快速高效偶联亲和层析介质试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：CDI预活化琼脂糖凝胶4B试剂盒。
商品名称：快速高效偶联试剂盒。
【包装规格】
20mL活化柱+500mL缓冲液/盒，附送亲和层析用空柱一支。
【预期用途】
快速高效偶联试剂盒适用于亲和层析填料的快速制备以及固相吸附、固定化酶等用途。
【主要组成成份】
●预活化琼脂糖凝胶4B
●缓冲液
【原理】
本试剂盒系用优质琼脂糖凝胶4B活化后存放于保护液中和适合的偶联缓冲液制成，用活性咪唑碳酸酯基团偶联需要的配体。
使用时，保护液被洗去后就可使欲偶联的配体的氨基和活性咪唑碳酸酯反应，脱去咪唑基，使得配体的氨基通过共价键牢固的链接在基质上，即可方便得到高偶联效率的亲和层析填料。
【存储条件和有效期】
存储条件：原包装应储存于4-8 C。密封保存在阴凉干燥处切忌冷冻。有效期：一年。
【适用仪器】
本产品无需特殊仪器辅助使用，只需要在操作时使用抽滤装置帮助抽去洗涤液，以免洗涤时间过长造成偶联效果不理想。
附送的亲和层析空柱可安装适合的接口用于自动纯化仪。
【配体要求】
配体溶液的质量至关重要。配体需溶解于偶联缓冲液中并使得浓度大于15mg/mL，并且浓度越大，偶联效果越好，如已经溶解在其他缓冲液中，可用偶联缓冲液透析平衡。
【偶联方法】
方法一：
1、预先准备好溶解在偶联缓冲液中的配体（可用直接溶解或透析
方法制备），浓度>15mg/ml或者更高，浓度越高偶联效果越好。
2、将活化琼脂糖摇匀，倒入抽滤漏斗，加5倍体积的去离子水，抽气至快干时拔掉抽气管，注意不可抽干，此步速度宜快。
3、用配体溶液悬浮抽滤漏斗里的琼脂糖固体，摇床缓慢振荡（不可使用磁力搅拌器），室温3小时或4摄氏度过夜，然后洗净即可。洗出来的配体可回收使用。
此方法适用于比较昂贵的配体。
方法二：
1、用干燥枪头吸去保护剂。制备配体在溶液B中的溶液（可用直接溶解或透析方法制备），浓度>15mg/ml或者更高，浓度越高偶联效果越好。
2、用5倍以上体积配体溶液悬浮抽滤漏斗里的琼脂糖固体，4度摇床缓慢振荡（不可使用磁力搅拌器），过夜后用适当缓冲液洗净即可。洗出来的配体可回收使用。
此方法适用于比较廉价的配体。
注意：
如果配体不耐高pH条件，可以用1M盐酸调节缓冲液至适合pH。
【装柱】
塑料层析柱
1、将层析柱固定，封闭层析柱下端出口，向柱内充入去离子水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。
2、先将介质混匀，打开层析柱下端出口，排出柱中去离子水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用导流棒沿内壁倒入介质或移液枪吸取介质，将介质加入到层析柱中；静置，待介质自
然沉降。
3、从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡。
4、若使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可按2）、3）所述步骤重新装柱。
5、注意整个操作过程无气泡。
玻璃层析柱
1、将层析柱洗净后固定；向柱中加入去离子水，排开柱子中的空气，纯水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留一定高度的去离子水。
2、先将介质混匀，用导流棒沿内壁倒入介质或移液枪吸取介质，将介质加入到层析柱中；静置，待介质自然沉降。
3、从上端管口将转杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。
4、在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。
5、注意整个操作过程无气泡。
【产品性能指标】
本试剂盒具有快速、简便、高效等优点，是一种迅速偶联配体的方法，偶联效率最高可达到50mg/mL(IgG)，活化基密度并且没有引入电荷，减少了非特异性吸附，共价化合牢固，不会脱落，特别适用于不耐盐的亲和系统。独特的免封闭设计，使得合成更高效，回收配体更容易。
图：偶联配体后纯化效果
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1：发酵液2：流窜液3：洗脱液
【注意事项】
1. 抽滤的时候不能抽干，以免影响效果。
2. 活化琼脂糖倒出来后请尽量一次性使用，不要受潮。
3. 操作越快偶联效率越高。
【参考文献】
1．Mallia A K,Hernanson GT,Krohn R I,et al. Preparation and use of a boronic acid affinity support for separation and quantitation of glysocylated hemoglobins.Anal Lett,1981,14(B8)：649-661 2．Kuhn N.Activation of molecular oxygen by hemin complexes. Prikl Biokhim Mikrobiol,1982,18(4):489-98
【生产企业】
企业名称：柳州市智萃生物试剂研制中心
企业地址：柳州市雅儒路东四巷182号2楼
邮政编码：545001
销售热线：136********
技术支持：151********
国家生化工程技术研究中心（北京） 地址：北京市海淀区中关村北二条1号中国科学院过程工程研究所西区 电话/传真：010- 82544957 邮编：100190 Protein A 亲和介质（Protein A QZT 4FF ）产品说明书 1. 产品简介 Protein A 能特异性地与抗体的Fc 区结合，所以Protein A 亲和介质可用于抗体（单抗和多抗）的分离纯化，经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体。Protein A QZT 4FF 亲和介质以自制的琼脂糖凝胶为基质，以重组Protein A 为配基，具有很高的物理化学稳定性，配基不易脱落，寿命长，使用方便，应用广泛。 2. 产品特性 3. 使用方法 Protein A QZT 4FF 广泛用于各种抗体的分离纯化。层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。 平衡：用5~10CV 的平衡缓冲液（20 mM PB+0.15M NaCl ，pH 7.0，添加适当浓度的NaCl 抑制非特异性吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH 不变（与平衡液一致）。 进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓
