MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。
临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;
Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;
400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;
3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成
用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h
sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些
无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了
Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存
不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。
Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。
1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；
2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的
药物有：
自噬诱导剂
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
(5) Rapamycin：mTOR抑制剂
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂
(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。
3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。
氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。
雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司产品,货号:R8781;
MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡
单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。具体操作步骤如下:
(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;
(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、0.5、1 nM 的培养基及含Rapamycin (终浓度1 pM)的培养基继续培养24 h;
(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC (终浓度50 nM)的培养基于37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光温育20 min;
(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。
流式细胞术检测细胞自噬发生率
(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24 h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和0.5uM的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出
六孔板,将上清收集到4 ml的离心管中;
(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5% 0?的恒温培养箱中避光孵育30 min;
(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;
(4)弃掉上清,每管加入500 ul含MDC(终浓度50 uM)的MEM培养基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;
(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2 min, 1 ml的PBS吹打混匀收集到1.5ml的离心管中,2000 rpm.离心5 min;
(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000 rpm,离心5 min;
(7)吸出800 ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;
(8)鮮育完的上清,2000 rpm,离心5 min;
(9)弃掉上清,1 ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的离心管中,2000 rpm,离心5 min;
(10)重复步骤(6)和(7);
(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞
仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。
LC3B WB: 1:2000
条件是15% SDS-PAGE, 正常跑胶至下沿0.5cm即可，200mA 湿转45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可
LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min
自噬（Autophagy）及其研究方法概述汉恒Th物技术服务手册
目录 1概念 2自噬的过程 3自噬的特性 4自噬过程的调控 5自噬与肿瘤的关系 6自噬的研究方法概述7汉恒自噬研究特色服务
自噬研究相关产品及服务 1.病毒工具（独家推出） mRFP-GFP-LC3腺病毒系统，可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发Th过程（具体内容后面有介绍）； 2.自噬相关服务 汉恒Th物可提供自噬研究整体科研服务，若您的时间紧张或是对实验有所顾忌，我们可以为您代劳部分实验内容； 3.自噬研究相关试剂 汉恒Th物可以根据您的实验需求为您提供最实用的试剂产品，让你用的放心，省心！
产品厂商规格A14292,Premo自噬TB/GFP TR-FRET invitrogen6000Tests LC3B抗体试剂盒 pllabs0.1mg Anti-MAP1A/LC3A/B自噬微管相关蛋白 轻链3抗体 pllabs0.1mg Anti-MAP1LC3A(microtubule- associated protein1light chain 3)自噬微管相关蛋白轻链3抗体 Invitrogen1mg/1ml 兔抗人、大、小APG4B细胞自噬相关 抗体\Anti-APG4B/AUTL1 BD1mg/1ml 自噬微管相关蛋白轻链3抗体\ Anti-MAP1LC3A Anti-SQSTM1/p62antibody abcam Sigma1g 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine （羟氯喹） mTOR抑制剂rapamycin Sigma20mM 自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）Sigma100mg
Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2019, 9(3), 163-179 Published Online March 2019 in Hans. https://www.doczj.com/doc/3815277570.html,/journal/acm https://https://www.doczj.com/doc/3815277570.html,/10.12677/acm.2019.93027 Advances in the Regulation of Autophagy Dan Xia Pathology Department of Shandong Medical College, Linyi Shandong Received: Feb. 4th, 2019; accepted: Feb. 13th, 2019; published: Feb. 25th, 2019 Abstract In this review, we will describe the dynamic progress how cells form isolation membranes with the participation of various autophagy-related proteins under the stimulation of upstream signals such as MTOR and AMPK, and further extend to form autophagic characteristic structures “auto-phagosome”, and how mature autophagosomes combine with lysosome to complete the degrada-tion and reuse of cytoplasmic substances. In addition, the research progress of post-translational modification (including phosphorylation, glycosylation, ubiquitination, acetylation and mercaptan modification) in regulating autophagy was briefly reviewed. It was pointed out that post-translational modification of autophagic proteins played an important role in the process of autophagy. Understanding which amino acid residues in autophagic proteins are modified and confirming the expression of these modified amino acids in related diseases will provide impor-tant targets for disease diagnosis and treatment. Keywords Autophagy, MTOR, Post-Translational Modification 细胞自噬调控的研究进展 夏丹 山东医学高等专科学校病理教研室，山东临沂 收稿日期：2019年2月4日；录用日期：2019年2月13日；发布日期：2019年2月25日 摘要 本文介绍了细胞在接受MTOR、AMPK等上游信号刺激下，在多种自噬相关蛋白参与下如何形成隔离膜、并进一步延伸形成自噬特征性结构“自噬体”以及成熟的自噬体如何与溶酶体结合完成胞浆物质的降解
