文章编号: 1000-1336(2011)02-0238-06
白细胞弹性蛋白酶抑制剂
胡显腾 宋 歌 孔令超 刘小宇
第二军医大学生物化学与分子生物学教研室，上海 200433
摘要：人白细胞弹性蛋白酶广泛参与体内的组织损伤反应，与炎症反应、自身免疫、肿瘤形成和转移等有密切关系。目前人白细胞弹性蛋白酶抑制剂已成为新药开发的热点，具有很高的应用价值，其中西维来司钠已经成功进入市场。本文对近几年发现的人白细胞弹性蛋白酶抑制剂的结构及其作用进行综述。关键词：人白细胞弹性蛋白酶；抑制剂；西维来司钠中图分类号：Q71；Q74
收稿日期：2010-07-12
第二军医大学大学生创新能力培养计划基金项目(MS2009029)资助
作者简介：胡显腾(1987-)，男，本科生，E-mail: thefalling snow@https://www.doczj.com/doc/6c531346.html, ；宋歌(1988-)，男，本科生，E-mail ：sganthem @https://www.doczj.com/doc/6c531346.html, ；孔令超(1988-)，男，本科生，E-mail ：790215986@https://www.doczj.com/doc/6c531346.html, ；刘小宇(1971-)，女，硕士，副教授，通讯作者，E-mail ：liuxiaoyu8888@https://www.doczj.com/doc/6c531346.html,
人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase, HLE)，是多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMNL)因受炎症刺激而释放出的一种破坏性丝氨酸蛋白酶[1]，其功能酶包含218个氨基酸残基，构成两个β-桶状(β-barrel)结构域，由4个二硫键维持稳定[2]，定位于多形核白细胞嗜苯胺蓝颗粒中，可以水解纤连蛋白、胶原、软骨等组织连接成分[3]。细胞因子、内毒素、血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)和甲酰甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine, fMLP)可激活HLE 的释放[4]，同时，HLE 的作用也受某些内源性抑制因子，如α1蛋白酶抑制剂、α2-巨球蛋白和HLE 抑制因子的调控[5]。弹性蛋白酶与其生理性抑制剂之间的平衡被破坏，可导致严重的组织损伤，并与多种疾病，如肺气肿、慢性阻塞性肺病、急性肺损伤、囊性纤维病、癌症、动脉粥样硬化、脓血症、胰腺炎和类风湿关节炎等的发生和发展有密切的联系[6,7]。因此，弹性蛋白酶抑制剂具有潜在的治疗上述疾病的价值。在我国爆发严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)期间，西维来司钠(sivelestat sodium hydrate)作为一种选择性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制
剂，成为第一种被国家食品药品监督管理局(SFDA)批准进入临床试验的抗非典药物[8]。
鉴于SARS 的严重性及西维来司钠的成功，近些年来，世界各国又开始了新一轮的寻找新型HLE 抑制剂的研究，以对抗HLE 过度释放所造成的组织损害。目前报道的HLE 抑制剂主要是从动植物、微生物中分离得到以及通过化学合成的方法得到。本文就HLE 抑制剂的研究进展综述如下。1. 小分子抑制剂1.1 F01-221A
F01-221A 是从来源于云南、新疆等地土壤中的真菌菌株中分离得到的单体化合物。F01-221A 为白色粉末，易溶于甲醇、乙腈、丙酮、氯仿。ESI-MS 的测定结果显示该化合物的相对分子质量为373。经结构鉴定发现其化学结构与已知化合物伊快霉素(eq-uisetin)相同，化学结构见图1。其对HLE 的抑制作用呈现出剂量依赖型，IC 50值为22.1 μM [9] 。
图1 F01-221A 的化学结构式[9]
1.2 大黄素甲醚
F02ZA-2554A是从微生物菌种库菌株的次生代谢产物中分离得到的一种化合物，经结构鉴定，确定该化合物为蒽醌类的大黄素甲醚，化学结构见图2。其对HLE的抑制作用也呈剂量依赖性，IC50为32.4 μM，具有中等的抑制活性[10]。
1.3 NO1WA-735E
NO1WA-735E是从来源于云南土壤中的放线菌菌株代谢产物中分离得到的单体化合物，该化合物为淡黄色结晶，分子式为C34H34O14S，其化学结构(图3)与已报道的化合物BE-52440A相同[11]。通过HLE抑制模型筛选，该化合物显示出较强的抑制活性，IC50值为11.5 μM[1]。目前该化合物已能通过全合成的方式进行大量生产[12]。
1.4 PL3S