National Engineering Research Center for Biotechnology (Beijing) Add ：No.1 Bei er tiao, Zhongguancun, Haidian District, Beijing, China Tel/Fax ： 010- 82544957 Post code ：100190 度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45μm ）处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。 淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。 洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM 柠檬酸，pH 3.0-4.0；或0.1M 甘氨酸，pH 3.0；或20 mM 乙酸钠，pH 3.0-4.0；具体洗脱条件与抗体的结合强度和稳定性密切相关，效果不好时应进行洗脱缓冲液（种类和pH 或添加剂）的优化）洗脱，收集流出液。洗脱后，应立刻用碱性缓冲液（如1M Tris/HCl, pH 9.0）将收集到的抗体溶液中和到抗体稳定的pH ，避免抗体失活，维持抗体的生物活性。 再生、原位清洗：介质使用数次（5-10次，具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关）后，需要对介质进行再生、在位清洗。 （1）用0.1M 的乙酸或0.1M 的乙酸/20%乙醇淋洗柱子3-5CV ，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用； （2）也可用0.05M NaOH+1M NaCl 或6M 盐酸胍淋洗柱子3-5CV ，并用3~10 CV 的纯水冲洗，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用。 其它注意事项：在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。 4. 具体应用 1 载量分析：利用人免疫球蛋白（血浆来源，纯度95%，3mg/ml ）进行载量分析（柱体积2ml ；Buffer A ：20 mM PB+0.15M NaCl ，pH 7.0，Buffer B ：0.1M 甘氨酸，pH 3.0；流速：0.5ml/min ；上样量：40ml ），层析谱图如图1（A ：进口介质；B ：本中心介质）所示，结果表明两种介质的层析谱图（穿透行为、洗脱峰）基本一致，无明显差异。洗脱峰的蛋白浓度分析结果表明，二者的载量相似，均在40-45mg h-IgG/ml 介质之间。 2 纯化效果分析：利用小鼠腹水（Buffer A 稀释4倍）上样进行亲和层析，考察介质的分离纯化效果（柱体积2ml ；Buffer A ：20 mM PB+0.15M NaCl ，pH 7.0，Buffer B ：20mM 柠檬酸，pH 3.0；流速：0.5ml/min ；上样量：4ml ），层析谱图如图2所示，纯度分析结果表明，经过一步亲和层析，即可得到纯度95%以上的IgG 。
一、亲和层析基本知识 亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专 一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一 种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特 异性亲和色谱。这种特异可逆结合的物质很多，如 抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的 这种特异亲和能力又叫亲和力。 亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为 配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认 为是激素的配体。 其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。 亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。 二、固相载体的选择 对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。再者，载体的组成大小也应均匀。高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。这不是我们所希望的。一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。 三、配体的选择 亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子
亲和层析技术在生物科学中的应用及发展 摘要：近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速，广泛应用于生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等)的分离和纯化，是蛋白质组学研究中重要的技术之一。介绍了亲和层析的基本类型及配体合成的研究进展，概述了亲和层析技术在蛋白质组学以及在其他方面的应用和发展动态。 关键词：亲和层析；基本原理；类型；应用 亲和层析(amnitychromaloSraphy)是利用偶 联亲和配体的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目 标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法， 近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速，并在生 物技术产品、生物分子及组织的分离和纯化领域 取得令人瞩目的成就。现已广泛用于分离纯化蛋 白质、肽、酶及其底物和抑制剂、抗体及抗原、核酸 及其特异性作用物、激素及受体、细胞及细胞表面 物等等”。基于此，本文针对亲和层析的基本类 型，配体的选择和亲和层析在生物学特别是蛋白 质组学中的应用等方面作一介绍。 1 亲和层析的类型 亲和层析柱中被固定的配体是决定亲和层析 成功的关键因素。