自噬（Autophagy）及其研究方法概述 一、背景 概念: 目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA), 大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。通常说的自噬泛指Macroautophagy. 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。自噬的步骤可以大概总结为下面四步: 步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。 步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部
揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。 步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。 步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。 自噬的特性： 1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显着区别
研究方法 因农产品流通研究涉及环节众多、需要从多角度、多方位着手、综合探究, 单凭某一种理论视角无法洞察所有,所以本文采用了多学科相交叉的方法、应用了新制度经济学、现代产业经济学等学科理论、并结合图形和案例等工具对农产品流通模式进行了系统的研究。具体方法如下: (1 )文献研究法 主要体现在该文的文献综述部分,通过对先辈研究成果的大量阅读、整理、 归纳,了解了迄今为止有关的研究范围、研究角度、研究方法、研究成果以及未覆盖的研究方面和未深化的研究分支,以上都对本篇论文的研究内容起了指导作用。 (2 )逻辑推演法 本文是以“依据现实背景和文献查阅基础上提出命题一对中国农产品流通 模式的现状分析和与国外模式的比较下找出问题所在--引进相关理论创新农 产品流通模式--提出有效政策建议”的逻辑结构框架展开的研究,符合命题的 内在逻辑关系。 (3 )规范分析与实证分析相结合 本文解释了农产品价格上涨的一个重要原因--流通成本过高;阐述了我国 现有农产品流通模式对生产者(农民)和消费者(市民)造成的影响;分析了 影响农产品流通成本的制度因素和市场因素。以上结合相应的统计数据和分析工具都回答了经济学中“是什么”的问题,也正是实证分析的体现。除此之外, 本文还致力于创新一个适用中国的农产品流通的新模式并最后给出相应的政 策建议,这也是回答了经济学中“应该是什么”的问题一正是规范分析的所在。
5 (4)定性分析和定量分析相结合 文章在探索创新农产品流通新模式的过程中,不仅需要有定性分析,包括 从现有模式到创新模式的改进分析、创新模式的可行性分析等,还需要收集大量数据、实例作为论据,对新模式的合理性进行评估的定量分析。 (5)多种学科相交叉的方法 前面己经提到:本文引入了新制度经济学的交易费用理论和现代产业经济 学的SCP范式来分别针对如何降低农产品流通成本和如何构建农产品流通新模式做了研究,并且,本文相关研究也应用到了统计学和计量经济学的方法。因此,各种学科在此再也不能独自发挥功效了。
细胞自噬的研究进展 孙雅婧，郭青龙* 中国药科大学生理教研室，南京210009 细胞自噬（autophagy ）是指细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器被运输到溶酶体，溶酶体对其消化降解，以胞质内自噬体的出现为标志的细胞自我消化过程，以双层膜结构包裹部分胞质和细胞器的自噬体为判断指标。早在1962年，自噬现象的奠基人Ashford 和Porten 在人的肝细胞中用电子显微镜观察到了自噬现象。随着分子生物技术的发展，人们对自噬的形态特点和分子机制了解逐步深入。近年来对自噬的研究十分广泛，自噬是在体内普遍存在的过程，其在清除代谢废物进而回收能量为细胞正常运转提供能量的过程中发挥重要作用，因而对自噬的研究尤为重要。 1 细胞自噬的研究现状 1.1 自噬的过程 自噬的过程分为四个阶段（见图1）。 第一阶段：自噬诱导信号被细胞接受后，类“脂 质体”碗状结构即在胞浆某处形成小的膜结构，在电镜下观察到其不断扩张、呈非球形、扁平状双层膜的碗状结构，称为自噬前体（phagophore ），这种结构的电镜观察结果是指示自噬发生的金标准之一。 第二阶段：不断延伸的自噬前体，将胞浆中的若干成分（包括细胞器）收口包入，成为密闭的球状自噬体（autophagosome ）。自噬体的电镜观察结果是指示自噬发生的金标准之一。自噬体的特征有两个：双层膜，内含诸如线粒体、内质网碎片等胞浆成分。 第三阶段：自噬体形成后，可能与细胞内吞的吞噬泡（phagocytic vacuole ）、吞饮泡（pinosome ）和内 体（endosome ）融合（此阶段为非必需步骤）。 第四阶段：自噬体与溶酶体（lysosome ）发生融合，形成自噬溶酶体（autolysosome ）。期间溶酶体酶降解自噬体的内膜，使两者的内容物合为一体，自噬体中的包含物被降解，将产物诸如氨基酸、脂肪酸之类输送到胞浆中，重新利用供能，残渣则被排出细胞外或滞留于胞浆[1]。 