硼滤膜萃取（BFE）、凝胶乳液沉淀（GFC）等。其优势是有效的提取蛋白质，
不会分离出太多的杂质，因此可用于纯化以及分离同种蛋白质，但存在着选择性不高和操
作复杂的问题。
磁性分离是利用磁性粒子将蛋白质（如金蛋白）从样品中分离出来的一种技术，主要
应用于从生物体或细胞内筛选靶向蛋白质，如免疫磁珠筛选和快速免疫磁珠筛选等。优势
是极好的选择性和高回收率，缺点是不能太多的纯化和定量。
生物类比结合是指使用小分子有机分子的氢键与蛋白质聚合体的氢键形成竞争，使蛋
白质结构发生变化、表面可溶性结构发生变化，以达到蛋白质分离纯化和鉴定的目的。生
物类比结合技术同时具有高分辨率、高效率、低毒性及可控性优点。如两亲聚酰胺模型（TCA）技术、新型聚乙二醇活性纤维素（PEG）技术等。优势在于可同时提取多种蛋白质，经纯化后的蛋白质也能保留蛋白质的完整性，但缺点是技术操作比较复杂，耗时较久。
蛋白质分离纯化与鉴定是一个综合技术，因此在蛋白质分离纯化及鉴定过程中应根据
蛋白质特性，选择最适合自身情况的结合机制，进行一系列的步骤，以得到最纯净的蛋白
质分离纯化，识别和定量的目的。
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定 一、实验目的： 1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 二、实验原理： 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。 A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。 B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。 C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低
于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法 A材料 样品：人混合血清 试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl 溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓 2 冲溶液、电泳仪、电泳槽 B实验步骤 盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 具体操作流程示意：
血清清蛋白及γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定 目的要求 1．1．熟悉蛋白质分离纯化的总体思路。 2．2．掌握盐析、离心、层析、浓缩、电泳等技术在蛋白质分离纯化中的综合作用。 3．3．学会设计和制定分离纯化蛋白质的方法。 实验原理 血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。 首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度硫酸铵溶液溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。 用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。清蛋白、α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：用上述
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定 为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。 分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。 本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。其原理及操作如下： ㈠硫酸铵盐析 1.试剂 饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。 （内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0） 溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。 磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。 2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。③倾去上清液，将沉淀溶于5ml磷酸缓冲液（0.01mol/L pH7.0），再加饱和硫酸铵 3.2ml，此时溶液硫酸铵的饱和度约为33%，静置20min，以3000r/min离心15min，除去上清液，沉淀即为γ-球蛋白。 ㈡凝胶过滤脱盐 1.试剂①Sephadex G-25：用前以蒸馏水浸泡5h或在沸水浴中溶胀2h；②磷酸盐缓冲液（pH6.7，0.0175mol/L）：见前；③磷酸盐缓冲液（pH7.0，0.01mil/L）见前；④奈氏试剂； ⑤20%磺酰水杨酸。 2.操作①取层析柱一根（1.5cm×20cm），垂直于固定架上，夹住流出口。加10ml磷酸缓冲液（0.0175mol/L, pH6.7）于柱中。将已溶胀好的Sephadex G-25倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液并搅拌成悬浮液，慢慢装入柱中，打开流出口，继续加入Sephadex G-25使自然沉降至15cm高，关闭出口。