根据配体与生物大分子之间相 互作用体系不同，可以把亲和层析分为以下4种 类型。 1．1 生物亲和层析(BAFC) 生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特 异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的 选择性。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、 激素—受体等。 1．2 免疫亲和层析(1AFC) 利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另 一方的分离系统，称免疫亲和层析，免疫亲和层 析应用相当广泛，许多典型的亲和层析纯化蛋白 质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体， 目前，利用抗体－抗原模式，有可能得到每一种目
GST亲和层析介质使用说明书 一、简介 GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。 本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。 二、性能参数 三、适用范围 分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。 四、操作说明 1. 缓冲液配制 缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0。 缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。因Glutathione易氧化，需现用现配。 （注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用)。 2. 样品预处理：
按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。 3. 装柱： 聚苯乙烯层析柱 1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。 2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。 3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。 4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述 玻璃层析柱 1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。 2) 先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。 3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。 4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。 4. 过柱： 1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书 一、简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 二、性能参数： 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体 Ni2+ 配体密度20-40μmol /ml 吸附载量15mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速600cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 三、适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、应用实例 实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白 实验步骤： 1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为 1ml/min；
亲和层析柱使用说明货号 名称规格说明DS0101 亲和层析柱1ml 含1个空管柱，上下盖和2个筛板（亲水性，孔径50um） DS0103 亲和层析柱3ml DS0106 亲和层析柱6ml DS0110 亲和层析柱10ml DS0130 亲和层析柱30ml DS0150 亲和层析柱50ml 一、产品说明 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。它是利用生物分子间 存在很多特异性的相互作用（如抗原和抗体、酶 和底物或抑制剂、激素和受体等），通过将具有 亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另 一个分子进行分离纯化。 提供的亲和层析柱工具可应用于如下方面： ①纯化重组蛋白；②纯化抗原和抗体；③纯化多 肽；④纯化DNA；⑤糖蛋白的纯化；⑥纯化磷酸 化蛋白和肽；⑦DNA 结合蛋白的纯化；⑧去除内毒素，等。 亲和层析柱空柱管的材质为医疗级的聚丙烯，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWM-PE（超高分子量聚乙烯）为原料，经独特的工艺加工而成，具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端，以阻挡昂贵的基质渗出。亲水性筛板采用了领先的亲水性UHWM-PE 生产技术，该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时，该筛板和其它同类产品相比，不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外，该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡，气泡会使流速降低，液体通过基质不均匀。