1.2自噬的分类 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同， 哺乳动物细胞自噬分为3种主要方式：巨自噬（macroautophagy ）、微自噬（microautophagy ）和分子伴侣介导自噬（chaperone-mediated autophagy ，简称 CMA ）。巨自噬是最主要的自噬形式，在巨自噬中由 内质网来源的膜包绕待降解物，形成自噬体后与溶酶体融合并降解其内容物；然而在微自噬中，溶酶体膜直接内陷包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解，没有形成自噬小体的过程；分子伴侣介导自噬则为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到溶酶体腔中，被溶酶体酶消化。CMA 的底物是可溶蛋白分子，因此CMA 降解途径在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性[3]。 2自噬与凋亡 在多细胞生物体内，维持自身的稳态和内环境 的平衡，是保持复杂生物体系正常运转的重要条件。正常的细胞体系当中，有细胞的生长增殖必然 摘要本文综述了细胞自噬概念的研究现状、自噬与凋亡、自噬与肿瘤的关系，展望了自噬在抗癌药物介导的细胞死亡中发挥的重要作用以及自噬现象的临床意义。 关键词自噬；凋亡；肿瘤 中图分类号 Q25；R979.1文献标志码A 文章编号1673-7806（2012）03-236-04 作者简介 孙雅婧，女，硕士生E-mail:yj7782@https://www.doczj.com/doc/3815277570.html, 通讯作者郭青龙，男，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤药理学 E-mail:anticancer_drug@https://www.doczj.com/doc/3815277570.html, 收稿日期 2012-03-14 修回日期2012-03-26* 图1自噬的基本过程[2] Jun;20(3) 236
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/3815277570.html, 哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展 作者：陆陈晨谭树华 来源：《科学与财富》2018年第13期 摘要：哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。 关键词：哺乳动物细胞；驯化；无血清培养 重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。 1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点 传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]： 1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化； 1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性； 1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。 2 细胞无血清悬浮培养的优势 细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。 3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法 3.1 分子生物学手段改造 贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表
研究方法及步骤 【摘要】本文从科学研究的思维方式入手，介绍了研究的路径、研究的分析方法，以及研究的设计与步骤。作者强调论文写作应该反映研究过程，遵循科学的分析方法和步骤。作者对论文写作中涉及的主要方法与步骤进行了介绍和分析，特别是针对传统的研究思维模式进行了反思，剖析了研究生论文写作中的问题，为研究生的论文写作勾画出了一个研究过程的框架。 【关键字】研究方法研究步骤定量分析定性分析论文写作步骤 ThesisWriting:ResearchMethodologiesandProcedures JianWang ProfessorofInternationalbusiness UniversityofInternationalBusinessandEconomics(UIBE) ABSTRACT:Thispaperbeginswithscientificresearchcycleconcept,introd ucesresearchapproaches,analysismethods,researchdesignandprocedures.Th eauthoremphasizestheimportanceofmethodologiesandprocedures,whichshoul https://www.doczj.com/doc/3815277570.html,paredwithnormalscientificresear chmethodologiesandprocedures,theauthorrethinkstheChinesetraditionalis