②打开出口，使柱中多余的磷酸缓冲液流出凝胶柱床面（切勿低于柱床面）。用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液2ml，沿管壁加入凝胶面上，打开流出口，让样品进入凝胶柱，再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面2～3cm高，编号，按顺序放在试管架上。③在收集的同时，检查蛋白质是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱，如此直检查到蛋白质全流出为止。与此同时，再从含蛋白质的管中取出1滴于白色比色板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去，合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。 ㈢DEAE-纤维素纯化免疫球蛋白G 1.试剂①DEAE-纤维素：DE-11、DE-22、DE-32、DE-52均可；②0.5mol/L HCl溶液；③0.5mol/L NaOH溶液；④pH6.7，0.0175mol/L磷酸盐缓冲液。 2.操作
蛋白质分离纯化与鉴定 蛋白质分离纯化与鉴定是蛋白质的关键步骤，它包括从蛋白质样品中分离出蛋白质和 去除剩余的其他杂质，从而确保得到高纯度的蛋白质，同时也可以利用这一步骤对蛋白质 进行识别和定量。蛋白质分离纯化和鉴定依赖于特定的结合机制来对蛋白质样品和它们之 间的干扰进行分离，纯化和定量，重要的是选择合适的结合机制，包括静电结合、磁性 结合和生物类比结合。 静电结合是利用离子的电荷来实现蛋白质的结合的一种方法，如逆流苯胺凝胶电泳（IEX）、硼滤膜萃取（BFE）、凝胶乳液沉淀（GFC）等。其优势是有效的提取蛋白质， 不会分离出太多的杂质，因此可用于纯化以及分离同种蛋白质，但存在着选择性不高和操 作复杂的问题。 磁性分离是利用磁性粒子将蛋白质（如金蛋白）从样品中分离出来的一种技术，主要 应用于从生物体或细胞内筛选靶向蛋白质，如免疫磁珠筛选和快速免疫磁珠筛选等。优势 是极好的选择性和高回收率，缺点是不能太多的纯化和定量。 生物类比结合是指使用小分子有机分子的氢键与蛋白质聚合体的氢键形成竞争，使蛋 白质结构发生变化、表面可溶性结构发生变化，以达到蛋白质分离纯化和鉴定的目的。生 物类比结合技术同时具有高分辨率、高效率、低毒性及可控性优点。如两亲聚酰胺模型（TCA）技术、新型聚乙二醇活性纤维素（PEG）技术等。优势在于可同时提取多种蛋白质，经纯化后的蛋白质也能保留蛋白质的完整性，但缺点是技术操作比较复杂，耗时较久。 蛋白质分离纯化与鉴定是一个综合技术，因此在蛋白质分离纯化及鉴定过程中应根据 蛋白质特性，选择最适合自身情况的结合机制，进行一系列的步骤，以得到最纯净的蛋白 质分离纯化，识别和定量的目的。
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1 血液及组织样品的制备 分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用 动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或 者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化 实验。掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验 顺利进行的关键。 一、血液样品 (一）采血 测定用的血液，多由静脉采集。一般在饲喂前空腹采取，因此时血液 中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要 清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。 (二）血清、全血及血浆的制备 1.血清的制备 血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。将试管放成斜面，让其自 然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃ 恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。为了缩短时间，也可 用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸 出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。 2.全血及血浆的制备 取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的
抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。每毫升血液中加入抗凝剂 的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影 响实验的结果。将已抗凝的全二于 2，000r / min 离心10min ，沉降 血细胞，取上层清液即为血浆。血浆比血清分离得快而且量多：两者 的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。 3.抗凝剂 凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。 （1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形 成不溶性草酸钙，使血液不凝固。每毫升血液用1-2mg 即可。 