二、产品应用 1，抗体纯化 纯化抗体一般用Protein A作为纯化的配体，也可以用Protein G或Protein L或异源性抗体作为配体。 2，小分子物质提取（以提取黄曲霉毒素M1为例） 试样通过免疫亲和柱时,黄曲霉毒素M1被提取。亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上,当样品通过亲和柱时,抗体选择性的与黄曲霉毒素M1(抗原)键合，形成抗体一抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质,然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1,收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。 3，重组蛋白纯化 近年来，随着生物技术，特别是基因工程技术的迅猛发展，重组蛋白表达和纯化越来越容易。常用的重组蛋白表达策略是把蛋白与亲和标签融合表达，利用亲和标签一步纯化出目标蛋白。此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性，就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化任何蛋白质。此方法与常规的层析方法不同之处在于，无需针对不同的蛋白质开发特定的配体和方法。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件，可一步亲和层析从粗提物中纯化出重组蛋白，纯度可达90％以上。 亲和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。亲和标签系统一般具有以下特征：(a)一步的吸附纯化；(b)对三级结构和生物活性影响小；(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质；(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确；(e)适用于大量的不同蛋白质。但是没有哪个标签是完美的，只能根据实际需要去自己筛选，下表是分的标签以及纯化的方案。
亲和层析技术 （一）原理 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 此法具有高效、快速、简便等优点。 （二）载体的基本要求和选择 理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。 可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。 琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。 琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。 （三）试剂与配制 1．Sepharose 4B 2．CNBr（剧毒）
快速高效偶联亲和层析介质试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：CDI预活化琼脂糖凝胶4B试剂盒。 商品名称：快速高效偶联试剂盒。 【包装规格】 20mL活化柱+500mL缓冲液/盒，附送亲和层析用空柱一支。 【预期用途】 快速高效偶联试剂盒适用于亲和层析填料的快速制备以及固相吸附、固定化酶等用途。
【主要组成成份】 ●预活化琼脂糖凝胶4B ●缓冲液 【原理】 本试剂盒系用优质琼脂糖凝胶4B活化后存放于保护液中和适合的偶联缓冲液制成，用活性咪唑碳酸酯基团偶联需要的配体。 使用时，保护液被洗去后就可使欲偶联的配体的氨基和活性咪唑碳酸酯反应，脱去咪唑基，使得配体的氨基通过共价键牢固的链接在基质上，即可方便得到高偶联效率的亲和层析填料。 【存储条件和有效期】 存储条件：原包装应储存于4-8 C。密封保存在阴凉干燥处切忌冷冻。有效期：一年。 【适用仪器】 本产品无需特殊仪器辅助使用，只需要在操作时使用抽滤装置帮助抽去洗涤液，以免洗涤时间过长造成偶联效果不理想。 附送的亲和层析空柱可安装适合的接口用于自动纯化仪。 【配体要求】 配体溶液的质量至关重要。配体需溶解于偶联缓冲液中并使得浓度大于15mg/mL，并且浓度越大，偶联效果越好，如已经溶解在其他缓冲液中，可用偶联缓冲液透析平衡。 【偶联方法】 方法一： 1、预先准备好溶解在偶联缓冲液中的配体（可用直接溶解或透析
方法制备），浓度>15mg/ml或者更高，浓度越高偶联效果越好。 2、将活化琼脂糖摇匀，倒入抽滤漏斗，加5倍体积的去离子水，抽气至快干时拔掉抽气管，注意不可抽干，此步速度宜快。 3、用配体溶液悬浮抽滤漏斗里的琼脂糖固体，摇床缓慢振荡（不可使用磁力搅拌器），室温3小时或4摄氏度过夜，然后洗净即可。洗出来的配体可回收使用。 此方法适用于比较昂贵的配体。 方法二： 1、用干燥枪头吸去保护剂。制备配体在溶液B中的溶液（可用直接溶解或透析方法制备），浓度>15mg/ml或者更高，浓度越高偶联效果越好。 2、用5倍以上体积配体溶液悬浮抽滤漏斗里的琼脂糖固体，4度摇床缓慢振荡（不可使用磁力搅拌器），过夜后用适当缓冲液洗净即可。洗出来的配体可回收使用。 此方法适用于比较廉价的配体。 注意： 如果配体不耐高pH条件，可以用1M盐酸调节缓冲液至适合pH。 【装柱】 塑料层析柱 1、将层析柱固定，封闭层析柱下端出口，向柱内充入去离子水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。 2、先将介质混匀，打开层析柱下端出口，排出柱中去离子水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用导流棒沿内壁倒入介质或移液枪吸取介质，将介质加入到层析柱中；静置，待介质自
Ni-IDA亲和层析介质 Cat.No. L00223I 版本号: 05082017 目录 I.产品描述 (1) II.纯化步骤 (2) III.故障排除 (4) IV.订购信息 (4) I.产品描述 金斯瑞Ni-IDA亲和层析介质（产品编号L00223I）是把IDA（亚氨基二乙酸）共价偶联到4 %交联的琼脂糖介质上，再通过IDA的3个结合位点螯合Ni2+制备而成，并提供了三个离子键结合部位高亲和地纯化含有多聚组氨酸标签的重组蛋白。金斯瑞 Ni-IDA亲和层析介质的Ni2+脱落程度很低，并具有高吸附量及高稳定性，在多聚组氨酸标签的重组蛋白的纯化实验中有非常好的表现力，具体特性见表1。 表1. Ni-IDA亲和层析介质的特性 柱体积10 ml 动态吸附量20 mg 6×His 标签蛋白（27 kD）/ml介质 球形基质 4 %交联度琼脂糖 平均粒径90 μm （45-165 μm） 储存溶剂1× PBS（含20%乙醇） 储存&稳定性2-8 ℃储存18个月 1