sue-orientedresearchapproachbypointingoutitsambiguityandignoranceofme thodologiesandprocedures.Thepapercanprovideaguidanceandframeworkforgr aduatestudentsdoingresearchwhilecompletingtheirthesiswritings. KEYWORDS:researchmethodology,researchprocedures,quantitativemetho ds,qualitativemethods,thesiswritingprocedures 论文写作中的研究方法与研究步骤 一、研究的循环思维方式 二、研究的路径 三、研究的分析方法 四、研究过程的设计与步骤 五、对传统研究思维模式的再思考 在我们指导研究生写论文的过程中，甚至于我们自己从事课题研究时，不禁让我们思考一系列有关研究的基本问题。例如，我们为什么要写论文？我们为什么要做研究？在我们探讨论文写作的过程中，我们是为了完成论文本身的写作，还是完成一个研究过程？写论文与做研究之间有什么联系与区别？如果论文写作应该反映一个研究过程，那么研究过程应该是什么样的？我们用什么样的方法进行研究？我们发现这些问题的解决，对指导研究生的论文写作有非常大的帮助。因此，本文就以我个人在从事教学课题研究和指导研究生完成论文中总结的一些有关研究方法与研究步骤的问题与大家交流共享。欢迎大家参与讨论。 一、研究的循环思维方式 世界上无论哪个领域都存在许多未知的事物，也存在着许多未知的规律。我们研究者的主要任务就是要不断地从大量的事实中总结规律，将之上升到可以指导实践的理论。然而理论也并不是绝对的真理，它也要在实践中不断地被修正，因此，就会有人对理论的前提和内容进行质疑，并提出新的猜想和新的思维。新的猜想和新的思维又要在实践中进行验证，从而发展和完善理论体系。我们探求未知事物及其规律就需要有研究的过程。这个过程，我们称之为研究的循环思维方式（ResearchCycle）。用概念模型来表述就是[1]： Facts—Theory—Speculation
研究资料整理分析的方法 篇一：资料的整理与分析方法 资料的整理与分析方法 我们在前面两文中分别谈到收集“事实资料”和“文献资料”的方法，这无形之中好象将资料分成了“事实资料”和“文献资料”两种，显然这不是一种严格意义上的分类（只是按照收集的方法来考虑的），因为“文献资料”中也可以有“事实资料”（当然不是第一手资料），它们之间有交叉的成分，由此为研究方便起见，可将其分为“事实资料”与“理性资料”；如果从资料的性质来考虑，资料还可以分为定量资料（主要是各种数据）与定性资料（主要是文字材料）。收集到大量的资料之后，一般就要进行适当的筛选、整理和分析。本文就要谈谈如何做好这些方面的工作。 一．筛选 有些研究，需要收集的资料比较多，面对这成堆的资料，首要的任务就是要在初步阅读（当然需要做简单的分析）的基础之上做适当的筛选。筛选的主要目的在于“去伪存真”，“由表及里”，即只保留对本课题研究有参考价值的资料而删去其余。通常，对于“理性资料”要求它有：可靠性，正确性，权威性；对于“事实资料”要求它有：真实性，典型
性，浓缩性。 二．整理 整理也就是要分门别类，并以某一种或几种方法表示出来，以便于下一步的分析。对于各种数据，首先是分类，通常有两类：计数数据和测量数据，其中后者又有四种水平：类别的，顺序的，等距的，比率的；然后进行适当的整理，通常采用的方法有两种：频数分布表和频数分布图，其中前者有简单次数分布表、相对次数分布表、累积次数分布表、累积相对次数分布表、累积百分数次数表等，后者又有散点图、线形图、条形图（也叫直方图）、圆形图（也称饼形图）之分。 对于定性资料，通常是按照一定的标准进行分类。比如对某一课题资料，可以按历史线索分类；可以按不同的观点分类；可以按研究的问题的性质分类；还可以按子课题分类，等等。 三．定性分析与定量分析 对资料的分析，从方法论角度，一般可分为定性分析和定量分析，而且通常在实际分析过程中，要把这两种方法结合起来，交互使用。因为定性分析与定量分析相互补充，相得益彰，处在统一的连续体之中，定性分析为定量分析提供
线粒体自噬 线粒体自噬研究概论 关于线粒体自噬 线粒体自噬(mitophagy)是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。选择性清除受损伤或功能不完整的线粒体对于整个线粒体网络的功能完整性和细胞生存来说十分关键。 线粒体自噬主要的作用有几个方面： 1.选择性清除功能受损的线粒体 2.选择性调节细胞内线粒体数量 3.通过线粒体影响诸多生理和病理学过程 Fig:The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria Cell Death and Differentiation(2013)20,31–42
线粒体自噬的信号通路 1)Pink/Parkin pathway 2)Bnip3/Nix pathway 3)FUNDC1pathway Fig.Mitophagy pathway:Pink1/Parkin OR Bnip3/Nix Pink1/Parkin pathway：E3泛素连接酶Parkin和蛋白激酶Pink1一起介导了线粒体膜电位下降,引起的线粒体自噬的发生,当线粒体损伤后,线粒体膜电位下降,引起Pink1蛋白在损伤线粒体上的积累,能够吸引Parkin到损伤的线粒体上。Parkin使得线粒体外膜上的很多蛋白发生泛素化,从而能够募集其他一些相关蛋白,介导线粒体自噬的发生。
