trna结合蛋白质的分离,纯化和鉴定
TRNA结合蛋白质的分离、纯化和鉴定是一个复杂的过程，需要涉及许多技术和实验步骤。以下是一般的实验流程：
1. 细胞培养和TRNA结合蛋白质提取：首先，需要选择一种可供TRNA结合蛋白表达的细胞。表达TRNA结合蛋白的细胞可以通过病毒转染、质粒转染或基因编辑等方法获得。然后，需要经过一系列的细胞培养、细胞裂解和蛋白质提取的步骤，获得含有TRNA结合蛋白的蛋白提取物。
2. 蛋白质组学分析：使用蛋白质组学技术如SDS-PAGE、2D-PAGE等，可以对提取物进行蛋白质分析，并定位TRNA结合蛋白的位置。
3. 亲和层析纯化：从蛋白提取物中纯化TRNA结合蛋白，可以使用亲和柱层析技术。通常，这种方法是基于TRNA分子与TRNA结合蛋白具有特异性相互作用的原理，通过对纯化物进行一系列精简的层析、洗脱和再结晶等步骤，纯化出TRNA结合蛋白。
4. 电泳分离和氨基酸测定：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对纯化的TRNA结合蛋白进行分离。分离出的蛋白质可以通过氨基酸测定，获得每个氨基酸残基的位置和序列。
5. 质谱分析：使用质谱技术，可以用于分析TRNA结合蛋白的完整的序列和特
定结构。通过使用MALDI-TOF质谱、毒蕈碱胶板电泳或其他质谱技术，可以得到蛋白质的分子质量、残基序列等信息。
6. 功能分析：最后，通过功能实验，可以确定TRNA结合蛋白通过哪些方式与其靶标mRNA或其他蛋白分子相互作用，并参与哪些细胞生物学或生物化学过程中。
RIP技术（RNA结合蛋白免疫沉淀）具体步骤及方法 RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。分析与目的蛋白结合的RNA.运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列可通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。 RIP实验流程： （一）细胞裂解液获取 A. 单层细胞或者贴壁细胞处理 1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次。 2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管。 3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞。 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min。 5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃。 B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解 C. 组织样品处理 1. 冷PBS清洗新鲜切下的组织三次。 2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数。 3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞。 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min。 5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃。 （二）磁珠的准备 A. 实验前准备 1. enpendoff管 2. 磁力架 3. 冰盒，RIP Wash Buffer置于冰上 4. 抗体，置于冰上 5. 涡旋震荡器 6. 枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水 B. 磁珠准备过程 1. 重悬磁珠。 2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照。 3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管。 4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡。 5. 将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次。 6. 用100ul的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中。 7. 室温孵育30min。
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定 一、实验目的： 1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 二、实验原理： 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。 A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。 B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。 C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低
于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法 A材料 样品：人混合血清 试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl 溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓 2 冲溶液、电泳仪、电泳槽 B实验步骤 盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 具体操作流程示意：
蛋白质分离纯化与鉴定 蛋白质分离纯化与鉴定是蛋白质的关键步骤，它包括从蛋白质样品中分离出蛋白质和 去除剩余的其他杂质，从而确保得到高纯度的蛋白质，同时也可以利用这一步骤对蛋白质 进行识别和定量。蛋白质分离纯化和鉴定依赖于特定的结合机制来对蛋白质样品和它们之 间的干扰进行分离，纯化和定量，重要的是选择合适的结合机制，包括静电结合、磁性 结合和生物类比结合。 静电结合是利用离子的电荷来实现蛋白质的结合的一种方法，如逆流苯胺凝胶电泳（IEX）、硼滤膜萃取（BFE）、凝胶乳液沉淀（GFC）等。其优势是有效的提取蛋白质， 不会分离出太多的杂质，因此可用于纯化以及分离同种蛋白质，但存在着选择性不高和操 作复杂的问题。 磁性分离是利用磁性粒子将蛋白质（如金蛋白）从样品中分离出来的一种技术，主要 应用于从生物体或细胞内筛选靶向蛋白质，如免疫磁珠筛选和快速免疫磁珠筛选等。优势 是极好的选择性和高回收率，缺点是不能太多的纯化和定量。 生物类比结合是指使用小分子有机分子的氢键与蛋白质聚合体的氢键形成竞争，使蛋 白质结构发生变化、表面可溶性结构发生变化，以达到蛋白质分离纯化和鉴定的目的。生 物类比结合技术同时具有高分辨率、高效率、低毒性及可控性优点。如两亲聚酰胺模型（TCA）技术、新型聚乙二醇活性纤维素（PEG）技术等。优势在于可同时提取多种蛋白质，经纯化后的蛋白质也能保留蛋白质的完整性，但缺点是技术操作比较复杂，耗时较久。 蛋白质分离纯化与鉴定是一个综合技术，因此在蛋白质分离纯化及鉴定过程中应根据 蛋白质特性，选择最适合自身情况的结合机制，进行一系列的步骤，以得到最纯净的蛋白 质分离纯化，识别和定量的目的。