天然条件下纯化多聚组氨酸标签蛋白 1.缓冲液配制 用于配制缓冲液的水和化学试剂必须是高纯度的，并建议使用前用0.45 μm滤膜过滤一遍。 平衡缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，用NaOH调pH 为8.0 洗涤缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM咪唑，用NaOH调pH 为8 洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM咪唑，用NaOH调pH 为 8.0 2. 样品制备 A 大肠杆菌系统或酵母胞质系统表达蛋白 （1）在4 ℃条件下用50 ml离心管离心收集细胞； （2）用8 ml平衡缓冲液重悬细胞，可以加入适量的PMSF或其他蛋白酶抑制剂； 注意：加入的抑制剂不能对Ni-IDA亲和层析介质的性能有影响，破碎液中不能含有 EDTA、EGTA等螯合剂，DTT、巯基乙醇等还原剂，尿素、盐酸胍等变性剂。 （3）超声破碎细胞，在冰上进行操作，破碎1秒，冷却3秒，总时间为30-45 分钟； 可选：如果裂解物太粘稠，可以加入RNase A （终浓度10 μg/ml）和DNase I （终浓度5 μg/ml）并在冰上孵育10-15分钟。 （4）4 ℃，1,2000 rpm离心裂解液以沉淀细胞碎片，收集上清液待过Ni-IDA亲和层析介质。 B 酵母、昆虫或者哺乳动物细胞表达系统分泌到培养基中的蛋白 （1）如果培养基上清中不含有EDTA、组氨酸或者其它还原性试剂等可能影响Ni-IDA亲和层析介质性能的话，该培养基可以直接上柱纯化，否则必须进行下面步骤； （2）上柱前将样品透析于1×PBS中； （3）对于较大体积的培养基上清，可以通过硫酸铵沉淀浓缩蛋白，用1×PBS透析溶解的蛋白，准备上样。 I柱子制备 （1）轻轻颠倒翻转瓶子几次，使介质混合均匀； （2）吸取一定量的介质加入到柱子中，让介质自由沉降，并放干储存液； （3）加入4倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析介质或者直到流出液的紫外吸光度A280值达到最低且稳定。 2
固相萃取柱空柱 逗点生物提供的固相萃取柱空柱是制作固相萃取柱的基础工具，柱体选用高纯度医疗级的聚丙烯制成，筛板选用纯净的超高分子量聚乙烯加工而成，有广泛的溶剂兼容性。 30ml和50ml空柱管可以制备Flash柱。 我们提供用于制备固相萃取柱的筛板和空萃取柱，为科研研究服务，也为生产厂家提供配套。 点击了解详细规格 固相萃取柱空柱分类 固相萃取柱空柱，包括针筒型小柱、串联柱和离心柱等。 针筒型小柱串联柱离心柱 固相萃取柱空柱构成 装柱套件一般由柱体和筛板两部分构成，特殊应用时还需要盖子和推杆。 固相萃取柱空柱装柱步骤 1、装下筛板 用装柱工具把筛板顶入柱体，再用装柱工具把筛板推到柱体底部。 2、加装填料 柱体垂直，将长颈漏斗置入柱体中，在漏斗中加入所需填料，轻轻提起漏斗，轻敲使填料上表面平齐。 注意：① 长颈漏斗的颈要有足够的长度，最好能基本接近下筛板；② 漏斗提起时应避免填料粘在柱体内壁上。 3、装上筛板 保持柱体垂直，用装柱工具把筛板顶入柱体，再用装柱工具把筛板推到填料上表面。 注意：当填料上表面和上筛板之间还有空隙时，垂直状态轻敲柱体，再次用装柱工具把筛板推到适当位置。 产品选购指南 点击查看大图
亲和层析柱空柱 点击查看原图 产品/服务：其它实验耗材 品牌：biocomma 型号：1ml,3ml,6ml,10ml，30ml,50ml 规格：1ml,3ml,6ml,10ml，30ml,50ml 单价： 最小起订量： 供货总量： 发货期限：自买家付款之日起 3 天内发货
有效期至： 2011-06-28 最后更新： 2010-09-19 浏览次数： 129 产品详细说明 亲和层析柱解决方案 亲和层析柱用筛板 逗点生物提供的亲和层析柱用筛板是选用纯净的超高分子量聚乙烯为原料，经独特的工艺加工而成。 高分子聚乙烯能耐受酸碱和一般的有机溶剂，对大部分的生物分子不会产生吸附，是固相萃取柱、亲和层析柱筛板最常使用的材料。 亲和层析柱空柱 亲和层析柱空柱管由医疗级的聚丙烯制成，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱管容量为3ml 、6ml 、10ml 、30ml 、50ml 。 亲和层析柱空柱 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。 如抗原和抗体，蛋白质A 与-些抗体，重组蛋白质和一些金属离子之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可相互解离。 当把可结合的一对分子的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。 亲和层析柱空柱概述 逗点生物提供的亲和层析柱空柱是专门为实验室小批量纯化抗体、重组蛋白或其它分子而设计，方便进一步进行科学研究。 亲和层析柱空柱所用的柱子为聚丙烯塑料，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWMPE 为原料，经独特的工艺加工而成，具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端，以阻挡昂贵的基质渗出。 亲水性筛板采用了逗点生物领先的亲水性UHWMPE 生产技术，该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时，该筛板和其它供应商相比，不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外，该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡，气泡会使流速降低， 液体通过基质不均匀。 亲和层析柱空柱可配套针筒注射器、装柱推杆和联接管，方便柱子的装填并和蠕动泵等设备配套使用。 亲和层析柱空柱用于抗体纯化 金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A,SPA)能与人及多种哺乳动物血清IgG 分子中的Fc 片段结合，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛。 SPA 除与IgG 结合外，还能与血清中少量的IgM 和IgA 结合，SPA 菌对各类免疫球蛋白的吸附率：IgG 为90%～98%，IgM 为2%～30%，IgA 为1.5%～20%。 纯化抗体一般用Protein A 作为纯化的配体，也可以用Protein G,Protein L 或异源性抗体作为配体。 点击查看大图
