哺乳动物自噬研究方法
【摘要】
自噬涉及到许多的生理和病理过程，因此，我们越来越需要科学地准确认识，并且量化操控自噬的过程。但是，由于自噬涉及了许多动态复杂的过程，关于它的研究分析经常不正确。在本文中，我们探讨监控自噬以及调控自噬活性的各种方法，主要集中关注哺乳动物中的大自噬。
【简介】
过去的十年中，有大量的研究围绕一个基本的细胞生物学通路“自噬”（希腊语中意味自我吞噬）。一系列进化上保守的基因（最初在酵母中被鉴定）被发现是自噬过程中所必需的，这一发现使得科学家能够去发现大量的自噬的功能，如：维持自身平衡稳态、参与细胞发展和其他生理活动。此外，越来越多的证据证明自噬的失控可能与许多哺乳动物的疾病发生有关。因此，科学家们迫切需要能够准确的检测自噬和研究在不同生物学进程中的功能的方法，特别是在哺乳动物系统。
在哺乳动物自噬的研究历史中一直有两个主要的困扰。首先的挑战在于如何将“一个动态的进程”和“静态的测量”进行捕获，并且这个固有的局限性与基于这些测量作出的生物学推论相关。第二个挑战在于将“形式”与“功能”分离，并且避免在给定的生理条件下，基于自身检测到（或没有）导致的将生理功能归至自噬的这个常见陷阱。这两个挑战可能导致了在我们研究哺乳动物自噬功能的历史中的许多误解。例如，一些神经退行性和肌退化性疾病最初被认定的结果，至少一部分被认为是由于自噬的增加（基于显微镜下观察到通路中早期的中间产物的增加）。然而实际上，早期中间产物的蓄积在这些疾病中代表着后阶段自噬通路的阻滞。自噬的一个常见的形态特征是细胞的垂死状态，但这也被错误的认为是一种细胞死亡通路，然而，现在似乎已经很明确自噬的主要功能是帮助细胞抵抗各种“生死攸关”的应激条件并使细胞存活。
这些哺乳动物自噬研究中的历史挑战部分已经通过将阐述自噬分子机制的最新进展运用到新的自噬研究的方法被克服。因此，在过去的十年里，许多新的技术被发明，用于动态监控自噬和通过调控自噬来明确其在给定的细胞状态下的功能。本文的目的在于提供一个重要的关于目前可行的研究哺乳动物自噬的技术和这些技术在解释过程中的限制的概述。更多的各种技术的细节信息可以再其他综述中获得。
自噬的基础知识
自噬是一般用于描述细胞内物质包括细胞器到溶酶体中降解的过程。在自噬的三种类型中（大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬），研究得最多的就是大自噬。分子伴侣介导的自噬是通过伴侣蛋白展开蛋白质，直接将细胞质蛋白转移，穿过溶酶体膜。小自噬涉及溶酶体膜表面的内陷提供一小部分细胞质进入溶酶体内腔。
大自噬（简称自噬）是本文主要关注的通路。这个通路从酵母到哺乳类都呈现保守，它是通过一些特定的细胞器（自噬体）介导的。在初始的诱导阶段，一个小的囊状的称作隔离膜或者延长的吞噬膜，随后封闭一部分细胞质，导致双层膜结构即自噬体的形成。然后自噬体的外膜融合至一个溶酶体（形成自噬溶酶体），导致所封闭的物质和自噬体的内膜共同降
解。核内体可以先与自噬体融合（形成自噬内涵体）在于溶酶体融合。氨基酸和其他小分子物质通过自噬降解生成被运送回胞质用于能量的生成和循环。下面讨论的检测自噬通路不同阶段的方法（如早期自噬体、自噬溶酶体、自噬性降解产物），这些检测结果需要与其他的结果一起看才能判断自噬通路中间物的增多是否代表着真的自噬降解增加，或者相反会阻碍自噬通路的形成。
在生理情况下，自噬有很多作用，诸如在饥饿时维持氨基酸的来源、胚胎植入前的发育，预防神经退行性变化、抗衰老、肿瘤抑制、清除细胞内微生物和调节先天和适应免疫。自噬的一个重要特征是它的动态调节，细胞的自噬活性在基础条件下是比较低的，但是可以通过许多刺激显著的被提高。最著名的自噬诱导就是乏营养的饥饿，这在细胞培养和完整的生物体包括酵母到哺乳动物都适用。除了饥饿，自噬还可以被一些生理应激刺激（如缺氧、能量消耗、内质网压力、高温、高密度条件），激素刺激、药物成分（如雷帕霉素和其他下文要讨论的物质），固有免疫信号和疾病，如细菌病毒寄生虫感染、急性的胰腺炎和心脏病以及蛋白聚集疾病所激活。相反，自噬的抑制常常和一些特定的疾病相关，包括一系列的癌症，神经退行性失调、感染性疾病、炎症性肠病有关，并且自噬功能的减弱是衰老的普遍特征。考虑到自噬和不同的生理学以及病理生理学过程的重要相关性，在自噬研究方面有一个对于科学方法的不断需求，在给定的生物事件中中准确判断自噬是否存在上调或者抑制以及基本的自噬和/或被修饰的自噬是否（以及如何）在研究的生理或病理生理的一些过程相关。
自噬的发生和一系列进化上保守的基因产物相关，被称为Atg蛋白，这些蛋白对于隔离膜和自噬体的形成是必需的。自噬体形成的过程包含两个重要的步骤，成核和隔离膜的延伸，ULK/Atg1激酶复合体，自噬特异的磷脂酰肌醇3-激酶复合体，磷脂酰肌醇三磷酸效应物以及和它们相关的蛋白对于成核的步骤是重要的，Atg12和LC3/Atg8接合系统对于延伸的步骤是重要的。此外，在自噬中还有其他的蛋白对于自噬体溶酶体的融合，溶酶体酸化溶酶体消化，整合环境线索的调节信号是必需的。自噬的详细分子调节机制在其他文章中已经被阐述过，咋哺乳动物细胞中，大多数Atg蛋白在隔离膜上被发现（比如ULK1/2,Atg12,FIP200, Atg101,Beclin1,Atg14,LC3,Atg12,和Atg16L1）。但是没有在完整的自噬体上发现，迄今为止，只有一个酵母Atg8蛋白同源的微管相关蛋白LC3被发现存在于自噬体上，因此，这个蛋白被广泛用作自噬体的标记。自噬体的鉴定极大地方便了自噬体的探究（通过基于LC3的生化和显微镜方法），也极大地提高了针对自噬体的实验操作的可行性（自噬体基于的敲除或者显性自噬负调控蛋白的表达）。自噬途径可以用一些试剂操作来调节自噬体的形成或者随后降解的过程。
细胞自噬活性监控
一个普遍的误解就是关于细胞中增加的自噬体数量和细胞自噬活性增加相关，考虑到自噬体是动态途径中的一个中间结构，在任何时间点观察到的自噬体数量使它们产生率和它们转变为自噬溶酶体速率的平衡。因此，自噬体的累积既可能代表自噬被诱导，也可能代表自噬下游途径部分自噬体形成步骤被抑制。比如，与基础水平的自噬相比，自噬的激活可以体现在所有自噬结构（隔离膜、自噬体和自噬溶酶体）的数量增加，如果自噬体形成的上游过程被阻断，所有自噬结构的数量都会减少，相反，当自噬下游通路被阻断时，则会导致自噬体数量的增多和自噬溶酶体数量的减少。显然，在相反的两个生理学过程中，自噬的激活（和自噬降解的增多）和自噬下游过程的阻断（和自噬体降解的减少）都会导致自噬体数量的增多。
因此，通过自噬体数量的简单检测来对自噬活性进行估计是远远不够的，而且不同方法需要在区别自噬基础水平、自噬诱导、自噬上游过程的抑制和自噬下游过程的抑制方面达到一致。“自噬流量”这一项被用来指示自噬体合成的动态过程，自噬底物想溶酶体的运输，溶酶体中自噬底物降解产物的量，是一个相对于自噬体数量的测量更可靠的自噬活性指示物。在后文中，我们将讨论观察自噬体和姿势流量数量的不同方法。
自噬体数量的观察
三个主要用于检测自噬体数量的方法包括：电镜观察、光学显微镜LC3亚细胞定位，LC3膜相关类型生化分析。
电镜观察
电镜观察是一种最传统的方法，事实上，哺乳动物自噬现象最初就是在20世纪50年代末电镜学家在观察溶酶体时发现的。在超微结构水平，自噬体被鉴定为一个双层膜含有胞质组分未和溶酶体融合的结构。自噬体通常包含一些细胞器比如线粒体和内质网的碎片。由于这个检测手段很直接，鉴别自噬体或者至少包含细胞组分的细胞器很容易。现在还不能很好的说明这个双层膜结构是如何包裹胞内特异的病原体的，有一些病原体的生活史可能包含通过自噬的中间结构（没有最终递呈到溶酶体）。然而对于其他的情况，胞内病原体被自噬途径捕获最终到溶酶体降解。另外一个要考虑的就是古典的自噬体鉴定包括双层膜中不同细胞组分的可视化，虽然这个可能在“大量自噬”事件中发生，但是有越来越多的证据表明存在细胞器特异性的自噬，包括过氧化物酶体自噬、线粒体自噬、核糖体自噬和内质网自噬，因此，过去用于鉴定自噬体的标准应该被修改为包括最近在哺乳动物细胞中发现的病原体特异性和细胞器特异性的自噬的证据。
和自噬体包含的胞内物质（很容易鉴定）不同，来自细胞内其他被膜小室的自噬溶酶体的特征往往更为复杂。自噬溶媒体是有自噬体和溶酶体融合形成的混合细胞器（核内体可能也参与其中），其含有单层限制性的膜结构，并且在不同的降解时期内含有胞内物质。在早期，内部的物质可以被识别是否来源于胞质。然而，如果降解已经发生很久了，其内部物质是否起源于胞质就很难说了。此外，区分自噬溶酶体和其他内吞小室（异噬小泡）或者不知源于哪里的小泡结构是很困难的。特别的是，内部没有或者几乎没有物质的小泡不应该被认为是自噬结构，这些误解在另一篇综述中的其他例子中提到过，因此，电镜虽然是一个强有力的工具，但是它不是一个完美的方法，而且其会在下面描述的功能学研究中的应用受到限制。
