金属螯合层析介质（征求意见稿） 编制说明 《金属螯合层析介质》 国家标准起草工作小组 二〇一九年一月
《金属螯合层析介质》国家标准 编制说明 （征求意见稿） 一、任务来源 本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会专项《国家质量基础的共性技术研究与应用》项目《生物产业共性技术标准研究》中课题《海洋生物产品质量控制与检测技术标准研究》，项目编号“2016YFF0202304”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。本标准起草工作组由中国科学院过程工程研究所等单位共同组成。 二、目的和意义 金属螯合层析是近40年来出现的一种亲和层析技术，也称固定化金属离子亲和层析。它于1975年首先被Porath和他的合作者们成功用于分离纯化人血清蛋白，并在此后的三十年里迅速发展。该法利用蛋白质表面的某些氨基酸和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质分离。高流速琼脂糖金属螯合层析介质是将亚氨基二乙酸（IDA）、次氮基三乙酸（NTA）等配基键合在高流速琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+（或其它金属离子）而形成的一种亲和层析介质[1]（图1）。该类层析介质具有吸附容量大、选择性好、分辨率高、易于再生以及成本较低等优点，在标签蛋白等生物大分子纯化领域具有极为广泛的应用。 图1 金属螯合层析介质（IDA）结构示意图（X可以是H2O、缓冲液中离子以及蛋白配体等） 目前国内外已有多家企业进行金属螯合层析介质的生产，由于缺乏相应的国家标准，金属螯合层析介质的性能要求没有统一标准，从而对其应用造成很大困
扰，严重阻碍该类介质和层析技术的应用发展水平，对我国生物产业产生不利影响。以金属螯合层析介质的载量测定方法为例，一种方法是将介质装柱并连在层析仪上，平衡后经含有His-乳酸脱氢酶的样品上样，上样结束后，依次经淋洗和洗脱，收集洗脱液，根据洗脱液中蛋白含量计算洗脱载量；另一种方法是用纯His-乳酸脱氢酶上样，依次经平衡和洗脱，收集洗脱液，根据洗脱液蛋白含量计算洗脱载量。这两种方法测定同一介质样品得到的结果具有明显差异。类似问题也出现在其他的参数测定上。因此建立关于金属螯合层析介质的国家标准具有重要意义。在此基础上，通过标准化工作提高介质及相关技术发展水平，促使我国相关产业在国际贸易方面取得话语权，推动我国层析介质及相关产业在国际上占有一席之地。 三、标准制定原则 （一）标准编制原则 金属螯合介质属于生物体系分离材料，重点围绕介质的主要性能要求，设定相应技术内容。在确保产品质量的基础上，充分体现产品的特点。 （二）标准制订主要依据 1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的有关要求。 2、标准编写内容参考我国与化学品相关的法规、标准，包括GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备、GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备等等。 四、标准主要技术内容 （一）标准适用范围的说明 本标准规定了金属螯合层析介质的质量要求、检测方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存的标准。 本标准适用于骨架为琼脂糖微球的金属螯合层析介质的生产与检测。 （二）内容提要 金属螯合层析介质的主要理化性质包括外观、粒径、流速、配基密度、动态载量、微生物污染和化学稳定性等。
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书 一、简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 二、性能参数： 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体 Ni2+ 配体密度20-40μmol /ml 吸附载量15mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速600cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 三、适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、应用实例 实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白 实验步骤： 1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为 1ml/min；
实验十一金属螯合亲和层析分离蛋白质 【实验目的】 1．学习亲和层析的原理。 2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。 【实验原理】 亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL 2. 2mol/L NaCL 溶液50mL 3. 1mol/L NaOH溶液50mL 4. 0.2mol/L NiSO4溶液50mL 5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL 6. Ni2＋Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL 7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品20—50ml 8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0 9. 洗脱液：300mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0 10 20%乙醇溶液50ml 〈二〉器材 1. 1.5cm X 50cm层析柱 2. 蠕动泵 3. 紫外检测仪 4. 自动收集器 5. 伍豪色谱工作站 【操作方法】 1. 样品的制备 细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。然后8000r/min。离心30min，取上清液。放冰箱备用。 2. 亲和层析柱的安装