蛋白质提取常用试剂及操作方法 一、原料选择和前处理 （一）原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 （二）前处理 1.细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 Ⅰ.反复冻融法 于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。 Ⅱ.冷热变替法 将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 Ⅲ.超声波法 暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些
RNA的分离与纯化 包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mR NA仅占1%～5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA 与mRNA上。 一、RNA制备的条件与环境 为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。 从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。 二、总RNA的分离与纯化 由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1 血液及组织样品的制备 分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用 动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或 者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化 实验。掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验 顺利进行的关键。 一、血液样品 (一）采血 测定用的血液，多由静脉采集。一般在饲喂前空腹采取，因此时血液 中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要 清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。 (二）血清、全血及血浆的制备 1.血清的制备 血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。将试管放成斜面，让其自 然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃ 恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。为了缩短时间，也可 用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸 出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。 2.全血及血浆的制备 取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的
抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。每毫升血液中加入抗凝剂 的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影 响实验的结果。将已抗凝的全二于 2，000r / min 离心10min ，沉降 血细胞，取上层清液即为血浆。血浆比血清分离得快而且量多：两者 的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。 3.抗凝剂 凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。 （1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形 成不溶性草酸钙，使血液不凝固。每毫升血液用1-2mg 即可。 配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中， 慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干 （若超过150 ℃ 则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。可 抗凝血液5ml 。 此抗凝血，常用于非蛋白氮等多种测定项目，但不适用于钾、钙的测定。对乳酸脱氯酸性磷酸酶和淀粉酶具有抑制作用，使用时应注意。( 2）草酸钾-氟化钠氟化钠是一种弱抗凝剂。但浓度2mg / ml 时能 抑制血液内葡萄糖的分解，因此在测定血糖时常与草酸钾混合使用。 配制方法：草酸钾6g、氟化钠3g，溶于100ml 蒸馏水中。每个试管加 入0.25ml，于80℃ 烘干备用。每管含混合剂22. 5mg，可抗凝5ml 血液。 此抗凝血，因氟化钠抑制睬酶，所以不能用于脉酶法的尿素氮测定； 也不能用于淀粉酶及磷酸酶的测定。 (3）乙二胺四乙酸二钠盐（简称EDTANa2 ) EDTANa2 易与钙离子络合 而使血液不凝。 有效浓度为0.5mg 可抗凝lml 血液。 配制方法：配成4 % EDTANa ：水溶液。每管装0.lml , 80 ℃ 烘干，
蛋白质亲和标记 蛋白质亲和标记是一种在研究中广泛使用的技术，主要用于蛋白质的分离、纯化和鉴定。该技术以蛋白质亲和相互作用为基础，通过将特定的化合物与蛋白质结合，从而可以选择性地捕获和分离目标蛋白质。 在蛋白质亲和标记技术中，通常使用的亲和分子包括抗体、金属离子、亲和柱和标记分子等。其中，抗体亲和标记技术是最常用的一种技术，它基于抗原与抗体的专一相互作用，通过将抗体固定在固相介质上，选择性地捕获或分离抗体所识别的目标蛋白质。 除了抗体外，金属离子亲和标记技术也是一种常用的技术。在这种技术中，一些金属离子（如镍、铜、锌、铁等）的化合物可以被用作亲和分子，它们与一些含有组氨酸残基的蛋白质结合，并帮助其在某个特定的条件下被捕获和分离。 亲和柱也是蛋白质亲和标记技术中经常使用的一种技术。通过将亲和柱上的亲和分子与特定的蛋白质结合，可以有效地从复杂混合物中选择性地捕获目标蛋白质。常用的亲合柱材料包括吸附树脂、离子交换柱、凝胶过滤柱以及亲合分子柱等。 此外，还有一些标记分子可以被用作蛋白质亲和标记技术中的亲和分子。这些标记分子通过特异性地与蛋白质
结合，从而能够选择性地捕获和分离目标蛋白质。常见的标记分子包括生物素、荧光素、信号酶和双亲嘧啶等。 值得注意的是，在使用蛋白质亲和标记技术时，需要注意选择适当的亲和分子和浓度。过高或过低的浓度都会影响捕获和分离效果。此外，还需要考虑其他因素，如选择合适的条件进行蛋白质的洗脱、结合和再生等。 总的来说，蛋白质亲和标记技术是一种十分有用的方法，可以在蛋白质的研究领域中起到重要的作用。通过选择合适的亲和分子和条件，可以有效地分离目标蛋白质并进行后续的分析和鉴定。随着技术的不断发展和改进，蛋白质亲和标记技术将在未来的研究中发挥更加重要的作用。