荧光显微镜技术
自噬体数量的电镜检测需要大量的专业知识，正在逐渐被不同领域的研究者都能广泛使用的光学显微镜和生化分析方法所取代。如前文所述，哺乳动物自噬蛋白LC3是自噬体的一种标记物，在4种LC3亚型中，LC3B被广泛使用，合成后不久，初期LC3在C端和Atg4相互作用变成LC3-I，在C端含有一个甘氨酸残基。LC3-I随后与磷脂酰乙醇胺作用通过泛素样酶的作用变为LC3-II（LC3-PE）。和LC3-I的细胞质定位不同，LC3-II存在于自噬体的
内外膜，和溶酶体融合后，外膜的LC3被Atg4降解，内膜的LC3被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中LC3含量很低。因此，內源LC3或者GFP-LC3无论是作为胞质中弥散性物质还是出现在自噬体的颗粒结构够可以被荧光显微镜观察到。
虽然每个细胞颗粒LC3或者GFP-LC3的数量可以精确的表示自噬体的数量，但是这个方法仍然可能存在陷阱，首先就是主观因素，实验制定者们需要建立和运用一个统一的方法，同时考虑到定量和对于颗粒物的鉴定标准。颗粒结构的数量可以通过观察（双盲）或者利用电脑图像分析系统软件来鉴定。虽然在自噬被诱导后颗粒结构的数量显著增多，但是在正常条件下任然会有小数目的颗粒结构被观察到。因此，含有GFP-LC3的颗粒物质的细胞百分数不是一个合适的指标（理论上，这个数值对于大多数细胞来说应该是100%）。除非通过建立一个可以有效区分“自噬活跃”和“自噬不活跃”的阈值，结果将可以这样被描述：含有多余特定数目的颗粒物质的细胞百分数。总之，再被评价的细胞中量化“每一个GFP-LC3的平均目数”是更好的。每一个细胞GFP-LC3的总面积可以图形分析软件来分析，但是在这样的一个情况，在GFP-LC3聚集体形成的过程中消除实验的人工误差尤为重要。
LC3或者GFP-LC3颗粒结构的检测作为观察自噬体数目的方法的第二个可能的陷阱是GFP-LC3和內源的LC3如果过表达或者和其他聚集倾向的蛋白共表达后很容易聚集起来。GFP-LC3聚集体和真正的自噬通过荧光显微镜不容易区分。然而我们可以进行特定的预防降低GFP-LC3聚集的可能性。稳定的GFP-LC3转化株被强烈推荐使用，因为我们可以筛选出来表达合适水平GFP-LC3的克隆而没有人为的聚集。当GFP-LC3被用作瞬时转染时，应该进行预防避免过量的表达从而产生聚集。此外，通过利用C端甘氨酸突变的GFP-LC3的实验来区分成为聚集体的非特异性的GFP-LC3和通过进入自噬体的GFP-LC3是可能的，这个突变的GFP-LC3和磷脂酰乙醇胺的泛素样接合能力减弱作为负调控，在那些自噬体数量真实增加（相对于非特异性的GFP-LC3聚集）的境况中，我们会看到野生型GFP-LC3颗粒数目的增多而不是突变型GFP-LC3颗粒数目增多（假设野生型和突变型GFP-LC3可以表达为可供比较的水平）。
通过产生转基因GFP-LC3转基因小鼠，GFP-LC3标签方法被成功应用于体内哺乳动物自噬研究，在模式生物中也运用了相似的方法，包括果蝇、线虫、植物和斑马鱼。在GFP-LC3转基因小鼠中，GFP-LC3在CAG启动子的控制下无处不表达，GFP颗粒的累积经过24小时的快速期后几乎在所有组织中都能观察到。其中大脑是一个例外，经过48小时饥饿后仍然没有观察到GFP-LC3颗粒的累积，这一点可能暗示大脑中缺乏通过营养状态调控的自噬，或者在大脑中存在更快的自噬流动。除了全身的GFP-LC3转基因小鼠，还有表达GFP-LC3和mCherry-LC3的组织特异转基因小鼠。这些全身性和组织特异性的模型被成功的用来表明在自噬基因缺乏的小鼠中自噬体数目的降低。它们也被用来展示在疾病或应激条件下自噬体数目的增多，比如，在肝细胞中表达一种ɑ1-抗胰蛋白酶z变体，在有突变的退化的浦肯野细胞轴突增强了兴奋性中毒，在和压力相关的心肌细胞中过表达一种突变的αβ-晶体蛋白。因此在GFP-LC3转基因小鼠中观察GFP-LC3颗粒来测定不同生理和病理生理刺激是否在体内调节自噬体的数目的一个很好的方法。
生化分析
LC3除了在荧光显微镜分析中的作用，还可以用作生化分析来检测自噬体的数量，内源LC3-I到LC3-II的转变和GFP-LC3-I到GFP-LC3-II的转变可以分别用抗LC3和GFP的抗体用免疫印迹检测到。虽然LC3-II的实际分子量比LC3-1大，但是LC3-II在SDS-PAGE
中比LC3-I迁移的快，因为LC3-II极度疏水（这个常常因为表观分子量减少而被误认为“加工”。）LC3-II的数目通常和自噬体的数目有很好的相关性（或者更精确的说，理论上，带有LC3-II标签的自噬膜）。然而，并不是所有的LC3-II都存在于自噬膜上，而且重要的是，一些LC3-II似乎以一种自噬的方式产生，比如相当大量数量的LC3-II在FIP2000和Atg14缺失的小鼠胚胎成纤维细胞，在Beclin-1缺失的胚胎干细胞和在RNAi介导的Beclin1，Atg13，Atg14和Vps34抑制的细胞中被检测了，虽然自噬体的形成和自噬流量被完全或深度抑制。相似的，在酵母中，在atg1,2,6,9,13,14,16和17的突变种发生了Atg8脂化。因此，那些自噬机制特定组分未被激活的情况下，即使检测到LC3-II而自噬被抑制也是有可能的。在这些情况下，我们需要包括GFP-LC3标签法和自噬流量分析在内的其他方法来测定自噬活性。
Figure4.Methods for Monitoring Auto-
phagosome Number and Autophagic Flux
(A)Detection of autophagosomes and autolysosomes by conventional electron microscopy.
(B)The GFP-LC3(or endogenous LC3)puncta formation assay counts the average number of punctate structures per cell by fluorescence microscopy.
(C)Detection of the conversion of LC3-I(cytosolic form)to LC3-II(membrane-bound lipidated form)by immunoblotting.
(D)In the LC3turnover assay,degradation of LC3-II inside the autolysosome is estimated by the comparison of two samples with and without lysosomal inhibitor treatment.
(E)Degradation of autophagy-selective substrates such as LC3and p62is detected by immunoblot-ting(LC3is part of the autophagy machinery rath-er than a true substrate but is selectively degraded by autophagy).The degradation of GFP-LC3can also be quantified by flow cytometry.
(F)Detection of autophagosomes labeled with a yellow signal(mRFP-GFP-LC3)and their maturation into autolysosomes labeled with a red signal(after quenching of GFP fluorescence in the lysosome).
(G)Detection of the GFP fragment generated by the degradation of GFP-LC3inside autolysosomes by immunoblotting with an anti-GFP antibody.
(H)Measurement of long-lived protein degradation that is suppressed by autophagy inhibitors.