配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中， 慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干 （若超过150 ℃ 则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。可 抗凝血液5ml 。 此抗凝血，常用于非蛋白氮等多种测定项目，但不适用于钾、钙的测定。对乳酸脱氯酸性磷酸酶和淀粉酶具有抑制作用，使用时应注意。( 2）草酸钾-氟化钠氟化钠是一种弱抗凝剂。但浓度2mg / ml 时能 抑制血液内葡萄糖的分解，因此在测定血糖时常与草酸钾混合使用。 配制方法：草酸钾6g、氟化钠3g，溶于100ml 蒸馏水中。每个试管加 入0.25ml，于80℃ 烘干备用。每管含混合剂22. 5mg，可抗凝5ml 血液。 此抗凝血，因氟化钠抑制睬酶，所以不能用于脉酶法的尿素氮测定； 也不能用于淀粉酶及磷酸酶的测定。 (3）乙二胺四乙酸二钠盐（简称EDTANa2 ) EDTANa2 易与钙离子络合 而使血液不凝。 有效浓度为0.5mg 可抗凝lml 血液。 配制方法：配成4 % EDTANa ：水溶液。每管装0.lml , 80 ℃ 烘干，
常用的蛋白质鉴定方法 蛋白质是生命活动中至关重要的生物大分子，其结构和功能与生物体的生命活动密切相关。为了更好地理解蛋白质的结构和功能，常常需要对其进行鉴定。以下是常用的蛋白质鉴定方法： 1.热变性法 热变性法是一种通过加热蛋白质溶液使其发生变性的方法。在加热过程中，蛋白质的构象会发生变化，导致其理化性质发生改变。通过检测这些变化，可以了解蛋白质的部分性质。 热变性法的应用：主要用于检测蛋白质的稳定性，也可以用于蛋白质的纯度鉴定和分子量测定。 操作方法：将蛋白质溶液加热至一定温度，观察其变性程度。可以通过检测溶液的浊度、吸光度、荧光强度等指标来衡量蛋白质的变性程度。 2.沉淀法 沉淀法是一种通过加入某种试剂使蛋白质沉淀的方法。常用的沉淀剂包括硫酸铵、氯化钠等。 沉淀法的应用：主要用于分离和纯化蛋白质，也可以用于蛋白质的定性鉴定。 操作方法：将蛋白质溶液中加入沉淀剂，使蛋白质沉淀。通过离心分离沉淀，可以得到较为纯净的蛋白质。同时，可以通过对沉淀物的外观、溶解性等性质进行观察，初步判定蛋白质的种类。 3.紫外线吸收法
紫外线吸收法是一种通过检测蛋白质在紫外线下的吸光度，了解其结构特征的方法。 紫外线吸收法的应用：主要用于蛋白质的定量鉴定和结构分析。 操作方法：将蛋白质溶液置于紫外光下，测量其在不同波长下的吸光度。通过对吸光度数据的分析，可以获得蛋白质的紫外光谱特征，进而推测其结构特征。 4.红外光谱法 红外光谱法是一种通过检测蛋白质在红外光下的吸收光谱，了解其结构特征的方法。 红外光谱法的应用：主要用于蛋白质的定量鉴定和结构分析。 操作方法：将蛋白质溶液置于红外光下，测量其在不同波长下的吸光度。通过对吸光度数据的分析，可以获得蛋白质的红外光谱特征，进而推测其结构特征。利用该方法需要制样，将样品与KBr一起研磨成粉末，然后压片测定光谱。 5.电泳法 电泳法是一种利用电场作用对蛋白质进行分离和鉴定的方法。由于各种蛋白质的分子量、电荷数量和形状不同，在电场中的迁移速率也会有所差异。通过电泳分离后的蛋白质条带可以进行定性和定量分析。 电泳法的应用：主要用于蛋白质的分离和定性鉴定。 操作方法：选择适当的电泳技术（例如SDS-PAGE、Native PAGE 等），将蛋白质溶液进行电泳分离。随后，对电泳条带进行染色和脱
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验 一、实验内容 将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度； 将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度； 将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。 二、实验过程： 1.蛋白质粗提液制备 溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液 （1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L； （2）250mL 2.蛋白质浓度测定 （1）溶液配制 1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。 （2）0~100ug/mL标准曲线测定： 取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL 蛋白质浓度 0 20 40 60 80 100 µg/ml 1mg/mL BSA溶 0 40 80 120 160 200 液（µl） 蒸馏水（µl）2000 1960 1920 1880 1840 1800 总体积（µl）2000 2000 2000 2000 2000 2000 测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。 （3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL 蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。 3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离 （1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。 （2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。 3、了解柱层析技术。 二、实验原理 1、粗提（盐析法）： 蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。 2、脱盐（凝胶层析法） 凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，