线粒体自噬 汉恒线粒体自噬研究工具与研究方法 汉恒生物有多种线粒体自噬病毒研究工具可以提供，便于直接感染目的细胞后直观地观察线粒体自噬的变化 一、汉恒线粒体自噬表型研究工具 1）Ad-GFP-LC3腺病毒病毒系统，可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平（由于GFP荧光偏弱，暂停Ad-GFP-LC3销售， 慢病毒单标LV-GFP-LC3荧光正常，正常销售）； 2）Ad-HBmTur-Mito腺病毒系统（红光标记），为汉恒生物自主研发的线粒体特异性定位荧光探针（pHBmTur-Mito）可准确定位标记线粒体，结合汉恒独家推出的双荧光LC3细胞自噬腺病毒的使用，即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程； 使用方法：Ad-GFP-LC3+Ad-HBmTur-Mito共感染目的细胞，confocal检测双荧光共定位的情况，如果共定位，则存在线粒体自噬！（下图说明：红色标记为线粒体，绿色标记自噬小体，二者有共定位时代表自噬发生） 二、汉恒线粒体自噬通路研究工具 1）Ad-Parkin-EGFP 2）Ad-Bnip3-EGFP+Ad-Nix-EGFP 3）Ad-FUNDC1-EGFP
生态学的研究方法 摘要：本文就生态学研究的方法论进行了浅括。任何科学研究都包括两个层面，即如何思考和如何做。生态学研究需要先对自然界或实验室中的生态现象进行观察记载、测计度量和实验，再对资料数据进行分析综合，然后用数学模型找出生态学规律。最后本文就当前生态学研究的发展趋势进行了展望。 关键词：生态学，研究方法，展望 ABSTRACT In this paper, we summary the methods of research on ecology. Any researches include two factors that are how to think and how to do. When studying ecology, we need to observe and record ecological phenomena, then analysis the data .Finally, use mathematical models to find the law of ecology. At the end of this paper. We prospect the trend of ecological research . Key words: Ecology, Methodology , Prospect 生态学是研究有机体及其周围环境相互关系的科学。任何科学研究都包括四个环节，首先根据已有理论，提出科学问题。然和通过观察记载、测计度量和实验收集数据，通过归纳法予以系统分析。再根据研究结果，演绎新的推论，最后通过实验验证，判断这一过程成功与否。从50年代开始，生态学研究方法一方面趋向专门化，针对不同对象和问题，设计了各种专用的方法技术；另一方面是强调系统化，表现是为各类生物系统制定出生态综合方法程序。生态学研究的专门化与系统化同时并进，彼此汇合，是学科方法体系日趋成熟的标志。下面就生态学研究的方法论进行阐述。 一生态学研究的方法论 1 基本逻辑：归纳与演绎 前提与结论之间存在或然关系（即非确定性的相互关系）的推论过程。亚里斯多德最早提到归纳法，但英国唯物主义哲学家Francis Bacon是归纳逻辑的奠基人的《新工具论》（1620）。他提倡通过归纳事实，产生低级的理论，再由低级的理论上升到高级的理论，最后形成公理，从而遵循从特殊到一般的过程。他的逻辑方法是对中世纪欧洲神学欺人自欺的演绎逻辑的反动，并且是近代实验科学的方法论。归纳法在现代数学中的代表是概率统计。归纳推理所得到的结论是超
发表时间：2011-6-2 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：刘杉珊李薇[导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。 刘杉珊李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心吉林长春130021） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04 【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。 【关键词】自噬分子机制p53 近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。 1 自噬的概念 自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 2 自噬的诱导
哺乳动物自噬研究方法 【摘要】 自噬涉及到许多的生理和病理过程，因此，我们越来越需要科学地准确认识，并且量化操控自噬的过程。但是，由于自噬涉及了许多动态复杂的过程，关于它的研究分析经常不正确。在本文中，我们探讨监控自噬以及调控自噬活性的各种方法，主要集中关注哺乳动物中的大自噬。 【简介】 过去的十年中，有大量的研究围绕一个基本的细胞生物学通路“自噬”（希腊语中意味自我吞噬）。一系列进化上保守的基因（最初在酵母中被鉴定）被发现是自噬过程中所必需的，这一发现使得科学家能够去发现大量的自噬的功能，如：维持自身平衡稳态、参与细胞发展和其他生理活动。此外，越来越多的证据证明自噬的失控可能与许多哺乳动物的疾病发生有关。因此，科学家们迫切需要能够准确的检测自噬和研究在不同生物学进程中的功能的方法，特别是在哺乳动物系统。 在哺乳动物自噬的研究历史中一直有两个主要的困扰。首先的挑战在于如何将“一个动态的进程”和“静态的测量”进行捕获，并且这个固有的局限性与基于这些测量作出的生物学推论相关。