PL3S[16-hydroxycleroda-3,13(14)E-dien-15-oic acid]是一种克罗烷二萜类化合物，分离自formosan Polyalthia longifolia var. pendula，其结构式见图4。Chang等[13]的实验结果表明PL3S可抑制由fMLP(N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine)或细胞松弛素B 介导中性粒细胞释放的HLE，且具有一定的浓度依赖性，其IC50值为(3.30 ± 0.48) μM。
1.5 鼠尾草酸和鼠尾草酚
鼠尾草酸(carnosic acid, CA)和鼠尾草酚(carnosol, CS)属于酚二萜类，存在于唇形科植物如迷迭香属和欧鼠尾草类植物中，其化学结构式见图5和图6。Po-eckel等[14]研究表明，CA和CS能够有效抑制HLE的分泌，其抑制作用呈现浓度依赖性，CS的作用效果强于CA，CA的IC50为 15 μM~20 μM，CS的IC50为7 μM。二者的作用机理可能与其抑制fMLP从而减少PMNL 释放HLE有关。其在体内抗炎效果还有待进一步的实验进行验证。
1.6 环烯醚萜苷类化合物
白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)
是一年生草本植
物，生长于亚洲东北部，是东方医学中治疗肝炎、
扁桃体炎等疾病的药物。Xu等[3]从中分离得到五种环
烯醚萜苷类化合物，分别是反式
-6-氧-对甲氧基肉桂
酰基鸡屎藤苷甲酯(E-6-O-p-methoxycinnamoyl scan-
图2 F02ZA-2554A的化学结构式[10]
图
3 NO1WA-735E的化学结构式[1]
图4 PL3S的化学结构式[13]
图5 CA的化学结构式[14]
doside methyl ester)(1)、顺式-6-氧-对甲氧基肉桂酰鸡屎藤苷甲酯(Z-6-O-p-methoxycinnamoyl scandoside methyl ester)(2)、反-6-氧-阿魏酸鸡屎藤苷甲酯(E-6-O-p-feruloyl scandoside methyl ester)(3)、反-6-氧-对-香豆素鸡屎藤苷甲酯(E-6-O-p-coumaroyl scandoside methyl ester)(4)和顺-6-氧-对-香豆素鸡屎藤苷甲酯(Z-6-O-p-coumaroyl scandoside methyl ester)(5)，化学结
构式见图7和图8。五种化合物都具有一定的抑制HLE 的能力，其中化合物(1)具有较强抑制活性，IC 50 值为18.0 μM ，其余四种化合物的IC 50值均大于100 μM 。分子结构模型分析表明，化合物(1)与HLE 之间的相互作用主要通过与HLE 的Cys42、His57、Ser195和 Arg177之间的氢键以及与其Leu99B ，Phe215和Val216之间的范德华力发挥作用(图9)。五种化合物的构效分析表明，化合物(1)苯环上的对位甲氧基与HLE 的Arg177侧链氮原子所构成的氢键，可能在化合物(1)与HLE 结合过程中发挥着重要作用。1.7 3, 4, 5-三羟基冰片基肉桂酸酯
3,4,5-冰片基咖啡酸是首先从Verbesina turbacen-sis Kunth 分离出冰片基咖啡酸，然后通过配体对接和MMPBSA 计算后所优化合成的一种化合物(化学结构式见图10)。实验结果表明3, 4, 5-三羟基冰片基肉桂酸酯对HLE
抑制作用的IC 50值为0.54 μM
，其作用效果
图6 CS
的化学结构式[14]
图7
反式鸡屎藤苷甲酯衍生物的结构式[3]图8 顺式鸡屎藤苷甲酯衍生物的结构式[3]
图9 HLE 与化合物(1)相互作用模式[3]
强于冰片基咖啡酸(IC50=1.56 μM)。值得注意的是，3, 4, 5-三羟基冰片基肉桂酸酯没有邻苯二酚基，但存在邻二羟基官能基团，而邻二羟基被认为是与HLE结
合的特征性结构。根据以上结果，Steinbrecher等[2]认
为，分子结构中具有较多游离羟基可提高化合物与HLE的亲和力。
1.8 AE-3763
AE-3763也是通过结构预测后优化合成的一种化合物。Inoue等[5]发现，氨基末端具有苯环和酰胺键的肽类抑制剂对HLE有更强的抑制活性，但此类化合物的水溶性较差。研究者将母体化合物氨基末端的芳香环用不同的脂肪族杂环进行替换，然后根据这些脂肪族杂环具有5元或6元环酰胺亲水性基团的特性，再通过对亲水性和亲和力大小的优化，筛选到一个具有高亲水性的HLE抑制剂 AE-3763(化学结构式见图11)，其对HLE抑制作用的IC50值为29 nM。AE-3763在脂多糖(LPS)介导的肺损伤和D-氨基半乳糖介导的休克动物模型中均有显著抗HLE作用，且具有剂量小的优点。
1.9 半合成低分子量硫酸化肝素
肝素是糖胺聚糖家族中的一员，低分子量肝素
广泛用于临床抗凝血。研究发现，肝素和其它糖胺聚
糖家族成员既可以直接与HLE结合抑制其活性，也可