注意
需要注意有时在文章中用的特定方法在这领域的大多数专家都认为用来测定自噬体的数量（或者自噬的活性）是不合适的。比如，溶酶体的数目和活性对于自噬来说不是一个可靠的一般指示物，虽然它可能在果蝇中起作用。因此，至少对于哺乳动物细胞来说，我们不推荐使用溶酶体示踪，吖啶橙、或者单丹黄酰尸胺（单丹黄酰尸胺MDC起初被认为是自噬体的特异指示物，但是最近证明其和溶酶体有高度亲和性）。第二虽然哺乳动物的LC3，酵母的Atg8，和其他特定的自噬基因可能会由自噬诱导的压力环境导致其自身转录上调，但是没有明显的证据表明自噬活性本身会被转录上调，此外，Atg构成蛋白蛋白表达量是足够的，并且它们的转录后修饰和/或其他自噬机制和其他膜的作用而非表达水平的调节，似乎对它们在自噬途径中的活性是重要的。因此，Atg的mRNA或者蛋白表达水平并不能被认为是观察自噬的合适的指示物。
自噬流量监测
上文谈到的方法对于测定细胞自噬体的数目是有用的，这个通常并非总是是细胞自噬活性水平的指示物。正如上文所讨论的，自噬体数目的累积并非总代表自噬的诱导，也有可能代表自噬体的持续产生和/或自噬成熟过程以及自噬途径完成的阻断。对于LC3的测定也是这样的。比如，如果用一种减弱溶酶体酸化的试剂氯喹来培养细胞，即使在正常情况下LC3-II 也会积累因为基础自噬中LC3-II的流通被阻断了。因此，仅仅通过自噬体数目的测定（比
如通过电子显微镜或者光学显微镜对LC3或者GFP-LC3的检测）或者检测LC3-II的水平（免疫印迹分析），我们不能够区分真正的自噬诱导和自噬溶酶体成熟化的减弱。在大多数的实验条件下，区分自噬体的积累是由于自噬的诱导还是下游步骤的阻断是有必要的，可以通过自噬流量分析的方法来区分两者，需要注意的是，通过电子显微镜对自噬体或者自噬溶酶体的定量或者相对定量有助于区分自噬的激活（自噬体和自噬溶酶体数量均增加）和自噬体成熟过程被阻断（自噬体数量增加而自噬溶酶体数量不变）。然而电镜并不能提供溶酶体底物降解的直接信息，因而我们不能把它归为自噬流量监测的方法。
LC3流量测定
现在用于测定自噬流量的一个主要方法是测定LC3的流量，这个方法基于LC3-II在自噬溶酶体中被降解的观察。正如上面所描述的，如果细胞用可以抑制溶酶体酸化或者抑制自噬体和溶酶体融合的溶酶体趋向药物如氯化铵、氯喹或者巴弗洛美素A1处理或者用溶酶体蛋白酶抑制物比如E64d和抑肽素A处理，那么LC3-II的降解就会被阻断，导致LC3-II的累积。因此在现有样品和溶酶体抑制物缺失样品LC3-II数量的不同代表了LC3-II被溶酶体降解了。比如即在非饥饿条件下用氯喹处理细胞，LC3-II水平还是会增加。然而，在饥饿条件下原有的和加入氯喹后LC3-II降低水平更大的表明在几个时自噬流量增加了。
虽然LC3流量测定在理论上很简单，但是在实验条件下，获得有意义的结果并可以推断姿势流量是有挑战性的。这可能部分反映了这个方法的高度敏感性，尤其是即使在基础环境下（比如，在基本培养基上生长的Hela细胞）较高的流出速率可能被检测到，这使得在这些环境中在自噬上调的情况下检测到额外的LC3流量变化变得困难。因此，我们假设LC3流量的测定并不应该是测定自噬流量的单一必要条件。然而在某些情况下，它应该被看做是自噬流量的可靠指示物，但是在另外的一些情况下，自噬流量需要和其他技术（下文所述）相结合来测定，这样产生更多有用的信息。
LC3的降解和选择性底物
因为LC3被自噬所降解，所以总LC3的减少是自噬流量的很好指示物。即使是在饥饿诱导后瞬时增加的LC3-II在经历了长时间的自噬活化（比如超过两小时的饥饿）后依然会减少，相似的，在处于饥饿状态下的细胞存在大量的GFP-LC3颗粒，但胞质和核的GFP-LC3
的信号都在自噬诱导后减弱了。总GFP-LC3表达量的减少可以通过敏感定量的流式细胞仪检测到。因此，和自噬流量呈反相关的总胞质LC3可以通过免疫印迹分析或者流式细胞定量（或者通过荧光显微镜观察）。这一点牵涉到了在LC3组织学染色研究中很重要的一点，增强的LC3染色有时可以作为自噬激活的证据，但是这样的观察结果可能反过来表明自噬被抑制了，导致自噬溶媒体中LC3降解减少。
除了LC3，其他自噬底物水平也可以用来监测自噬流量。过去，自噬被认为是一个随机的降解系统，然而最近的研究表面几种特异性的底物优先通过自噬降解，研究最清楚的是p62(也被称作为SQSTM1/sequestome1)，通过直接和LC3接合，p62被包含进自噬体中被高效降解，因此胞质总p62表达量和自噬活性呈负相关。比如，在自噬缺失的细胞中，饥饿诱导不会导致p62水平降低反而会导致p62积累。在大量的试验中，胞质p62的测定似乎和自噬流量的其他参数有很好的相关性，并且总体来说，这一方法看似很有前景，然而应该注意的是目前还不清楚p62是否只通过自噬降解还是部分通过泛素蛋白酶体途径降解。此外p62和LC3一样可以通过自噬被转录上调，这一点会与关于p62和LC3作为自噬流量的指标物的理解混淆。考虑到这些可能的限制条件，我们建议自噬底物水平的测定应该和其他的独立实验结合来测定自噬的流量。
mRFP-GFP-LC3到溶酶体的递呈
另外一个测定自噬流量的方法基于溶酶体可以猝灭GFP标记的自噬底物，如LC3中的GFP信号。GFP是一个稳定的折叠蛋白并且可以相对抵抗溶酶体的蛋白酶，然而溶酶体的低PH环境可以猝灭GFP的荧光信号，使得追踪GFP-LC3向溶酶体的递呈变得困难，实际上，大部分GFP-LC3颗粒并不和溶酶体共区域化。与其相反，RFP(和其他的红色荧光蛋白，比如mCherry)在酸性环境中会体现出更稳定的荧光，并且mRFP-LC3在自噬溶酶体中很容易被检测到。通过利用这两种荧光蛋白在性质上的不同（也就是说，溶酶体猝灭GPF 的信号而不猝灭REP的信号），可以通过一个mRFP-GFP-LC3串联结构来对自噬流量进行形态学最终。用这一新的结构，自噬体和溶酶体分别被标记上了黄色（也就是mRFP和GFP）和红色（只有mRFP）的信号。如果自噬流量增加，那么黄色和红色的颗粒都会增加，然而如果自噬体到溶酶体的成熟过程被阻断，那么只有黄色颗粒增多，而不伴随有红色颗粒的增多。虽然这个方法可以被用来作为自噬流量的指标物，但是它并没有像那些直接测量溶酶体降解终点的流量方法那样精确。这个方法需要溶酶体具有酸性和降解能力。因此，有时自噬溶酶体会被观察到黄色，这个依赖于溶酶体酶的活性和溶酶体酸性猝灭GFP信号的速度。
GFP-LC3裂解分析
虽然GFP荧光因为溶酶体内部的酸性pH环境而猝灭，GFP还是通过免疫印迹来检测到，并且比GFP-LC3融合蛋白更稳定（其在达到溶酶体的过程中一部分被降解，导致出现有礼的GFP片段）。因此，另外一个检测自噬流量的方法就是通过使用抗GFP抗体进行免疫印迹分析来检测由于GFP-LC3在自噬溶酶体中降解产生的GFP片段。虽然这个方法已经被广泛用于表达GFP-Atg8的酵母中，在哺乳动物细胞中这样运用的经验还是很匮乏的。在某些依赖于溶酶体的酸性的情况下（可能由于细胞类型不同而不同），作为自噬溶酶体中GFP降解的结果使得这个方法可能不成功。
长寿蛋白质的降解
在20世纪70年代出现的一种传统的测定自噬流量的方法是对长寿蛋白质的降解的测定。在这种方法中，细胞被用同位素培养较长的一段时间，随后用没有同位素标记的培养液孵育一段时间，以洗掉放射标记的主要被蛋白酶体降解的短寿命蛋白，经过自噬诱导剂刺激后，被降解的蛋白释放，（用培养上清液中的三氯乙酸溶解的放射性来衡量）被定量。这可能是最好的定量方法，因为它提供了一个反应所有长寿蛋白质命运的精确数字，并且可以避免和单独检测一种自噬底物相关的陷阱。为了确保我们检测的是真实的由自噬降解所造成的现象（而不是其他可能对长寿蛋白降解作出贡献的途径），需要做一个标准试验来比较存在或不存在自噬抑制物（比如，3-甲基腺嘌呤）的样品中的降解率。这个方法的一个缺点是其
需要完全依赖于特异性和使用的自噬抑制物的高效性（下文讨论）。
注意事项
总结一下，目前有许多不同的方法可以检测自噬流量，包括LC3流量法，自噬底物总水平的测定（如，LC3，GFP-LC3或者p62），mRFP-GFP-LC3颜色转换分析，由GFP-LC3产生的自由GFP的分析，溶酶体依赖的长寿蛋白降解分析。每一种方法的用处和局限性可能在不同细胞类型和不同实验条件中有所不同，因此，我们建议使用“习惯定制”方法来检测自噬流量，因为这些方法的限制条件大都不重叠，我们建议多种方法联合使用来检测自噬流量。用这样的方法，在大多数的哺乳动物组织培养条件下，都能可靠地分析自噬流量（和自噬活性）。不幸的是，只有几种有限的方法被报道用于在体内检测自噬流量。虽然p62的水平在自噬缺失的小鼠组织中增加，但是还不明确p62水平是如何和体内自噬的诱导相关的。和GFP-LC3转基因小鼠被用来观测体内自噬体数量相似，产生一个GFP-RFP-LC3转基因小鼠在体内检测自噬流量可能行得通。发展出一种能够测定病人（病人血样和组织标本）的自噬流量检测的方法应该是一个更艰难的重要挑战。
自噬活性的抑制
为了全面了解一个给定的生物学过程，进行试验来调整这一过程的活性是非常重要的。在现今自噬研究中很重要的问题就是缺乏高特异性的自噬激活剂和抑制剂。即便如此，现在又几种调节剂，并且基因操作技术也为我们提供了强有力的工具，在这部分和后文中我们将分别讨论不同的抑制剂和激活自噬的药理和基因方法。
因为自噬体的形成需要第三类磷脂酰肌醇-3-激酶，在体外经常使用的抑制自噬的方法包括使用磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂，比如渥曼青霉素，LY294002或3-甲基腺嘌呤。然而需要注意的是所有这些试剂都能抑制第一类（抑制自噬）和第三类磷脂酰肌醇-3激酶（自噬必需）的活性，并且有一些磷脂酰肌醇-3-激酶的抑制剂比如LY294002和渥曼青霉素也通过靶向作用于mTOR（一种自噬抑制分子）的ATP结合位点来抑制它，此外因为磷脂酰肌醇-3-激酶（第一类和第三类）调控多种细胞信号和膜运输途径，所以这些抑制物不是自噬特异的，另外一个就是3-甲基腺嘌呤，其在高浓度（通常10nM）时可以抑制自噬，可以靶向作用于其他的激酶并且影响其他的细胞途径比如糖原的新陈代谢、溶酶体的酸化、吞噬作用、和线粒体的渗透性转变。实际上，即使在Atg5缺失的细胞中，3-甲基腺嘌呤仍然能够抑制蛋白质降解，表面其除了自噬抑制的作用之外还有对蛋白质降解的作用。