所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。 3、纯化（离子交换层析法） 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。 4、纯度鉴定（电泳） 采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。 三、材料与方法：以流程图示意 材料： 1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生） 2、试剂：0.3mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L 的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。 3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪。
蛋白质的提取和分离一般分为四步样品处理11 蛋白质的提取和分离一般分为四步样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 1.样品处理 (1)红细胞的洗涤 ①目的去除 ②方法离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效 果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层的红细胞液体倒入 再加入用的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间） ⑥重复4、5步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化， 不可洗涤次数过少。 (2)血红蛋白的释放 加到体积，再加40％体积的溶解细胞膜），置于上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (3) 分离血红蛋白溶液将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层第1层（最上层）甲苯层 第2层（中上层）的沉淀层，色薄层固体 第3层（中下层）的水溶液层，的液体 第4层（最下层）其它杂质的沉淀层 (4)透析 2.凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，
再用100目尼龙纱包好。 a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔； b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在0.5ml的头部切下长的一段，插入橡皮塞孔 内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。 c.剪尼龙网小圆片覆盖在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，插到玻璃管一端。 d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一 端放入收集的收集器内 ③顶塞的制作插入安装了玻璃管的橡皮塞 ④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择。 （2）方法 配置凝胶悬浮液计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 ①固定将色谱柱处置固定在支架上 ②装填将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 ③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH 为7.0）充分12小时。 3）样品加入与洗脱 （1）加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口（2）加透析样品 ①调整缓冲液面与凝胶面平齐 ②滴加透析样品用将1ml 的样品加到色谱柱的
资料范本 本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载 血清蛋白、-球蛋白的分离纯化与鉴定 地点：__________________ 时间：__________________ 说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定（一）血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化 【目的要求】 1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。 2．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。 【实验原理】 血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-β-γ-球蛋白等），由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。