Flag标签亲和层析介质 Anti-flag Affinity Beads 货号规格 BDTL0045-11ml BDTL0045-55ml 1.产品介绍 Flag标签是一个由八个亲水氨基酸组成的多肽片段，定位在融合蛋白表面，因此更易与抗体结合以及被肠激酶分解。Anti-flag Affinity Beads是以抗flag(DYKDDDDK)抗体为亲和配体，一步纯化原核、酵母或哺乳动物细胞表达的flag标签融合蛋白。Anti-flag Affinity Beads 以4%琼脂糖凝胶为基质，杂蛋白非特异性结合少，可用于flag标签融合蛋白的纯化和免疫沉淀（IP）。 表1.Anti-flag Affinity Beads产品性能 项目性能 基质4%琼脂糖微球 配体Anti-flag鼠单克隆抗体 载量>1mg flag标签蛋白/ml介质 粒径(μm)45-165 最大流速0.1MPa,1bar 储存缓冲液0.02%叠氮化钠，1XPBS 储存温度2°C-8°C 2.试剂准备 2.1缓冲液的准备 所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。 平衡和洗杂液:50mM Tris,0.15M NaCl,pH7.4 洗脱液:0.1M glycine HCl,pH3.5 竞争性洗脱液：50mM Tris,0.15M NaCl,100-500ug flag多肽/ml，pH7.4 中和液：1M Tris-HCl，pH8.0 再生液1：0.1M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.0 -1-
再生液2：0.1M NaAc,0.5M NaCl,pH4.0 2.2样品准备 上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。 样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。 3.样品纯化 3.1柱层析 1.将Anti-flag Affinity Beads装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的平衡液进行平衡， 使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。 2.将样品加到平衡好的Anti-flag Affinity Beads中，收集流出液，可以反复上样增加结合 效率。 3.用10倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。 4.A酸性洗脱：使用5倍柱体积的洗脱液0.1M glycine HCl,pH3.5，收集管中预先加好 中和液15-25μl中和液/ml洗脱液，分管收集。注：酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，Anti-flag Affinity Beads在洗脱液中不要超过20min。 B竞争性洗脱：使用5倍柱体积的竞争性洗脱液flag多肽100μg/ml洗脱。 5.使用3倍柱体积的洗脱液再生，然后用平衡液平衡至中性 6.然后保存在含0.02%叠氮化钠的PBS溶液中，2-8度保存。 3.2静态吸附 1.填料准备：取适量的Anti-flag Affinity Beads加入层析柱中，流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。 2.加入样品溶液，4度或室温震荡孵育至少30min(不能磁力搅拌)，确保填料与样品溶液充分混合。 3.孵育完毕后，将填料混合液离心（1000x g离心5min）或过滤收集填料。 4.将填料装入层析柱中，用平衡液清洗直至紫外稳定。 5.用酸性洗脱液或竞争性洗脱液洗脱，参考3.1中4.。 6.填料再生和保存参考3.1中5.和6.。 3.3免疫共沉淀操作流程 1.填料准备：取40μl的Anti-flag Affinity Beads(柱体积20μl)混合液加入到2ml离心管中，5000Xg离心30秒，吸弃上清。 2.填料加入0.5ml平衡液，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到 -2-
推荐 3.3.6 离子交换层析的应用 离子交换层析的应用范围很广，主要有以下几个方面。 1. 水处理 离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法，聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。纯水的制备可以用蒸馏的方法，但要消耗大量的能源，而且制备量小、速度慢，也得不到高纯度。用离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。一般是将水依次通过H+型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过OH-型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。 2. 分离纯化小分子物质 离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH 2~3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的的离子强度和pH，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。目前已有全部自动的氨基酸分析仪。 3. 分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。 3.4 亲和层析 3.4.1 简介 亲和层析（Affinity Chromatography）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆的结合，可以用于对生物分子的分离纯化。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，