虽然磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂阻断自噬体的生成，但是其他的药理学抑制剂在试验中用来阻断自噬后面的阶段。微管干扰试剂抑制自噬体和溶酶体的融合，这一步需要微管的参与，自噬的运载物在自噬溶酶体中最后降解的过程也可以被氯化铵，巴弗洛霉素A1和溶酶体蛋白酶抑制剂比如E64d和抑肽素A所抑制。虽然巴弗洛霉素A1最初被报道用来抑制自噬体和溶酶体的融合，但是最近一个研究表明它至少在某些特定的条件下主要通过酸化来影响溶酶体内物质的降解。
一个重要的局限性就是微管的干扰和溶酶体降解的抑制会影响除了自噬之外的其他重要细胞学过程，比如有丝分裂和内吞作用，因此，与磷脂酰肌醇-3-激酶一样，通过此类实验来进行描述自噬时一定要注意考虑到目前缺乏特异性的自噬抑制剂，我们建议科研人员避免单单依靠药理学的自噬抑制剂研究自噬功能时的草率作出推论。当然，药理学研究方法应该和基因方法结合起来使之更特异地抑制自噬通路。
可以通过敲除或者减弱不同的ATG基因的表达来对自噬通路进行更特异的抑制。到目前为止，在缺乏Atg3，Beclin1，Atg7，Atg9a，Atg16L1，FIP200和Ambral1的细胞中证实了自噬的减弱。Atg4C和ULK1基因的敲除在体内呈现出野生型，可能由于相关的异构体可以补偿该基因的缺失，因此，在自噬减弱实验中这些基因不应该作为RNAi靶点的首选（虽然抗ULK1的siRNA至少在某些特定的细胞类型中是有效的）。另外一个RNAi介导的研究自噬抑制的问题就是某些特定的Atg蛋白在很低水平情况下依然能够正常其作用，在这些情况下，RNAi介导的沉默需要几乎对蛋白表单完全的抑制来观测有效的自噬抑制。因此在进行自噬基因下调实验时，我们建议研究人员不仅用siRNA保证自噬蛋白表达水平有效的降低，而且要用一个抑制的自噬诱导刺激比如饥饿来证明自噬途径高效的抑制。
另外一个对于自噬基因抑制的成功方法是显性负突变自噬蛋白。这些包括ULK1 (ULK1K46N,ULK1K46R,和ULK1K46I），Atg4B C47A和Atg16L1的卷曲螺旋区域的激酶致死突变。此外野生型Atg12和Atg16L1和接合缺失的ATG5突变体的过表达也会导致显性负效果。因为这些显性负突变的效果有时是条件性以及/或细胞类型特异性的，在每个试验中保证其抑制效果是十分重要的。
值得注意的是大多数ATG基因的缺失或者自噬蛋白的显性负突变会从对自噬体形成开始阻断，然而在Atg3敲除的细胞中，Atg5敲除的细胞中和Atg4B C47A观察到了非正常的膜的延伸，表面属于Atg12和Atg8/LC3接合系统的这些因子可能对自噬体形成的完整终止时重要的。
理论上来说，自噬基因的减弱/敲除是一个比药理学试剂抑制自噬更具特异性的方法。然而，一个重要的问题在于，Atg蛋白可能不是完全自噬特异性的，他们可能有自噬相关的作用，包括在细胞死亡，内吞作用和免疫相关的GTPase运输中的作用。此外不同ATG基因敲除的小鼠的不重叠表型表明了Atg蛋白不同的作用。Atg3，Atg5，Atg7，Atg9a和Atg16L1定向突变的小鼠的表型本质上是相同的（新生致死），然而胚胎致死性在缺失Beclin1,FIP200和Ambra1的小鼠中被观察到。因此考虑到单独的Atg蛋白可能存在非自噬相关的作用，建议联合使用不同基因方法来增加在自噬基因敲除/减弱的条件下观察到的表型是真正由自噬活性的抑制所造成的可能性。
自噬活性的激活
对于自噬激活剂的研究有一个持续增长的兴趣，不仅仅是为了研究的目的更是为了可能的治疗目的。和自噬抑制剂相似，有不同的方法来激活自噬，但是缺乏自噬途径完全的特异性。图上文所说的，抑制最为有效的自噬生理诱导物是饥饿，其在体内和体外均发挥作用（氨基酸的缺少比血清或生长因子的缺少更有效果）。在大多数细胞系中，缺乏氨基酸一个小时就可以观察到自噬的诱导，一个明显的例外是特定的肿瘤细胞可以抵抗饥饿诱导的自噬。另外一个自噬激活的方法就是通过对营养敏感的信号途径调节，最好的靶点是mTOR,其是自噬的有效抑制剂。mTOR的抑制物雷帕霉素和其类似物CCI779可以再体内外激活自噬。雷帕霉素在哺乳动物中使用的一个限制条件是，它似乎在自噬的诱导中和4E-BPI的去磷酸化中执法会部分作用。最近发展的mTOR的ATP结合位点的竞争性抑制剂比如Torin1和PP242表现出强烈的抑制活性并且很有希望成为自噬诱导试剂。值得注意的是，饥饿和mTOR的抑制不是自噬的特异诱导剂，这些处理影响大范围的细胞反应，尤其是除了自噬激活之外的蛋白质合成和细胞新城代谢。
几种mTOR非依赖的自噬激活剂也被报道过，锂通过抑制肌醇单磷酸酶（mTOR非依
赖性的）来诱导自噬，但是也会通过抑制糖原和酶激酶3β（mTOR依赖的）来减弱自噬，因此，如果锂被用来激活自噬，应该和mTOR抑制剂联合使用。BH3类似物比如ABT737（以及临床前的类似复合物）通过竞争性的干扰Beclin1和Bcl2或者BclXL来诱导自噬。海藻糖和雷帕霉素的小分子增强物可以通过目前不知道的机理来诱导自噬。两个筛选后的FDA认证复合物鉴定的额外的试剂可以以mTOR非依赖的方式诱导自噬，包括氟司必林，三氟拉嗪，哌咪清，尼卡地平，尼古地平，洛哌丁胺，胺碘酮，维拉帕米，米诺地尔和可乐宁。无论是在体外还是体内，为了达到最大的自噬诱导效果，把在mTOR非依赖途径中起作用的药物和雷帕霉素或者其他的mTOR抑制剂联合使用来达到自噬激活的加成效果是令人满意的。
结束语
我们讨论了目前在哺乳动物细胞中可用的调节自噬的技术和方法。没有一个完美的方法能够检测自噬体的数目或者自噬流量，也没有一个完美的可以特异激活或抑制自噬途径的方法。因此，应该强调，没有观察或调节自噬活性方法的黄金法则，当然，应该考虑几种不同的方法联合使用（具有非重叠限制）在任何给定的生物学环境中精确地测定自噬的状态和功能。伴随着自噬分子机制的更深入研究，有希望发展出更好的观察自噬的方法和更多的调节自噬的特异性药物，如此的发展对于深入理解自噬的生物学过程和成功研发出用于临床医药的调节自噬的方法是至关重要的。
自噬（Autophagy）及其研究方法概述汉恒Th物技术服务手册
目录 1概念 2自噬的过程 3自噬的特性 4自噬过程的调控 5自噬与肿瘤的关系 6自噬的研究方法概述7汉恒自噬研究特色服务
自噬研究相关产品及服务 1.病毒工具（独家推出） mRFP-GFP-LC3腺病毒系统，可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发Th过程（具体内容后面有介绍）； 2.自噬相关服务 汉恒Th物可提供自噬研究整体科研服务，若您的时间紧张或是对实验有所顾忌，我们可以为您代劳部分实验内容； 3.自噬研究相关试剂 汉恒Th物可以根据您的实验需求为您提供最实用的试剂产品，让你用的放心，省心！
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Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2019, 9(3), 163-179 Published Online March 2019 in Hans. https://www.doczj.com/doc/877125856.html,/journal/acm https://https://www.doczj.com/doc/877125856.html,/10.12677/acm.2019.93027 Advances in the Regulation of Autophagy Dan Xia Pathology Department of Shandong Medical College, Linyi Shandong Received: Feb. 4th, 2019; accepted: Feb. 13th, 2019; published: Feb. 25th, 2019 Abstract In this review, we will describe the dynamic progress how cells form isolation membranes with the participation of various autophagy-related proteins under the stimulation of upstream signals such as MTOR and AMPK, and further extend to form autophagic characteristic structures “auto-phagosome”, and how mature autophagosomes combine with lysosome to complete the degrada-tion and reuse of cytoplasmic substances. In addition, the research progress of post-translational modification (including phosphorylation, glycosylation, ubiquitination, acetylation and mercaptan modification) in regulating autophagy was briefly reviewed. It was pointed out that post-translational modification of autophagic proteins played an important role in the process of autophagy. Understanding which amino acid residues in autophagic proteins are modified and confirming the expression of these modified amino acids in related diseases will provide impor-tant targets for disease diagnosis and treatment. Keywords Autophagy, MTOR, Post-Translational Modification 细胞自噬调控的研究进展 夏丹 山东医学高等专科学校病理教研室，山东临沂 收稿日期：2019年2月4日；录用日期：2019年2月13日；发布日期：2019年2月25日 摘要 本文介绍了细胞在接受MTOR、AMPK等上游信号刺激下，在多种自噬相关蛋白参与下如何形成隔离膜、并进一步延伸形成自噬特征性结构“自噬体”以及成熟的自噬体如何与溶酶体结合完成胞浆物质的降解