第二个挑战在于将“形式”与“功能”分离，并且避免在给定的生理条件下，基于自身检测到（或没有）导致的将生理功能归至自噬的这个常见陷阱。这两个挑战可能导致了在我们研究哺乳动物自噬功能的历史中的许多误解。例如，一些神经退行性和肌退化性疾病最初被认定的结果，至少一部分被认为是由于自噬的增加（基于显微镜下观察到通路中早期的中间产物的增加）。然而实际上，早期中间产物的蓄积在这些疾病中代表着后阶段自噬通路的阻滞。自噬的一个常见的形态特征是细胞的垂死状态，但这也被错误的认为是一种细胞死亡通路，然而，现在似乎已经很明确自噬的主要功能是帮助细胞抵抗各种“生死攸关”的应激条件并使细胞存活。 这些哺乳动物自噬研究中的历史挑战部分已经通过将阐述自噬分子机制的最新进展运用到新的自噬研究的方法被克服。因此，在过去的十年里，许多新的技术被发明，用于动态监控自噬和通过调控自噬来明确其在给定的细胞状态下的功能。本文的目的在于提供一个重要的关于目前可行的研究哺乳动物自噬的技术和这些技术在解释过程中的限制的概述。更多的各种技术的细节信息可以再其他综述中获得。 自噬的基础知识 自噬是一般用于描述细胞内物质包括细胞器到溶酶体中降解的过程。在自噬的三种类型中（大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬），研究得最多的就是大自噬。分子伴侣介导的自噬是通过伴侣蛋白展开蛋白质，直接将细胞质蛋白转移，穿过溶酶体膜。小自噬涉及溶酶体膜表面的内陷提供一小部分细胞质进入溶酶体内腔。 大自噬（简称自噬）是本文主要关注的通路。这个通路从酵母到哺乳类都呈现保守，它是通过一些特定的细胞器（自噬体）介导的。在初始的诱导阶段，一个小的囊状的称作隔离膜或者延长的吞噬膜，随后封闭一部分细胞质，导致双层膜结构即自噬体的形成。然后自噬体的外膜融合至一个溶酶体（形成自噬溶酶体），导致所封闭的物质和自噬体的内膜共同降
自噬现象及其分子机制的研究进展 发表时间：2011-06-02T10:04:12.903Z 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：刘杉珊李薇 [导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。 刘杉珊李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心吉林长春 130021） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04 【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与 p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。 【关键词】自噬分子机制 p53 近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。 1 自噬的概念 自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 2 自噬的诱导 当细胞受到饥饿、高温、低氧及荷尔蒙等外界刺激, 或细胞器的损坏、突变蛋白的积聚及微生物的侵袭等应激时, 可引起细胞自噬的发生。雷帕霉素靶点TOR蛋白激酶(target of rapamycin)作为细胞中氨基酸、ATP和激素的感受器, 是调控细胞生长的关键因子之一,其是细胞氮水平的负调节剂，参与自噬反应的调节[3]。研究表明, TOR对自噬反应的调节与细胞的营养条件有关,当营养充足时, 细胞中TOR被激活而抑制自噬，而当细胞处于饥饿状态时, TOR被抑制而促进自噬。在哺乳动物细胞中又有Tor蛋白，同时Tor蛋白也随着周围环境的改变来调节自噬但是调节机制要较酵母细胞复杂。在哺乳动物细胞中mTor的上游负调节有I型PI3K激酶，PDK1和AKt/PKB,而PTEN能拮抗PI3K而促进自噬。同时伴随着自噬的发生。TOR 的失活引起Atg结构的改变, 如Atg13p部分去磷酸化, 在营养充足时Atg13可高度磷酸化而不易于Atg1激酶结合从而抑制自噬发生。相反，在细胞处饥饿状态时Atg13可很快与Atg1结合，从而增加自噬。同时mTor可增强与Atg17p和Atg1p之间的相互作用,从而调节其激酶活性。 3 自噬过程 自噬其发生过程大致分为3个阶段：(1)在饥饿、氧化应激损伤等情况下，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解物（如蛋白质降解产物，细胞器和核糖体等）周围[3,4] ；(2)分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成双层膜自噬体；(3)自噬体通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，与之融合形成自噬溶酶体并降解其内成分，自噬体膜脱落再循环利用。因此自噬可被视为细胞的“回收工厂”，其不仅促进能量的利用同时转运无功能的蛋白和细胞器。而调节这个复杂的过程的分子水平有五个关键阶段[5]:（1）形成吞噬泡（2）Atg5-12复合物与Atg16L并且多聚化（3）LC3形成并且插入吞噬泡膜（4）包绕预被降解物（5）自噬体与溶酶体融合。 3.1吞噬泡的形成 酵母细胞的吞噬泡膜形成于PAS，而哺乳动物细胞吞噬泡膜来其于内质网[6,7]，高尔基体[3,8,9]等，甚至可能在严密调控下来源于细胞核[10]。酵母细胞形成吞噬泡膜需要Atg1激酶与Atg13和Atg17复合物，该复合物可能通过跨膜蛋白Atg9补充脂质而促进吞噬泡膜的扩增[4,11]。