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验 一、实验内容 将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度； 将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度； 将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。 二、实验过程： 1.蛋白质粗提液制备 溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液 （1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L； （2）250mL 2.蛋白质浓度测定 （1）溶液配制 1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。 （2）0~100ug/mL标准曲线测定： 取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL 蛋白质浓度 0 20 40 60 80 100 µg/ml 1mg/mL BSA溶 0 40 80 120 160 200 液（µl） 蒸馏水（µl）2000 1960 1920 1880 1840 1800 总体积（µl）2000 2000 2000 2000 2000 2000 测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。 （3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL 蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。 3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离 （1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。 （2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。
蛋白质纯化和鉴定技术 近年来，蛋白质研究在生命科学领域中扮演着越来越重要的角色。作为生命体内的重要组成部分，蛋白质不仅承担着生命体内 物质转化和生长发育的任务，还在许多生理和病理过程中发挥着 不可替代的作用。因此，开展蛋白质研究对于增进人类健康和生 命科学的发展至关重要。而蛋白质纯化和鉴定技术则是蛋白质研 究的基础和关键。 蛋白质纯化是指通过一系列具有选择性的物理、化学和生物学 分离技术，将混合物中目标蛋白质从其他杂质中分离出来的过程。蛋白质纯化最初的目的是为研究人员提供足够纯度的蛋白质样品，以利于后续的功能和结构分析。随着人们对蛋白质结构和功能的 了解日益深入，越来越多的研究需要更高纯度的蛋白质。因此， 蛋白质纯化技术也越来越多地应用于生物制药、医学诊断、基因 工程和食品工业等领域。 目前，蛋白质纯化技术主要包括离子交换、分子筛、凝胶过滤、亲和层析、逆相层析、电泳法等多种方法。其中，各种方法的选 择取决于目标蛋白质的大小、形态、生物学特性和纯化要求等因素。例如，对于较小的蛋白质，分子筛和凝胶过滤法是常用的纯
化方法；对于大分子复合物或已知的结构域，亲和层析法则经常 用于富集目标蛋白质。 然而，蛋白质分离纯化的过程中常常伴随着蛋白质的失活、失 去特异性或聚集等问题。为了克服这些问题，一些辅助工具也被 应用于蛋白质纯化，例如保护剂、还原剂、表面改性剂等。同时，对于一些需要保持天然结构和功能的蛋白质，需要采用温和的纯 化条件，例如低温、原处性、无需或少需添加保护剂等。 纯化后的蛋白质如何鉴定其纯度和质量也是蛋白质研究中的重 要问题。传统上，蛋白质纯度评估主要依靠胶体银染、染料结合、免疫学检测、活性分析等方法进行。这些方法虽然直观、便捷， 但存在一定的局限性。例如，胶体银染法中银染胶对经典的低丰 度致癌基因表达的靶分子能够检测得非常精细地蛋白质表达分析 方法，但是其重复性和定量性相对较差。因此，近年来，许多高 通量和高分辨率的蛋白质鉴定技术被提出并得到成功应用。 蛋白质鉴定技术的发展对于蛋白质研究起到了重要的促进作用。例如，近几年来，质谱法作为蛋白质识别和鉴定的有力工具被广 泛应用。质谱法通过测定蛋白质分子量、氨基酸序列和翻译后修 饰等特性来鉴定蛋白质的纯度和质量。同时，通过对纯化样品和
蛋白质复合物的分离纯化及结构鉴定 蛋白质是一个关键的生物分子，是所有生命活动的重要组成部分。它们由氨基酸组成，在细胞内负责许多生物功能，如构建细胞结构、代谢、信号传递和基因表达调节。正因为如此，对蛋白质复合物的研究和分析，对于广泛的生物医学领域都有着极其重要的意义。 蛋白质复合物是由两个或多个蛋白质相互结合而成的复合物。在生物系统中，不同的蛋白质通过相互作用或结合形成复合物，然后再与其他生物大分子分子（如核酸，碳水化合物等）进一步相互作用。因此，蛋白质复合物的功能相对于单独的蛋白质单元，具有更高的特异性和活性。 然而，要研究和分析这种复杂的物质，需要提取、分离、纯化和鉴定它们的化学结构。这里我们来介绍蛋白质复合物的分离纯化及结构鉴定方法。 蛋白质复合物分离纯化的方法 分离纯化蛋白质复合物需要采取一系列方法，这些方法包括离心、柱层析、电泳、质谱等。这些方法不仅能对蛋白复合物进行有效的分离纯化，而且能够提供关于蛋白复合物结构和功能的详细信息。 离心 离心是利用重力作用将不同大小的颗粒分离开的一种方法。这个原理也可以用于分离不同大小的蛋白质复合物。采取极高速度离心的形式，离心能够快速分离出高度纯化的复合物，以便进行后续分析。然而，该方法的限制在于它仅能分离基于大小差异的蛋白质复合物。 柱层析 柱层析是一种利用化学性质或大小/形状差异区分蛋白质的方法。常用的柱层析包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析和尺寸排斥层析等。其中凝胶层析是一
种分离蛋白质的最常用方法。它是通过将样品在列有多种聚合物（如凝胶、聚丙烯酰胺等）的柱上运行，使蛋白质基于他们的大小差异，以一定的速率向下流动，根据质量、形状、电荷或亲和力进行分离。 电泳 电泳是一种通过在电场中将分子带动移动，根据它们的电荷和分子重量分开的方法。离子电泳和凝胶电泳是最常用的两种电泳方法。离子电泳利用离子的运动在不同的pH值下移动的速度承载的差异来分离分子。凝胶电泳则是将样品分离到高聚合物凝胶上，并使用电场将它们从凝胶带到电极上的一种分离方法。 质谱 质谱可以用于分析蛋白质复合物的化学计量学和结构。通过对质谱图的分析，可以确定复合物的质量、成分和结构。离子轰击质谱（MALDI-TOF、ESI-MS）是最常用的两种质谱技术。这种技术会将样品中的蛋白质分解成小碎片，并在离子化的过程中进行鉴定，得到蛋白质的确切质量和结构的信息。 蛋白质复合物结构的鉴定方法 质量光谱仅能确定蛋白质复合物化学计量和部分的结构信息，而X射线晶体结构学、冷冻电镜（cryo-EM）和核磁共振谱（NMR）是目前最为常用的结构鉴定方法。这些技术允许研究者确定蛋白质复合物的高分辨率的三维结构，以便进行更加深入的研究。 X射线晶体结构学 X射线晶体学是一种通过研究蛋白质晶体组织中的透射X射线从而得到完整结构信息的方法。成品结晶的蛋白质复合物，会预先通过X射线的暴露进行X射线晶体结构分析，这是一种极精细的方法，允许获得非常高分辨率的蛋白质复合物结构，但是需要极高精度、时间和花费的装置和设备。 冷冻电镜（cryo-EM）