五单元第一章第七节哺乳动物 课型：新授 课时：1课时 年级：八年级 教师寄语：你紧、我紧、大家紧，紧紧相追 学习目标： 1、理解哺乳动物的主要特征是什么？ 2、了解哺乳动物与人类的生活有什么关系？ 3、了解胎生、哺乳提高了哺乳动物后代的成活率的原因。 学情分析: 学生通过本单元前边六节课的学习,已经掌握了动物分类的一些知识,哺乳动物好多是我们身边常见的,也是等级最高的,同学们应该较好容易掌握它们的特征. 教学重难点： 1、认识生活中的哺乳动物 2、概述哺乳动物的主要特征 3、了解哺乳动物与人类的生活关系 教学突破： 通过学生自主探究掌握课内的知识要点，并延伸课外知识，引导学生探究问题的意识，构建对不如动物的整体认识。通过野生动物保护的知识的拓展，让学生认识到哺乳动物与人类的密切关系，应该做好保护和控制工作，合理开发和利用。 教学流程： 一、多种多样的哺乳动物 观察课本及幻灯片出示的图片。 二、哺乳动物的主要特征 1、体表被毛。 作用:保温作用,可以维持恒定的体温 2、生殖方式：胎生，哺乳 问题：为什么说胎生哺乳提高了后代的成活率？ 答：（1）、乳汁营养丰富； （2）、乳汁中含有些抵御疾病的特殊抗体； （3）、方便母体更好地保护幼体
3、观察与思考：比较家兔、狼的牙齿 门齿，适于切断食物犬齿，适于撕裂肉食臼齿，适于磨碎食物 牙齿分化对哺乳动物进化的意义？ 答：（1）提高摄取食物的能力（2）增强了对食物的消化能力 4、神经系统和感觉器官特点：具有高度发达的神经系统和感觉器官 意义：能灵敏的感知外界环境的变化，对环境的复杂多变及时做出反应 谁能概括一下哺乳动物的共同特征？ 三、概括哺乳动物与人类生活的关系 请同学从正反两方面分析。 四、技能训练p39页 综合和概括：比较动物和植物的主要区别 对上面的概括，你有什么补充吗？ 五、你学到了什么，有什么收获？ 六、当堂过关，完成练习 1、与其他动物相比，哺乳动物后代成活率较高的主要原因是（） A．用肺呼吸B．胎生哺乳C．心脏四腔D．体表被毛 2、国宝大熊猫“团团”、“圆圆”作为大陆人民的友好使者被赠送到宝岛台湾．下列不属于大熊猫主要特征的是（） A、用肺呼吸B．胎生、哺乳C．牙齿分化D．体温不恒定
自噬研究鼻祖的最终选择 细胞自噬是细胞应对恶劣环境的一种主动反应，就是将自身一部分动员出来，采用自吃的方式，作为能量物质来应对各种不利因素，细胞凋亡则是细胞整体的主动死亡方式，最近有研究发现细胞坏死也存在一种主动的方式被称为程序性坏死，细胞自噬也是一种程序性坏死的类型。细胞自噬（autophagy）是继细胞凋亡（apoptosis）后，近年来生命科学领域的又一热门研究方向。 比利时科学家克里斯汀·德迪夫主要的研究领与在生物化学与细胞生物学，上世纪50年代，他利用刚刚出现的细胞分级分离技术（通过超速离心来分离细胞成分），发现了溶酶体（lysosome）和过氧化物酶体（peroxisome），让人们对细胞内部结构有了更清楚的认识，极大推动了细胞生物学研究。1974年因“细胞的结构和功能组织方面的发现（for their discoveries concerning the structural and functional organization of the cell）”而与阿尔伯特·克劳德、乔治·埃米尔·帕拉德分享了诺贝尔生理学或医学奖。后来，随着研究的深入，德迪夫的兴趣逐渐转向细胞起源，例如内共生学说。 克里斯汀·德迪夫Christian de Duve在上世纪50年代通过电镜观察到自噬体（autophagosome）结构，并且在 1963 年溶酶体国际会议（CIBA Foundation Symposium on Lysosomes）上首先提出了“自噬”这种说法。因此克里斯汀·德迪夫被公认为自噬研究的鼻祖。目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和
第一章第七节哺乳动 物
第一章第七节《哺乳动物》教学设计 一、教学目标 （一）知识目标 1．概述哺乳动物的主要特征。 2．举例说明哺乳动物与人类生活的关系。 （二）能力目标 通过分析、概括形态各异、生活环境差别很大的哺乳动物的共同特征，尝试进行比较、分析、概括。 （三）情感、态度与价值观目标 关注哺乳动物和人类生活的关系。 二、教学重点 哺乳动物的主要特征；哺乳动物与人类生活的关系。 三、教学难点 辩证地认识哺乳动物和人类生活的关系。 四、教学准备 查阅相关资料，设计并制作多媒体课件。 五、教学过程 （一）创设情境，引发思考，导入新课（5分钟） 创设形态各异、生活环境差别很大的哺乳动物的图片情境。请学生辨识这些动物，讨论这些动物是否都属于哺乳动物？并说出理由。学生可能会说出这些动物都是胎生、哺乳的，体温都是恒定的等等。引出课题，今天我们就一起来学习哺乳动物的相关知识。
【设计意图】识别形态各异、生活环境差别很大的哺乳动物，初步讨论哺乳动物的主要特征。 （二）概述哺乳动物的主要特征（25分钟） 1．刚才同学们初步说出了哺乳动物的主要特征，现在我们先来回顾一下：从体表来看，哺乳动物与其他类群的动物有什么区别？我们学过的腔肠动物、线形动物、环节动物、软体动物、节肢动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类的体表都有什么特有的结构？哺乳动物呢？ 【设计意图】总结不同类群动物体表的特有结构，可以使学生对各个类群的特征有更清晰的认识，也便于从体表特征的角度初步区分各主要类群。 2．绝大多数哺乳动物体表被毛，但生活在不同环境里的动物体表的毛还是不同的。准备生活在非洲等热带地区的河马和生活在北美北部的灰狼图片，让学生观察图片中的动物及其生存环境，思考：河马和灰狼分别生活在怎样的环境中？为什么河马几乎无毛发，而灰狼在寒冷的冬季有厚厚的体毛到夏天则变薄？哺乳动物的体毛起到怎样的作用呢？学生通过分析比较、小组讨论等，能更深入地理解并认同“哺乳动物体表被毛”这一特征，及其重要意义。 【设计意图】比较不同环境中的哺乳动物皮毛不同，理解哺乳动物体表被毛的主要作用是保温。 3．除了体表被毛这一外在特征之外，哺乳动物区别于其他动物的本质特征是什么呢？请学生看“想一想，议一议”，思考：和其他类群的动物相比，为什么胎生、哺乳提高了后代的成活率？准备奶制品包装袋上的营养成分数据照片，请学生思考：为什么奶水可以为幼崽提供最好的营养？补充考拉、袋鼠等有袋目的哺乳动物，加深学生对哺乳动物“哺乳”这一重要特征的理解。为什么
自噬（Autophagy）及其研究方法概述 一、背景 概念: 目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA), 大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。通常说的自噬泛指Macroautophagy. 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。自噬的步骤可以大概总结为下面四步: 步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。 步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部
揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。 步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。 步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。 自噬的特性： 1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显着区别