本实验应用不同浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。 用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。本实验采用凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差异除去粗制品中盐类。 脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。将醋酸铵溶液的浓度提高至0.3mol/L，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。 经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。为便于鉴定，常需浓缩。浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。
蛋白质的纯化和鉴定 第一章：蛋白质的基本概念 蛋白质是生物体内一种重要的生物大分子，是由氨基酸经酰基 转移酶催化反应后形成的链状高分子化合物。蛋白质是维持生命 的基础，无论是细胞的结构组成、酶的催化、激素的调节，还是 免疫系统的介导，均与蛋白质密切相关。因此，对蛋白质的纯化 和鉴定有着重要的实际意义。 第二章：蛋白质的纯化方法 2.1 植物来源蛋白质的纯化 植物来源蛋白质的纯化方法包括：溶剂沉淀、柱层析和电泳等。 2.2 动物来源蛋白质的纯化 动物来源蛋白质的纯化方法有：盐析法、柱层析法和电泳法等。 第三章：蛋白质的鉴定方法 3.1 生化鉴定方法 生化鉴定方法是对蛋白质进行性质分析的方法，包括：分子量 测定、氨基酸组成分析、紫外吸收光谱分析等。 3.2 免疫学鉴定方法
免疫学鉴定方法是利用蛋白质的免疫特性进行鉴定的方法，包括：免疫电泳、酶联免疫吸附检测等。 3.3 质谱学鉴定方法 质谱学鉴定方法是利用质谱技术对蛋白质进行鉴定的方法，包括：MALDI-TOF、ESI-MS等。 第四章：蛋白质的应用 4.1 医学应用 医学应用涉及到蛋白质的临床诊断、治疗、药物研究等领域，如：体液蛋白质鉴定、肿瘤标志物的测定、蛋白质药物的研究等。 4.2 生物工业应用 生物工业中广泛应用各种蛋白质，如：酶、抗体、生物染料等。 4.3 精细化学品合成 蛋白质还可以应用于精细化学品的合成中，如：合成荷尔蒙、 氨基酸等。 第五章：蛋白质纯化和鉴定技术的应用案例 以A公司为例，该公司开发了一种新型药物，需要提取其中的 蛋白质进行纯化并进行鉴定。A公司使用了离子交换层析、凝胶 过滤层析、超滤等方法对药物中的蛋白质进行纯化，然后进行了
蛋白质纯度鉴定 一、介绍 蛋白质是生命体内的重要组成部分，其纯度鉴定是研究和应用蛋白质的基础工作。本文将详细探讨蛋白质纯度鉴定的原理、方法以及应用。 二、蛋白质纯度鉴定的原理 蛋白质纯度鉴定的原理是基于蛋白质的物化性质和分离纯化的方法。蛋白质的物化性质包括分子量、电荷、溶解度等。 2.1 分子量鉴定 蛋白质的分子量可通过SDS-PAGE、凝胶过滤层析等方法进行鉴定。其中，SDS-PAGE是最常用的方法之一，通过对蛋白质样品进行电泳分离，根据蛋白质在凝胶中的迁移速率，可以推断出其分子量大小。 2.2 电荷鉴定 蛋白质的电荷性质可以通过等电聚焦电泳进行鉴定。等电聚焦电泳利用蛋白质在不同pH值下的电荷状态差异，通过电泳将蛋白质分离出来，可以推断出其等电点和电荷情况。 三、蛋白质纯度鉴定的方法 3.1 离子交换层析法 离子交换层析法是蛋白质纯度鉴定的一种常用方法。该方法利用蛋白质与离子交换树脂之间的离子交互作用，将蛋白质从混合样品中分离出来。通过调整溶液的离子浓度和pH值，可以控制蛋白质的结合和洗脱。
3.2 亲和层析法 亲和层析法是一种基于蛋白质与亲和基质之间的特异性结合的方法。该方法通过将具有亲和性的配体固定在层析基质上，将目标蛋白质从混合物中选择性地吸附和洗脱。亲和层析法不仅可以用于蛋白质的分离和纯化，也可以用于蛋白质与其他分子（如小分子药物、互补的DNA或RNA）的相互作用研究。 3.3 凝胶过滤层析法 凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的分离方法。该方法通过将混合物样品通过特定孔径的凝胶过滤膜，根据蛋白质的分子大小将其从混合物中分离。较大分子的蛋白质无法通过孔径较小的凝胶，进而得到纯化的目标蛋白质。 3.4 透析法 透析法是一种常用的蛋白质纯化和浓缩的方法。该方法基于溶液中溶质的浓度差异，通过使用透析袋将目标蛋白质与其他分子（如盐、小分子混合物）进行分离。透析法适用于蛋白质纯化前的提纯工作，也可以作为一种蛋白质溶液去盐和换缓冲液的方法。 四、蛋白质纯度鉴定的应用 4.1 生物学研究 蛋白质纯度鉴定在生物学研究中起着重要作用。在蛋白质结构和功能研究中，需要获取高纯度的蛋白质样品，以确保实验结果的可靠性。蛋白质纯度鉴定方法可以帮助研究人员评估蛋白质样品的纯度，以选择合适的实验条件和方法。 4.2 药物研发 蛋白质纯度鉴定在药物研发领域也具有重要意义。药物的研发过程中，需要纯化目标蛋白质，以进行生物活性鉴定、结构分析和药物相互作用研究等。蛋白质纯度鉴定方法可以帮助研发人员确定蛋白质样品的纯度，为后续研究提供基础。
文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持. 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。 1