免疫亲和层析技术 原理、目的、仪器、方法、步骤、结果、讨论、体会 一、实验背景 亲和层析技术是纯化各种生物大分子的有效方法。最初是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和层析，根据抗原抗体结合后形成大量多聚体和不溶性基质原理来收集抗原。随后，利用抗体与惰性微珠共价交联,虽然这种反应是一种简单的结合，但抗体的活性因交联缺乏定位作用或抗体的过量交联而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A或蛋白G微珠共价交联后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性，且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱，已成为一种实用和有效的纯化方法。 免疫亲合层析具有以下特点：①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性,能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原；②不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠；③可按照不同规模进行，半天内即可完成，而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果；④经过简单的改进，免疫亲和层析法也可用于纯化针对抗原的特异性抗体。 免疫亲和层析是一种既简单又非常有效的分离抗原的技术。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上，然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后，通过洗涤去除无关的抗原，然后用洗脱缓冲液处理微珠，结合的抗原被洗脱，从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件掌握较好而且比较温和，纯化的抗原仍能保持其天然状态。虽然下述的所有实例都是以蛋白质抗原作为研究对象，但凡是能与抗体有效结合的分子都能用这种方法进行纯化。 只需简单地改变操作程序，免疫亲和层析法同样也可以用来分离经过初步纯化的抗体。此时抗原和抗体所起的作用正好相反，抗原共价交联在微珠上，再与抗体结合，然后通过洗脱，得到纯化的抗体。 在条件合适的情况下，应用免疫亲和层析法通常只需一次就可以达到1000~10000倍的纯化效果。使用性能特别优良的抗体，并且掌握好洗脱条件，也可以达到10000倍以上的纯化效果。 二、实验原理 亲和层析是吸附层析技术的一种。它是近十多年来迅速发展并被广泛用于分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法，具有分离速度快、纯化效率高等优点；尤其适合于含量少、杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子。亲和层析的主要依据是生物分子与其特定的固相化的配基或者配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。生物分子的理化特性使其可以与某些分子发生可逆的特异性结合（如分子间通过氢键等次级键结合，但条件改变后即可分离）的特性。 本实验利用抗原/抗体和相应的抗体/抗原可以发生特异性的结合，而这种结合在一定的条件下可逆的性质将牛血清白蛋白（BSA，抗原）固相化后，使存在于液相中的抗体选择性地结合到固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分离，以此来达到分离纯化抗体的目的。实验所用载体为葡聚糖凝胶，所用交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油。其原理如图所示：
亲和层析 亲和层析原理 生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。 亲和层析的应用 点击次数：692 发表于：2008-08-28 21:05转载请注明来自丁香园 来源：互联网 亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。 1.抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。 另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。 2.生物素和亲和素 生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如
第5章亲和层析 一、亲和层析的特点：①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。 二、基本原理：生物大分子的识别功能：①酶：底物、抑制剂底物类物；②抗体：抗原、病毒细胞； ③激素：受体；④外源凝集素：糖蛋白、表面受体蛋白；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白。 1 配基：亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主要有以下几类：①有机小分子类主要有苯基类、烷基类、氨基酸类、核苷酸类等。②生物大分子类主要有酶类、抑制剂类、蛋白质、抗原抗体类等。③染料主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等。 2 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。 3 活化剂：（最常用的几种活化剂）溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、1，4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐等。 三、亲和层析介质的制备： 1 配基的选择（配基必备条件）：①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影响配基和目标分子的专一结合特性。②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸附，且不破坏目标分子的生物活性。④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。常用的配基：①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属离子等）；②抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋白、载体蛋白；③外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；④核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合蛋白。 