细胞自噬的研究进展 孙雅婧，郭青龙* 中国药科大学生理教研室，南京210009 细胞自噬（autophagy ）是指细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器被运输到溶酶体，溶酶体对其消化降解，以胞质内自噬体的出现为标志的细胞自我消化过程，以双层膜结构包裹部分胞质和细胞器的自噬体为判断指标。早在1962年，自噬现象的奠基人Ashford 和Porten 在人的肝细胞中用电子显微镜观察到了自噬现象。随着分子生物技术的发展，人们对自噬的形态特点和分子机制了解逐步深入。近年来对自噬的研究十分广泛，自噬是在体内普遍存在的过程，其在清除代谢废物进而回收能量为细胞正常运转提供能量的过程中发挥重要作用，因而对自噬的研究尤为重要。 1 细胞自噬的研究现状 1.1 自噬的过程 自噬的过程分为四个阶段（见图1）。 第一阶段：自噬诱导信号被细胞接受后，类“脂 质体”碗状结构即在胞浆某处形成小的膜结构，在电镜下观察到其不断扩张、呈非球形、扁平状双层膜的碗状结构，称为自噬前体（phagophore ），这种结构的电镜观察结果是指示自噬发生的金标准之一。 第二阶段：不断延伸的自噬前体，将胞浆中的若干成分（包括细胞器）收口包入，成为密闭的球状自噬体（autophagosome ）。自噬体的电镜观察结果是指示自噬发生的金标准之一。自噬体的特征有两个：双层膜，内含诸如线粒体、内质网碎片等胞浆成分。 第三阶段：自噬体形成后，可能与细胞内吞的吞噬泡（phagocytic vacuole ）、吞饮泡（pinosome ）和内 体（endosome ）融合（此阶段为非必需步骤）。 第四阶段：自噬体与溶酶体（lysosome ）发生融合，形成自噬溶酶体（autolysosome ）。期间溶酶体酶降解自噬体的内膜，使两者的内容物合为一体，自噬体中的包含物被降解，将产物诸如氨基酸、脂肪酸之类输送到胞浆中，重新利用供能，残渣则被排出细胞外或滞留于胞浆[1]。 1.2自噬的分类 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同， 哺乳动物细胞自噬分为3种主要方式：巨自噬（macroautophagy ）、微自噬（microautophagy ）和分子伴侣介导自噬（chaperone-mediated autophagy ，简称 CMA ）。巨自噬是最主要的自噬形式，在巨自噬中由 内质网来源的膜包绕待降解物，形成自噬体后与溶酶体融合并降解其内容物；然而在微自噬中，溶酶体膜直接内陷包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解，没有形成自噬小体的过程；分子伴侣介导自噬则为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到溶酶体腔中，被溶酶体酶消化。CMA 的底物是可溶蛋白分子，因此CMA 降解途径在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性[3]。 2自噬与凋亡 在多细胞生物体内，维持自身的稳态和内环境 的平衡，是保持复杂生物体系正常运转的重要条件。正常的细胞体系当中，有细胞的生长增殖必然 摘要本文综述了细胞自噬概念的研究现状、自噬与凋亡、自噬与肿瘤的关系，展望了自噬在抗癌药物介导的细胞死亡中发挥的重要作用以及自噬现象的临床意义。 关键词自噬；凋亡；肿瘤 中图分类号 Q25；R979.1文献标志码A 文章编号1673-7806（2012）03-236-04 作者简介 孙雅婧，女，硕士生E-mail:yj7782@https://www.doczj.com/doc/877125856.html, 通讯作者郭青龙，男，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤药理学 E-mail:anticancer_drug@https://www.doczj.com/doc/877125856.html, 收稿日期 2012-03-14 修回日期2012-03-26* 图1自噬的基本过程[2] Jun;20(3) 236
攸县丫江桥镇中学八年级生物导学案 第七节哺乳动物NO：2013B07 学习目标：概述哺乳动物的主要特征. 学习重点、难点：知道哺乳动物的形态、结构、生理等特征。 学习过程： 一、复习：鸟类适应飞行生活的主要特征有哪些？ 1、体形呈，体表被覆，前肢变成，能减少飞行时的阻力。 2、胸肌，能煽动两翼完成飞行动作。 3、有的骨，直肠，粪便随时排出体外，有利于减轻体重。 4、食量，消化能力，能供给充足的能量。 5、呼吸，提高了气体交换的效率。 习题：2008年北京奥运会吉祥物之一--福娃“妮妮”的原型是一只小燕子，燕子特有的呼吸方式是（） A、双重呼吸 B.肺与气囊同时呼吸 C.用气囊呼吸 D.用肺呼吸 二、预习导学 1、下列哪项不是食草性哺乳动物所具有的特征（）A．犬齿发达 B 消化道长 C 盲肠发达 D 臼齿发达 2、生活在水中用肺呼吸的动物是（） A．龟 B 白鳍豚 C 鲫鱼 D 鲨鱼 3、下列关于家兔的形态结构和生理特点叙述不正确的是（） A 体毛光滑柔软有保温作用 B 体内有膈，体腔分为胸腔和腹腔 C 前肢较后肢发达，适于跳跃，奔跑速度快 D 神经发达，对外界感知敏锐，反应迅速 4、海豚生活在海洋中，体表光滑无毛，外形像鱼，但用肺呼吸，胎生哺乳，所以它属于（）A．鱼类 B 两栖类 C 爬行类 D 哺乳动物三、课堂自主学习： 阅读课本第36-39页，解决下列问题： 1、哺乳动物是如何保持体温恒定的？ 家兔的体毛具有什么作用？ 思考：所有的哺乳动物都一定体表被毛吗？ 2、哺乳动物的生殖方式有什么特点？ 家兔与家鸽的生殖方式有何不同？ 思考：家兔的这种生殖发育特点，对家兔的繁殖有何意义？ 3、观察并比较兔和狼的牙齿，想一想二者的不同说明了说明？ 总结哺乳动物的牙齿特点。 家兔的门齿，臼齿各有什么作用? 这与它的生活习性有什么关系？ 思考：肉食性的动物除门齿和臼齿外，还有别的牙齿吗？ 这与它的食性有何关系？ 4、发达的神经系统对家兔在陆地上生活有什么意义？ 5、除了家兔外，你还知道哪些哺乳动物？ 6、蝙蝠是鸟吗？ 鲸鱼是鱼吗？ 四、课堂小结： 1、哺乳动物适合自然界生活的特征： 1. ）——快速运动，支撑体重 2. ）——适于摄食 3. ）——体温恒定 4. ）——对外界刺激反应灵敏 5.） 2、哺乳动物的主要特征： 五、课堂练习： 1、在南美考察的动物学家，发现一种被称为“树懒”的动物，具有以下特征：行动非常缓慢，皮肤上长有毛发，胎生，体温恒定，用肺呼吸，根据这些特点可以把树懒归为（） A．两栖动物 B 鱼类 C 哺乳动物 D 爬行动物 2、带鱼、水牛、蝗虫、蚯蚓的呼吸分别依靠（） A 鳃、肺、体壁、气管 B 体壁、气管、肺、鳃 C 鳃、肺、气门、体壁 D 体壁、肺、鳃、气管 3、下列哺乳动物的特性中，与其后代成活率高有直接关系的是（） A 大脑发达 B 心脏四腔 C 胎生哺乳 D 用肺呼吸 4、下列与陆地生活动物对外界刺激作出迅速反应有利于捕食和逃避敌害无关的一项是（） A 感觉器官发达 B 神经系统发达
哺乳动物 知识点1:哺乳动物的主要特征 1.多种多样的哺乳动物 （1）非洲象 非洲象是陆地最大的哺乳动物，栖息于森林和稀树草原，主要吃香蕉等果实以及树叶、树皮。 （2）马 马是人们熟悉的家畜。马的骨骼和肌肉都很发达，四肢强健，每肢都只有一趾，趾末端被有大型的蹄，其余各趾都已经退化。 （3）猕猴 猕猴在森林里群居生活，栖息在树上，以野果为食，也吃鸟卵和昆虫。 （4）蓝鲸 蓝鲸是生活在海洋中的大型哺乳动物。蓝鲸体长可达30米，体重近200吨。 2.哺乳动物的主要特征 （1）体表被毛，体温恒定 除了鲸等少数水生种类的体毛退化以外，哺乳动物的体表都被毛。体毛有很好的保温作用。与鸟类一样，哺乳动物通过自身调节可以维持恒定的体温，是恒温动物。 （2）胎生，哺乳 哺乳动物的生殖方式与其他动物不同：绝大多数哺乳动物的胚胎在雌性体内发育，通过胎盘从母体获得营养，发育到一定阶段后从母体中产出，这种生殖方式叫作胎生。雌性用自己的乳汁哺育后代，使后代在优越的营养条件下成长。胎生能使胚胎发育有一个更好、更安全的环境和更充足的营养，哺乳也可以使幼体得到较好的照顾和获得充足的营养，这样就大大增强了哺乳动物幼体的成活率，对哺乳动物的繁殖有很大好处。 （3）哺乳动物的牙齿与食性的关系 ①食草动物的牙齿
如兔的牙齿分化为门齿和臼齿。门齿似凿，适于切断植物纤维；臼齿面如锉，适于磨碎食物。 ②食肉动物的牙齿 如狼的牙齿分化为门齿、犬齿和臼齿。犬齿尖锐锋利，适于撕裂食物。 ③意义 动物的牙齿与其食性（生活习性）相适应，提高了哺乳动物摄取食物的能力，增强了对食物的消化能力。 （4）哺乳动物的主要特征 体表被毛（有保温作用，适应温差大的陆地环境）；胎生，哺乳；牙齿有门齿、犬齿和臼齿的分化。 知识点2:哺乳动物与人类生活的关系 1.有益方面 （1）家畜是由野生动物驯养而来的，是人类食物中动物蛋白的重要来源。 （2）维持生态系统的稳定。 （3）经济价值。 （4）人类的得力助手。 2.有害方面 鼠类猖獗会对农、林、牧业造成危害，有时还会传播疾病。 考点1:哺乳动物的主要特征 【例1】两只大熊猫“力力”和“真真”于2011年2月21日从中国送去日本，4月1日在上野动物园首次露面，吸引游客不断惊呼。大熊猫等哺乳动物所特有的特征是（） A.心脏四腔 B.用肺呼吸 C.体温恒定 D.胎生哺乳 答案：D 点拨：本题考查的是哺乳动物特有的特征。心脏四腔、用肺呼吸、体温恒定这些特征鸟类也具有，因而不是哺乳动物特有的。胎生哺乳才是哺乳动物特有的特征。
第七节哺乳动物教学设计 石羔镇初级中学彭楚香 教材内容分析 《哺乳动物》是新人教版教材第五单元第一章第七节。课文在“哺乳动物的主要特征”的概念上做了铺垫，课文介绍哺乳动物的主要特征和哺乳动物与人类生活的关系。 学生特征分析 从知识方面来看，初二学生对生物这门课的学习已经掌握了一定的方法。哺乳动物在生活中经常看到，对农村中学的学生来说比较熟。教学目标 知识与技能目标： 1、识记哺乳动物的主要特征。 2、描述哺乳动物与人类的生活有什么关系。 过程与方法目标： 通过探究活动的开展，发展学生科学实验的探究能力、小组合作解决问题的能力。 情感与价值观目标 1、通过学习明确生物的形态结构与各自的功能相适应的特点。 2、提倡学生向身边的人群宣传“关爱生命，保护环境”的观点。 3、增强学生保护环境的意识，产生热爱环境、热爱生命的美好情感。教学重点： 1、识记哺乳动物的主要特征。 2、描述哺乳动物与人们的生活有什么关系。 教学难点： 识记哺乳动物的主要特征。 教学过程 一、复习旧知 提问：同学们我们在之前学习了第五节鸟类，还记得我们学习了哪些