这个过程可通过Tor激酶调节，其磷酸化Atg13从而阻止其与Atg1激酶作用[13]哺乳动物细胞吞噬泡的形成过程仍需要进一步研究。III型PI3K激酶，Vps34和Atg6/Beclin-1在哺乳动物细胞的吞噬泡形成和自噬的作用已经很好的认识。Vps34参与细胞膜的形成，但其需要与Beclin-1和其他调控蛋白来选择性的参与自噬过程[14]。PI3P在吞噬泡的延伸和不断补充Atg蛋白过程中起重要作用，Vps34与PI3K以PI为底物获得PI3P过程中，Vps34是十分重要的[15]。Vps34与Beclin-1作用可增加PI3P的水平。其他与Vps34与Beclin-1复合物结合促进自噬调节蛋白为UCRAG，BIF-1，Atg14L和AMBRA[16,17] ,或抑制自噬蛋白Rubicon, Bcl-2[18,19]. Beclin-1与Bcl-2结合可破坏Beclin-1与Vps34的作用，所以Beclin-1与Bcl-2，Bcl-XL作用与内质网可抑制自噬[21]。 3.2 Atg5-Atg12复合物形成 由Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atgl2和LC3(Microtubule—associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程,在Atg 12结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用。有的两个泛素样蛋白系统参与形成Atg5-Atg12复合物和LC3, Atgl2首先由El样酶Atg 7活化，之后转运至E2样酶Atgl0，最后与Atg5结合，形成自噬体前体。Atg5-12复合物与Atg16L结合形成Atg5、Atgl2和Atgl6L 以复合物形式存在，这种结合一方面促进了自噬泡的伸展扩张，使之由开始的小囊泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；另一方面，Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3-向自噬泡的募集。Atg5-12复合物不依赖于自噬的作用，一旦自噬体形成，Atg5-Atgl2-Atgl6L复合物就脱离胞膜，使之Atg5-12复合物不是自噬的标志物。 3.3 LC3形成 第二条泛素样蛋白加工修饰过程参与LC3B 的形成，LC3B由哺乳动物细胞Atg8同源染色体编码。LC3B 被Atg4分解，生成LC3B-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样LC3B-I也被E1样酶Atg7活化，转运至第二种E2样酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3B-II。LC3B-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3II即被溶酶体中的水解酶降解。哺乳动物
文献研究 文献法是指通过已有文献来获得信息，从而全面地、正确地了解掌握所要研究问题的一种方法。文献法一般用于项目前期研究的假设和后期结果的解释。 访谈法 由访谈员和被访对象采取一对一的方式，依据于事先准备好的访谈提纲进行交谈，以检验行为和态度之间的关系，探讨原因、评价和反馈意见。 1.入户访谈：观察和了解产品的、使用环境、使用习惯、用户需求等。 2.定点预约访谈：面对面深度了解用户的行为和态度之间的关系、获得某些启发性的信息。 3.电话访谈，通过电话和用户进行交流，了解用户的态度和需求。 问卷法 问卷法是以书面形式向被访人提出问题，并要求被访人以书面或口头形式回答，来进行资料搜集的一种方法。它具有简明、通俗、客观、真实、反馈快、保密性好等特点，可以在较大范围内同时使用于众多被访人，因此能在较短时间内搜集到大量的数据。 1.街头拦截访问是一种常用的定量问卷调查方法，这种方法相对简单，超市、写字楼、街面、车站、停车场等公共场所均可进行这样的访问。 2.电话调查主要是通过电话，与被访者进行信息交流，从而达到资料收集的目的。 3.网络调查，指将问卷或相关资料以电子问卷形式传递给被访者，由被访者填写并将电子问卷发回的方法。与传统调查方式比较，网络调查在组织实施、信息采集、信息处理、调查效果等方面具有明显的优势 4.邮寄调查，指将调查的问卷及相关资料寄给被访者，由被访者根据要求填写问卷并寄回的方法。可以扩大调查范围，增加样本量，减少访问员的劳务费，可以对较敏感或隐私问题进行调查。 焦点小组 焦点小组是一种定性的调查方法，5－9 人为一组。在一名专业主持人的引导下对某个主题或者概念进行深入的讨论，说出他们的与主题相关的感受、态度以及意见。 焦点小组通常用于产品功能的讨论、工作流程的模拟、用户需求的发现、用户界面的结构设计和交互设计、产品的原型的接受度测试、用户模型的建立等。 特点： λ可以以很低的成本接触到大量的用户群体， λ对目标市场的情况更加了解，知道他们在想什么，他们想要什么 λ只能收集到用户对概念和创意的想法，并不知道他们是否使用得好 小组间的交流是一把双刃剑。一方面，想法会在小组里交流碰撞并深入发展，从而激发新的意见产生；另一方面，这些想法和意见并不十分可信，小组里较为强势的人会影响其他人发表他们的意见。 焦点小组应该在下列情况下使用： λ如果项目着手较早 λ如果你对你的目标市场几乎一无所知 λ如果你想深化新创意，却不确定反响会如何 原型制作（Prototyping） 原型(Prototype)是指一个仿制品或者工作模型，通常是指不存在的系统。它能够体现产品功能和交互的某些特点，并能够实现部分或全部功能的设计实体。原型制作的分类可以分为：低保真（lo-fi）、中保真（mi-fi）