蛋白质纯度鉴定的方法 1. 引言 在生物学和生物化学领域，蛋白质的纯度鉴定是一个重要的实验步骤。蛋白质纯度的高低直接影响到后续实验的结果和解释。因此，科研人员需要掌握多种方法来评估蛋白质的纯度。本文将介绍几种常用的蛋白质纯度鉴定方法，并讨论它们的优缺点。 2. SDS-PAGE SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和鉴定方法。它利用SDS脱变性电泳，通过蛋白质分子量的差异来达到纯度鉴定的目的。 2.1 原理 SDS-PAGE使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，将蛋白质根据其分子量大小进行分离。同时，SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）可以使蛋白质带负电荷，并且使蛋白质的二级结构失去稳定性。经过电泳后，蛋白质分子会在凝胶中移动，较小分子量的蛋白质迁移距离较远，较大分子量的蛋白质迁移距离较短。 2.2 实验步骤 1.制备凝胶：用聚丙烯酰胺和交联剂制备凝胶。 2.样品处理：将待鉴定的蛋白样品加入SDS缓冲液，并加热至95°C。 3.蛋白质加载：将样品加入凝胶孔中。 4.蛋白质电泳：将凝胶放入电泳槽，接通电源进行电泳分离。 5.凝胶染色：将凝胶染色以可视化分离的蛋白质。 2.3 优点和局限性 优点： - 简单、快速、经济。 - 可以同时分离多个蛋白质样品。 - 可以定量分析蛋白质的含量。
局限性： - 只能根据分子量差异进行纯度鉴定，不能确定是否存在多个亚单位。 - 在高分子量蛋白质的分离上有一定的局限性。 - 对某些特殊蛋白质可能无法获 得准确结果。 3. 负柱层析法 负柱层析法（Negative chromatography）是一种根据蛋白质的净荷进行纯度鉴定 的方法。通过将样品与带有正电荷的树脂或多肽交联，蛋白质的净荷与树脂上的正离子相互吸引，从而实现纯度鉴定。 3.1 原理 负柱层析法利用蛋白质的净荷特性，通过与树脂上的正离子相互吸引来分离纯化蛋白质。通常使用带有正离子的树脂或多肽作为柱填料，如DEAE-Sepharose。 3.2 实验步骤 1.柱填料平衡：用缓冲液平衡填充正离子树脂的柱填料。 2.样品处理：将待鉴定的蛋白样品加入缓冲液。 3.样品加载：将样品加入柱填料中。 4.洗脱：用适当的缓冲液洗脱未与柱填料结合的蛋白质。 5.Elution：使用与蛋白质净荷相同但浓度更高的离子洗脱已结合的蛋白质。 3.3 优点和局限性 优点： - 可以直接根据蛋白质的净荷进行纯度鉴定。 - 可以同时分离多个蛋白质样品。 - 净化效果好，可用于富集目标蛋白。 局限性： - 需要对样品进行特定的前处理以避免与树脂结合的非特异性蛋白质。 - 操作较为繁琐，耗时较长。 - 对某些特殊的蛋白质可能无法获得准确结果。 4. 免疫沉淀法 免疫沉淀法是一种利用抗体特异性识别蛋白质的方法，通过将样品与特定抗体结合，沉淀出目标蛋白质，从而实现纯度鉴定。
南方医科丈修 生物化学实验报告 姓 名: 专业年级: 组 别: 生物化学与分子生物学实验教学中心 t=r 方：
主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）: XX 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化 各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在 水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲 和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。中性盐加入蛋白质溶液后 由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋
白质分子之间聚集而沉淀。
4、 离子交换层析：离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利 用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、 醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4 它们在 pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大 小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（ Albumin ）、a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B -球蛋白、丫 -球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清 葡聚糖凝胶（G-25）层析柱 DEAE 千维离子交换层析柱 饱和硫酸铵溶液 实验流程：盐析（粗分离）一葡聚糖凝胶层析（脱盐）—DEAE 千维素离子交换层析（纯化）— 醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤: 盐析+凝胶柱层析除盐: 醋酸铵缓冲溶液 1%BaQ 溶液 20% 磺基水杨酸 氨基黑染色液 漂洗液 pH8.6 电泳仪、电泳槽 巴比妥缓冲溶液
蛋白质的分离纯化 一，蛋白质（包括酶）的提取 大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必需在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方式很多，要紧有： （一）依照蛋白质溶解度不同的分离方式 一、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为，即767克/