2 载体的选择（理想载体的特性）：①不溶于水，但具有高度亲水性。②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。③机械性能良好，在一定静水压下不变形。④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。⑤化学惰性，无或微弱的非特异性吸附作用。⑥有良好的物理和化学的稳定性。常用的载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。凝胶类载体的特点：①凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化，引入不同的基团。②具有大孔性和亲水性，凝胶内部的羟基得到活化，有较高的活化效率。③刚性较好，珠状结构对流动向的阻力最小，分离效率高。 ④非特异吸附极低，理化性质较稳定。 理化性质稳定性的要求：①在较广的pH范围内正常工作；②对去污剂、解离试剂保持稳定；③用0.1mol ／L NaOH或0.1mol／L HCl处理2～3h不引起凝胶颗粒的变化；④不被乙醇、丙酮等有机试剂所破坏；⑤能耐受6mol／L盐酸胍或7 mol／L尿素处理；⑥吸附剂能够再生并重复使用。 3 活化剂的选择与偶联反应：（1）以生物大分子为配基的偶联反应： ①溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应 ②环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应 （2）活化载体“接臂”： ①短臂(未接臂)亲和介质 ②长臂(接臂)亲和介质 4 封闭：①在弱碱性pH下过夜或在Tris—HCl缓冲液(pH8)中2h被水解。②加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团。③封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露糖等。 5 亲和介质的技术指标：①配基偶联量(μmol／g 或μmol／ml)。②样品吸附量(mg／s或mg／ml)。 ③化学稳定性抗氧化物，配基不降解。④耐酸碱如pH3～10。 三、亲和层析实验操作：（1）亲和层析实验流程：亲和层析介质——预处理——装柱、平衡与上样品
免疫亲和层析技术 Prepared on 24 November 2020
免疫亲和层析技术 原理、目的、仪器、方法、步骤、结果、讨论、体会 一、实验背景 亲和层析技术是纯化各种生物大分子的有效方法。最初是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和层析，根据抗原抗体结合后形成大量多聚体和不溶性基质原理来收集抗原。随后，利用抗体与惰性微珠共价交联,虽然这种反应是一种简单的结合，但抗体的活性因交联缺乏定位作用或抗体的过量交联而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A或蛋白G微珠共价交联后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性，且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱，已成为一种实用和有效的纯化方法。 免疫亲合层析具有以下特点：①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性,能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原；②不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠；③可按照不同规模进行，半天内即可完成，而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果；④经过简单的改进，免疫亲和层析法也可用于纯化针对抗原的特异性抗体。 免疫亲和层析是一种既简单又非常有效的分离抗原的技术。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上，然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后，通过洗涤去除无关的抗原，然后用洗脱缓冲液处理微珠，结合的抗原被洗脱，从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件掌握较好而且比较温和，纯化的抗原仍能保持其天然状态。虽然下述的所有实例都是以蛋白质抗原作为研究对象，但凡是能与抗体有效
结合的分子都能用这种方法进行纯化。 只需简单地改变操作程序，免疫亲和层析法同样也可以用来分离经过初步纯化的抗体。此时抗原和抗体所起的作用正好相反，抗原共价交联在微珠上，再与抗体结合，然后通过洗脱，得到纯化的抗体。 在条件合适的情况下，应用免疫亲和层析法通常只需一次就可以达到1000~10000倍的纯化效果。使用性能特别优良的抗体，并且掌握好洗脱条件，也可以达到10000倍以上的纯化效果。 二、实验原理 亲和层析是吸附层析技术的一种。它是近十多年来迅速发展并被广泛用于分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法，具有分离速度快、纯化效率高等优点；尤其适合于含量少、杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子。亲和层析的主要依据是生物分子与其特定的固相化的配基或者配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。生物分子的理化特性使其可以与某些分子发生可逆的特异性结合（如分子间通过氢键等次级键结合，但条件改变后即可分离）的特性。 本实验利用抗原/抗体和相应的抗体/抗原可以发生特异性的结合，而这种结合在一定的条件下可逆的性质将牛血清白蛋白（BSA，抗原）固相化后，使存在于液相中的抗体选择性地结合到固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分离，以此来达到分离纯化抗体的目的。实验所用载体为葡聚糖凝胶，所用交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油。其原理如图所示： 图1. 免疫亲和层析原理图 三、实验目的