知识吗？ 1、鸟的呼吸有什么特点 2、鸟骨骼有什么特点学生回忆，回答。复习旧知识，加深对旧知识的理解记忆。 二、导入新课 创设形态各异、生活环境差别很大的哺乳动物的图片情境。请学生辨识这些动物，讨论这些动物是否都属于哺乳动物？并说出理由。学生可能会说出这些动物都是胎生、哺乳的，体温都是恒定的等等。引出课题，今天我们就一起来学习哺乳动物的相关知识。学生积极配合，思考、回答。通过图片使学生直观了解哺乳动物。 三、自主学习 1、哺乳动物的体表大都被_____。体毛有很好的_______作用。与鸟一样，也是_______动物。 2、绝大多数哺乳动物的胚胎在雌体内发育，通过______从母体获得营养，发育到一定阶段后从母体产出，这种生殖方式叫作_______。雌体用______哺育后代。所以，______、________提高了后代的成活率。 3、哺乳动物牙齿的作用是：________、________和_________食物。它们的牙齿分化为___齿、____齿和____齿。这样的分化提高了哺乳动物______食物的能力，增强对食物的_____能力。 4、哺乳动物具有高度发达的__________和_________，能够灵敏地感知___________的变化，对环境的复杂多变及时_____________。 5、哺乳动物的主要特征是：＿＿＿＿＿；_____；＿＿＿，＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。 通过填空，引导学生预习，对课本有大致的了解。能带着预习时遇到的问题来听课。 四、合作探究 导入问题： 1．为什么胎生、哺乳提高了哺乳动物后代的成活率？ 2．兔和狼的牙齿有什么共同特点？ 3．兔和狼的牙齿有什么不同？这与它们的生活习性有什么关系？
线粒体自噬 线粒体自噬研究概论 关于线粒体自噬 线粒体自噬(mitophagy)是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。选择性清除受损伤或功能不完整的线粒体对于整个线粒体网络的功能完整性和细胞生存来说十分关键。 线粒体自噬主要的作用有几个方面： 1.选择性清除功能受损的线粒体 2.选择性调节细胞内线粒体数量 3.通过线粒体影响诸多生理和病理学过程 Fig:The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria Cell Death and Differentiation(2013)20,31–42
线粒体自噬的信号通路 1)Pink/Parkin pathway 2)Bnip3/Nix pathway 3)FUNDC1pathway Fig.Mitophagy pathway:Pink1/Parkin OR Bnip3/Nix Pink1/Parkin pathway：E3泛素连接酶Parkin和蛋白激酶Pink1一起介导了线粒体膜电位下降,引起的线粒体自噬的发生,当线粒体损伤后,线粒体膜电位下降,引起Pink1蛋白在损伤线粒体上的积累,能够吸引Parkin到损伤的线粒体上。Parkin使得线粒体外膜上的很多蛋白发生泛素化,从而能够募集其他一些相关蛋白,介导线粒体自噬的发生。
线粒体自噬 汉恒线粒体自噬研究工具与研究方法 汉恒生物有多种线粒体自噬病毒研究工具可以提供，便于直接感染目的细胞后直观地观察线粒体自噬的变化 一、汉恒线粒体自噬表型研究工具 1）Ad-GFP-LC3腺病毒病毒系统，可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平（由于GFP荧光偏弱，暂停Ad-GFP-LC3销售， 慢病毒单标LV-GFP-LC3荧光正常，正常销售）； 2）Ad-HBmTur-Mito腺病毒系统（红光标记），为汉恒生物自主研发的线粒体特异性定位荧光探针（pHBmTur-Mito）可准确定位标记线粒体，结合汉恒独家推出的双荧光LC3细胞自噬腺病毒的使用，即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程； 使用方法：Ad-GFP-LC3+Ad-HBmTur-Mito共感染目的细胞，confocal检测双荧光共定位的情况，如果共定位，则存在线粒体自噬！（下图说明：红色标记为线粒体，绿色标记自噬小体，二者有共定位时代表自噬发生） 二、汉恒线粒体自噬通路研究工具 1）Ad-Parkin-EGFP 2）Ad-Bnip3-EGFP+Ad-Nix-EGFP 3）Ad-FUNDC1-EGFP
第七节哺乳动物 知识目标：1、说明哺乳动物的形态、结构和生理功能的特点，概述哺乳动物的主要特征； 2、阐明狼和兔在牙齿等方面与其陆地生活相适应的特点； 相比，哺乳有什么优越性？ 生：回答...... 引入新课：这就是我们第七节要解决的问题。 【答疑解惑】 ------来源网络，仅供参考
①乳汁中含有丰富的营养物质，使得哺乳动物的后代在优越的营养条件下健康地、迅速地生长和发育，②哺乳动物的雌兽能较好的的保护自己的幼崽。 二、自主、合作、交流 任务一：总结哺乳动物的两个主要特征 1、观察猕猴、野马、大象的体表，与鸟类的体表有什么相同点与不同点？ 体表被毛，有保温作用，是恒温动物 2、展示袋鼠、熊猫、猴哺乳的图片，引导学生从生殖和发育方面说出，哺乳动物的胎生、哺乳特征。 ①联系青蛙产卵，鱼类产鱼籽的存活率 ②鸟类产卵，乌龟产卵的存活率 ③鸟类育雏，企鹅的孵卵图片 总结胎生哺乳的优越性： 胎生：绝大多数哺乳动物的胚胎在雌性体内发育，通过胎盘从母体获得营养，发育到一定阶段后从母体中产出。 哺乳：雌性用自己的乳汁哺育后代，使后代在优越的营养条件下成长。 胎生、哺乳提高了后代的成活率 提示：（1）胚胎在母体里发育，母体直接产出幼崽。胎生比卵生提高了后代的存活率。 （2）母体都有乳腺，能分泌乳汁哺育幼崽，在短时间内解决了幼崽的温饱和营养问题，因而大大提高了后代的成活率、增强了对自然环境的适应能力。 任务二哺乳动物的第三个特征 展示兔子和狼的牙齿图片，引导生观察并讨论课本上的问题，并总结哺乳动物的第三个特征 1、引导学生讨论38页图片，
①认识兔的牙齿、狼的牙齿的结构 ②回答3个讨论题 2、高度发达的感觉器官和神经系统，能灵敏地感受外界刺激并作出反应。 3、总结哺乳动物的特征： ①体表被毛 ②胎生、哺乳 ③牙齿有门齿、犬齿、臼齿的分化 任务三哺乳动物与人类的关系 1、展示图片并结合教材，有益方面 引导学生看课本37页，总结哺乳动物与人类生活关系 ①、家畜是由野生动物驯化而来，是人类食物中动物蛋白的主要来源。 ②、野生动物在维持生态系统的稳定中起重要作用。 ③、皮毛具有特有的经济价值。(疯狂捕猎，种类数量锐减，有的濒临灭绝） ④、人类得力的助手。（导盲犬，警犬，搜救犬） 2、有害方面 ①鼠类猖獗会对农、林、牧业造成危害， ②、有时还会传播疾病。 三、课堂小结：1、哺乳动物的特征 2、哺乳动物与人类的关系 板书第七节哺乳动物 一、哺乳动物的主要特征：体表被毛； 胎生，哺乳； 牙齿有门齿，犬齿和臼齿的分化。 二、哺乳动物与人类的关系
哺乳动物自噬研究方法 【摘要】 自噬涉及到许多的生理和病理过程，因此，我们越来越需要科学地准确认识，并且量化操控自噬的过程。但是，由于自噬涉及了许多动态复杂的过程，关于它的研究分析经常不正确。在本文中，我们探讨监控自噬以及调控自噬活性的各种方法，主要集中关注哺乳动物中的大自噬。 【简介】 过去的十年中，有大量的研究围绕一个基本的细胞生物学通路“自噬”（希腊语中意味自我吞噬）。一系列进化上保守的基因（最初在酵母中被鉴定）被发现是自噬过程中所必需的，这一发现使得科学家能够去发现大量的自噬的功能，如：维持自身平衡稳态、参与细胞发展和其他生理活动。此外，越来越多的证据证明自噬的失控可能与许多哺乳动物的疾病发生有关。因此，科学家们迫切需要能够准确的检测自噬和研究在不同生物学进程中的功能的方法，特别是在哺乳动物系统。 在哺乳动物自噬的研究历史中一直有两个主要的困扰。首先的挑战在于如何将“一个动态的进程”和“静态的测量”进行捕获，并且这个固有的局限性与基于这些测量作出的生物学推论相关。第二个挑战在于将“形式”与“功能”分离，并且避免在给定的生理条件下，基于自身检测到（或没有）导致的将生理功能归至自噬的这个常见陷阱。这两个挑战可能导致了在我们研究哺乳动物自噬功能的历史中的许多误解。例如，一些神经退行性和肌退化性疾病最初被认定的结果，至少一部分被认为是由于自噬的增加（基于显微镜下观察到通路中早期的中间产物的增加）。然而实际上，早期中间产物的蓄积在这些疾病中代表着后阶段自噬通路的阻滞。自噬的一个常见的形态特征是细胞的垂死状态，但这也被错误的认为是一种细胞死亡通路，然而，现在似乎已经很明确自噬的主要功能是帮助细胞抵抗各种“生死攸关”的应激条件并使细胞存活。 这些哺乳动物自噬研究中的历史挑战部分已经通过将阐述自噬分子机制的最新进展运用到新的自噬研究的方法被克服。因此，在过去的十年里，许多新的技术被发明，用于动态监控自噬和通过调控自噬来明确其在给定的细胞状态下的功能。本文的目的在于提供一个重要的关于目前可行的研究哺乳动物自噬的技术和这些技术在解释过程中的限制的概述。更多的各种技术的细节信息可以再其他综述中获得。 自噬的基础知识 自噬是一般用于描述细胞内物质包括细胞器到溶酶体中降解的过程。在自噬的三种类型中（大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬），研究得最多的就是大自噬。分子伴侣介导的自噬是通过伴侣蛋白展开蛋白质，直接将细胞质蛋白转移，穿过溶酶体膜。小自噬涉及溶酶体膜表面的内陷提供一小部分细胞质进入溶酶体内腔。 大自噬（简称自噬）是本文主要关注的通路。这个通路从酵母到哺乳类都呈现保守，它是通过一些特定的细胞器（自噬体）介导的。在初始的诱导阶段，一个小的囊状的称作隔离膜或者延长的吞噬膜，随后封闭一部分细胞质，导致双层膜结构即自噬体的形成。然后自噬体的外膜融合至一个溶酶体（形成自噬溶酶体），导致所封闭的物质和自噬体的内膜共同降