金属螯合亲和层析技术及其应用 摘要:固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。 关键词:固定化金属螯合亲和层析;纯化;应用 固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一种亲和纯化技术,它是由Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。该法是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化。它因配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点而被广泛应用。随着研究的进一步深入,IMAC的新应用也不断地被发现。 1金属螯合亲和层析作用原理 固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点,在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时,氨基酸残基的供电原子将取代与金属离子结合的水分子或阴离子,与金属离子形成复合物,从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化[2]。 2金属螯合亲和层析技术的应用 2.1金属螯合亲和层析用于生物分离纯化 IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)结合力强,蛋白结合容量大,可用于工业生产,如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细
镍离子金属鳌合亲和层析介质使用说明 简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 性能参数 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体Ni2+ 配体密度10-15μmol/ml 吸附载量20-40mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速150cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。 应用实例 实验名称：Ni-亲和介质分离带His标签的重组蛋白
实验步骤： 1、Ni-亲和介质装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min； 4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min； 5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度； 6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存。 缓冲液组成： 缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH 2 PO 4 19ml，0.5M Na 2 HPO 4 81ml，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。 缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH 2 PO 4 19ml， 0.5M Na 2 HPO 4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g,加适量，水调pH后定容到1000ml。 缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制： 咪唑浓度缓冲液1量(ml) 缓冲液2量(ml) 10mM 98220mM 96450mM 9010100mM 8020200mM 6040300mM 4060400mM 20 80 SDS-PAGE流程： 1、BCA法测量样品蛋白浓度
金属螯合预装柱（5ml）说明书 1. 简介 金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC）。该法利用蛋白质表面的某些氨基酸（如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等）和金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+等过渡金属离子）发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质的分离。琼脂糖金属螯合介质（Ni-IDA QZT 6FF）是将亚氨基二乙酸（IDA）键合在高流速、高强度的琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+而形成的一种亲和层析介质，广泛用于蛋白质、核酸及多肽，尤其是组氨酸标签蛋白质的分离纯化。 2. 产品概述 金属螯合预装柱预装了5 ml的Ni-IDA QZT 6FF亲和介质，可直接用于组氨酸标签蛋白质等生物分子的分离纯化，具有使用方便、操作简单、分离纯化效率高的特点。 Ni-IDA QZT 6FF亲和介质具有良好的稳定性、生物相容性和溶剂相容性，这不仅有利于保持产品的生物活性和提高产品的收率，还有利于扩大层析操作条件的选择范围。Ni-IDA QZT 6FF亲和介质的理化性质和溶剂相容性分别如表1和表2所示。 表1. Ni-IDA QZT 6FF预装柱的理化性质及特征参数 参数指标 基质6%交联琼脂糖凝胶 配基-N(CH2COOH)2 (IDA) 形状球形 平均粒径90 μm (45~165) 金属离子密度~40 μmol Zn2+/ml wet gel 动态载量a~25-30 mg蛋白(LDH)/ml wet gel 柱体积1ml或5ml 柱尺寸（内径x高度）0.9*1.57 cm (1ml柱子) 0.9*1.57 cm (5ml柱子) 推荐流速b1ml/min (1ml柱子)或5ml/min (5ml柱子) 地址：北京市海淀区中关村北二条1号中国科学院过程工程研究所