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
蛋白质的分离纯化方法 2。1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等.透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法.透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小.所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开.例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3].使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度.密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低.蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析，是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一.凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之，比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外.目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果，纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12）、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质［7]. 2。2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下，不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度，根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法.每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
蛋白质和酶的别离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的别离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的别离纯化方法基本是采用蛋白质的别离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的别离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质别离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的外表活性剂〔Triton和Tween〕 (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级别离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 防止蛋白质的变性〔pH、适合的温度和缓冲体系等〕 二、常用的蛋白质的别离纯化技术 可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计别离方法。 〔一〕根据蛋白质的溶解度不同进行别离
蛋白质的分离与纯化 蛋白质分离纯化的大体流程 一、材料的选择和预处置 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料要紧依据实验目 的来确信。 从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰硕及本钱低的原料。 对动物组织，必需选择有效成份含量丰硕的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和 脂肪组织。 对预处置好的材料，假设不当即进行实验，应冷冻保留，关于易分解的生物大分子应 选用新鲜材料制备。 二、细胞的破碎 （一）机械方式：要紧通过机械切力的作用使组织细胞破坏。 切力对分子破坏较小。 （二）物理方式：要紧通过各类物理因素的作用，使组织细胞破碎。 （三）化学及生物化学法 细胞器的分离 制备某一种生物大分子需要采纳细胞中某一部份的材料，或为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，避免其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，以便于取得更好的分离成效。 细胞器的分离一样采纳差速离心法 细胞通过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。 细胞器的分离制备，介质的选择现一样用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等溶液。 三、蛋白质的提取 提取是将通过预处置或破碎了的细胞或组织置于必然条件下的溶剂中，让被提取的蛋白质
以溶解状态充分地释放出来，并尽可能维持原先的天然状态，不丢失生物活性的进程。 大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。 抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成份等条件的选择应依照欲制备的蛋白质的性质而定。 膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一样要加入表面活性剂，使膜结构破坏，利于蛋白质 与膜分离。 在抽提进程中，应注意温度，幸免猛烈搅拌等，以避免蛋白质的变性。 水溶液提取法 ℃以下）操作 pH 范围 有机溶剂提取法 的变性失活。 表面活性剂的利用 关于某些与脂质结合的蛋白质和酶，能够采纳表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸 钠等处置。 表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60 及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引发酶失活，利用较多。 对提取物的爱惜 不管用哪一种方式破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使生物大分子降解，致使天然产物的量减少。 二异丙基氟磷酸（DFP）能够抑制或减慢自溶作用； 碘乙酸能够抑制活性中心有巯基的蛋白水解酶的活性