发表时间：2011-6-2 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：刘杉珊李薇[导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。 刘杉珊李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心吉林长春130021） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04 【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。 【关键词】自噬分子机制p53 近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。 1 自噬的概念 自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 2 自噬的诱导
第七节哺乳动物 教学目标 知识目标 1.描述家畜的形态。 2.举例说出动物的形态结构、生理机能与其生活环境、生活习性相适应的特点。 3.说出常见哺乳动物与人类生产、生活的关系及其资源价值。 4.概述研究动物科学的一般方法（观察法、实验法及资料分析法）的基本含义及过程。 能力目标 1.尝试观察、实验、资料分析等研究动物的基本方法。 2.运用所学的基本知识和技能，尝试饲养家兔等其他常见的小动物。 情感目标 1.形成动物体的形态结构、生理机能与其生活习性、生活环境相适应的基本生物学观点。 2.建立爱护动物、热爱自然、保护环境的意识。 重点难点 动物的形态结构、生理机能与其生活环境、生活习性相适应的特点。 教学媒体 兔子实物及标本、大屏幕、幻灯机、投影仪、多媒体设备等 课时建议 1课时 教学过程 导入：
教师：在农村，农家庭院里饲养着猪、牛、羊、兔等多种动物，这些动物叫作家畜。今天我们就来一同来认识一下家畜。 新课教学： 教师：所谓家畜，是指人类为了经济或其他目的而驯养的哺乳动物。最常见的家畜有哪些呢？ 学生：猪、牛、羊、兔等。 教师：现在我们对照图示，结合家兔的标本，按照从头部到尾部的先后顺序观察家兔的外形，分析并讨论家兔的外形特点和它的生活环境及习性是如何适应的。学生：家兔的身体可以分为头、颈、躯干、四肢、尾五部分。头部有一对长长的可以灵活转动的耳廓，一对不大的眼睛，一张三片嘴，一对鼻孔，还有胡须。 学生：我觉得兔子的长耳朵使它的听觉很灵敏，可以及时感觉到危险，并及时躲避。 学生：眼睛虽然不大，但视力很好，对它的陆地生活也有帮助。还有它的三片嘴，吃起草来十分方便。 学生：你看它的四肢，前肢短小，但后肢很发达，奔跑起来很快，很难捕捉的。学生：它不光奔跑快，发达的后肢还能把它的身体支撑起来，它一下子就长高了，观察起四周来，视野开阔了许多，很容易发现远处的危险。 学生：兔子的全身几乎都长着毛，和家鸽的羽毛大不一样。 学生：家兔和家鸽不是一类动物，体表的覆盖物当然不一样了。 学生：家兔身上的毛还不一样呢！表面的粗硬，里面的很细软，摸起来好温暖，好舒服。 学生：它的毛能起保温的作用，所以冬天不怕冷。 学生：那夏天它不热吗？ 学生：也怕热，不过，它应该也能适应吧，比如找个阴凉处。
自噬现象及其分子机制的研究进展 发表时间：2011-06-02T10:04:12.903Z 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：刘杉珊李薇 [导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。 刘杉珊李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心吉林长春 130021） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04 【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与 p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。 【关键词】自噬分子机制 p53 近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。 1 自噬的概念 自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 2 自噬的诱导 当细胞受到饥饿、高温、低氧及荷尔蒙等外界刺激, 或细胞器的损坏、突变蛋白的积聚及微生物的侵袭等应激时, 可引起细胞自噬的发生。雷帕霉素靶点TOR蛋白激酶(target of rapamycin)作为细胞中氨基酸、ATP和激素的感受器, 是调控细胞生长的关键因子之一,其是细胞氮水平的负调节剂，参与自噬反应的调节[3]。研究表明, TOR对自噬反应的调节与细胞的营养条件有关,当营养充足时, 细胞中TOR被激活而抑制自噬，而当细胞处于饥饿状态时, TOR被抑制而促进自噬。在哺乳动物细胞中又有Tor蛋白，同时Tor蛋白也随着周围环境的改变来调节自噬但是调节机制要较酵母细胞复杂。在哺乳动物细胞中mTor的上游负调节有I型PI3K激酶，PDK1和AKt/PKB,而PTEN能拮抗PI3K而促进自噬。同时伴随着自噬的发生。TOR 的失活引起Atg结构的改变, 如Atg13p部分去磷酸化, 在营养充足时Atg13可高度磷酸化而不易于Atg1激酶结合从而抑制自噬发生。相反，在细胞处饥饿状态时Atg13可很快与Atg1结合，从而增加自噬。同时mTor可增强与Atg17p和Atg1p之间的相互作用,从而调节其激酶活性。 3 自噬过程 自噬其发生过程大致分为3个阶段：(1)在饥饿、氧化应激损伤等情况下，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解物（如蛋白质降解产物，细胞器和核糖体等）周围[3,4] ；(2)分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成双层膜自噬体；(3)自噬体通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，与之融合形成自噬溶酶体并降解其内成分，自噬体膜脱落再循环利用。因此自噬可被视为细胞的“回收工厂”，其不仅促进能量的利用同时转运无功能的蛋白和细胞器。而调节这个复杂的过程的分子水平有五个关键阶段[5]:（1）形成吞噬泡（2）Atg5-12复合物与Atg16L并且多聚化（3）LC3形成并且插入吞噬泡膜（4）包绕预被降解物（5）自噬体与溶酶体融合。 3.1吞噬泡的形成 酵母细胞的吞噬泡膜形成于PAS，而哺乳动物细胞吞噬泡膜来其于内质网[6,7]，高尔基体[3,8,9]等，甚至可能在严密调控下来源于细胞核[10]。酵母细胞形成吞噬泡膜需要Atg1激酶与Atg13和Atg17复合物，该复合物可能通过跨膜蛋白Atg9补充脂质而促进吞噬泡膜的扩增[4,11]。这个过程可通过Tor激酶调节，其磷酸化Atg13从而阻止其与Atg1激酶作用[13]哺乳动物细胞吞噬泡的形成过程仍需要进一步研究。III型PI3K激酶，Vps34和Atg6/Beclin-1在哺乳动物细胞的吞噬泡形成和自噬的作用已经很好的认识。Vps34参与细胞膜的形成，但其需要与Beclin-1和其他调控蛋白来选择性的参与自噬过程[14]。PI3P在吞噬泡的延伸和不断补充Atg蛋白过程中起重要作用，Vps34与PI3K以PI为底物获得PI3P过程中，Vps34是十分重要的[15]。Vps34与Beclin-1作用可增加PI3P的水平。其他与Vps34与Beclin-1复合物结合促进自噬调节蛋白为UCRAG，BIF-1，Atg14L和AMBRA[16,17] ,或抑制自噬蛋白Rubicon, Bcl-2[18,19]. Beclin-1与Bcl-2结合可破坏Beclin-1与Vps34的作用，所以Beclin-1与Bcl-2，Bcl-XL作用与内质网可抑制自噬[21]。 3.2 Atg5-Atg12复合物形成 由Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atgl2和LC3(Microtubule—associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程,在Atg 12结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用。有的两个泛素样蛋白系统参与形成Atg5-Atg12复合物和LC3, Atgl2首先由El样酶Atg 7活化，之后转运至E2样酶Atgl0，最后与Atg5结合，形成自噬体前体。Atg5-12复合物与Atg16L结合形成Atg5、Atgl2和Atgl6L 以复合物形式存在，这种结合一方面促进了自噬泡的伸展扩张，使之由开始的小囊泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；另一方面，Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3-向自噬泡的募集。Atg5-12复合物不依赖于自噬的作用，一旦自噬体形成，Atg5-Atgl2-Atgl6L复合物就脱离胞膜，使之Atg5-12复合物不是自噬的标志物。 3.3 LC3形成 第二条泛素样蛋白加工修饰过程参与LC3B 的形成，LC3B由哺乳动物细胞Atg8同源染色体编码。LC3B 被Atg4分解，生成LC3B-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样LC3B-I也被E1样酶Atg7活化，转运至第二种E2样酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3B-II。LC3B-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3II即被溶酶体中的水解酶降解。哺乳动物