收稿日期:2009-03-23;修回日期:2009-04-27 作者简介:李耀军,男,博士生,研究方向蛋白质组学,E 2mail:yaojunxh@1631com; 通讯作者:郑德先,男,教授,博士,研究方向分子生物学与生物化学,E -mail:zhengdx@pumc 1edu 1cn 。 基金项目:国家自然科学基金(No 130623009、30721063);国家重点基础研究项目特别基金(No 12007CB507404)资助项目 doi ∶1013969/j 1issn 11008-9632120101011001 固化金属离子亲和层析富集磷酸化 多肽方法的选择及优化 李耀军1 ,罗元明2 ,武淑珍1 ,高友鹤1 ,刘彦信1 ,郑德先 1 (11中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院,北京100005; 21中国科学院微生物研究所,北京100101) 摘 要:在磷酸化蛋白质组学研究中,根据是否需要对待富集样品进行甲酯化处理,可将固化金属离子亲和层析(I M AC )方法分为两类,即需要甲酯化处理的I M AC 方法(ME 2I M AC )和不需要甲酯化处理的I M AC 方法(Non 2M E 2 I M AC )。要实现对磷酸化多肽的有效富集和鉴定,就必须对富集方法进行选择和优化。利用基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱(MALD I 2T OF 2MS )对两种方法富集的磷酸化多肽进行了比较研究。结果表明,M E 2I M AC 方法容易发生样品丢失,质谱结果的分析也比较复杂,而Non 2ME 2I M AC 方法则不仅操作简单而且富集效果理想。另外,优化了Non 2M E 2I M AC 方法的实验条件,指出最佳的结合溶液是8%ACN /013%TF A,最佳的洗脱溶液是011mol/L E DT A (pH 值810),从而建立了一套完整而简单有效的磷酸化多肽富集方法。关键词:磷酸化多肽;甲酯化反应;固化的金属离子亲和层析;质谱中图分类号:Q331 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2010)01-0001-04 M ethod for selecti on and opti m i zati on of phosphopepti de enr i ch ment by i m mobili zed 2met al i on affi n ity chro matography L I Yao 2jun 1 ,LUO Yuan 2m ing 2 ,WU Shu 2zhen 1 , G AO You 2he 1,L I U Yan 2xin 1,ZHENG De 2xian 1 (1.Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College,Beijing 100005; 2.I nstitute of M icr obi ol ogy,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China ) Abstract:I n phos phop r oteom ics,according t o whether the sa mp le treated with methyl esterificati on (ME )necessarily or not,i m mobi 2lized 2metal i on affinity chr omat ography (I M AC )can be divided int o t w o kinds,M E 2I M AC and Non 2M E 2I M AC 1I n order t o find out bet 2ter one of the m,they were compared byMALD I 2T OF 2MS 1The results firstly showed thatME 2I M AC method could cause ads or p tive l os 2ses easily and comp licate the MS analysis and data inter p retati on;in contrast,Non 2ME 2I M AC method was a si m p ler and more efficient strategy f or phos phopep tide enrich ment 1I n additi on,the op ti m izati on of experi m ental conditi ons of Non 2M E 2I M AC showed that the best binding buffer was 8%ACN /013%TF A and the best eluting buffer was 011mol/L E DT A (pH 810)1The Non 2M E 2I M AC method re 2ported here is a good reference t o more and more researchers in phos phop r oteom ics 1 Keywords:phos phopep tide;methyl esterificati on;i m mobilized 2metal 2i on affinity chr omat ography;mass s pectr ometry 固化金属离子亲和层析(i mmobilized 2metal i on af 2finity chr omatography,I M AC )作为一种快速、简单易用和经济的纯化技术,近年来被研究者广泛应用于磷酸化多肽的富集[1-4] 。该方法的关键就是要降低带酸性氨基酸(谷氨酸和天门冬氨酸)的非磷酸化多肽在 I M AC 柱上的非特异性吸附[4]。Ficarr o 等[1] 通过对提 1
镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用 摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。 关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化 亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。 I、镍离子亲和层析柱的制备工艺 1、Ni2+吸附融合蛋白原理 Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。 2、固相载体的选择 常见的固相载体包括为普通琼脂糖颗粒及GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品。普通的琼脂糖颗粒具有造价低，但结合蛋白不稳定，易造成镍离子脱落的重大缺点。而GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品采用交联琼脂糖，具有高吸附力、高化学物理稳定性、快流速、强抗压力等特点，因此十分适合作为亲和层析柱中的固相载