以通过活化内源性HLE抑制剂而发挥其抑制作用[15]。Sissi等[16]将单一的低分子量超硫酸化的肝素去硫酸化，研究肝素与HLE和组织蛋白酶G(CatG)的相互连接作用。实验结果表明肝素可与HLE或CatG结合并表现出一种非竞争性抑制作用，但与肝素硫酸化程度无关。作者认为，在肝素的作用机理上，还有几个问题有待研究，比如，糖链上硫酸基的位置、糖链的构象、整个分子的流动性、非电荷的相互作用等。
1.10 西维来司钠
西维来司钠是由日本小野制药公司开发的一种特异性的合成低分子HLE抑制剂(图12)，用于治疗伴有全身性炎症反应综合征(SIRS)的急性肺损伤，其相对分子质量为528.51，HLE的抑制常数(K i)值为46 nM，IC50值为22.8 μM。西维来司钠通过竞争性抑制HLE的作用，可减少炎症介质的产生，保护中性粒细胞的细胞骨架和可变形性[17]。Sakashita等[18]的小鼠过度通气肺损伤实验提示西维来司钠可抑制多种细胞因子，减弱中性粒细胞的趋化性和粘附性，从而减弱HLE对细胞的损伤作用；Nakano等[19]发现在小鼠肝缺血再灌注实验中西维来司钠可阻碍白细胞活化和积聚，HLE释放减少，减轻缺血再灌注损伤。
2. 大分子抑制剂
2.1 PG50
PG50提取自罗晃子树的种子，分子质量为11.6 kDa~ 14.9 kDa.，IC50值为55.96 μg/ml。PG50仅对HLE和胰蛋白酶有抑制作用，并与已知的Bowman-Birk抑制剂(一种大豆胰蛋白酶抑制剂)有相似的活性。PG50对由血小板激活因子P(Platelet activating factor, PAF) 和fMLP所诱导的弹性蛋白酶显示出不同的抑制效果，在55.96μg/m l浓度下的抑制率分别为44.6%和28.4%，提示其对PAF受体可能具有选择性[20]。
2.2 CmPI–I和CmPI–II
CmPI–I和CmPI–II是在海螺Cenchritis muricatus 的粗提物中被分离出来的HLE抑制剂，
60°C持续加
热30 分钟，仍然具有抑制活性。质谱分析法测定图10 3,4,5-三羟基冰片基肉桂酸酯的化学结构式[2]
图11 AE-3763的化学结构式[5]
CmPI-I 和CmPI-II 的分子质量分别为5576 Da 和5469 Da ，与Kazal 型蛋白酶抑制剂具有同源性。CmPI-I 和 CmPI-II 对HLE 具有较强的抑制效果，其抑制常数(K i )值分别为54.2 nM 和1.6 nM 。CmPI-I 和 CmPI-II 还能够抑制胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶的活性，但对血浆激肽释放酶和凝血酶没有抑制作用。蛋白质测序结果表明CmPI-I 和 CmPI-II 属于乙内酰苯硫脲衍生物的氨基酸类化合物。在Kazal 家族多个区域中都发现有CmPI-II 类似物，图13列出了CmPI-II 与一些经典与非经典类似Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列对比，具有32%~48%的同源性[21]。2.3 重组 Guamerin
Guamerin 是一种从水蛭(Hirudo nipponia )提取出来的由57个氨基酸残基组成的富含半胱氨酸的多肽，分子质量为6110 Da 。Guamerin 对弹性蛋白酶有很强的抑制活性，其对中性粒细胞弹性蛋白酶和胰弹性蛋白酶的抑制率分别可达86.4%和83.2%。采用基因重组技术表达的重组Guamerin 纯度可在98%以上，且在小鼠体内不引发体液免疫反应，具有一定应用前景[22]。
2.4 乌司他丁
乌司他丁(ulinastatin, UTI)是从男性尿液中分离纯化的一种尿胰蛋白酶抑制剂，应用于急(慢)性复发性胰腺炎和创伤休克、严重感染引起的急性循环衰竭的辅助抢救。谢康等[23]对34例烧伤患者血浆PMN 弹性蛋白酶、cTnI 含量和CK-MB 活性进行了相关性分析，发现严重烧伤患者血浆中PMN 弹性蛋白酶含量显著高于正常水平，而UTI 能够有效抑制PMN 弹性蛋白酶的过度释放，减轻其对心肌组织的损害。3. 结语
综上所述，目前HLE 抑制剂主要来源于天然产物和化学合成，可分为小分子物质和大分子多肽类物质，其中西维来司钠的抑制效果最佳，被广泛用作HLE 抑制剂筛选的对比剂，并已成功应用于临床。除此之外，AE-3763
最具有研究开发价值，它具有分子量小、效果好、剂量小和易改造等优点，有广阔的研究前景。虽然，目前新发现的HLE 抑制剂数量和种类都已初具规模，但从研究现状来看，实验深度
还不够，继西维来司钠之后，目前抑制剂的研究仍停留于体外或动物研究水平，如何提高抑制效果并
图12 西维来司钠的化学结构式[8]
图13 CmPI-II 与其他Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制剂N 端氨基酸序列比对结果[21]
成功应用于临床治疗是该类实验的瓶颈，还有待进一步的优化和深入研究，尤其是大分子多肽类物质，要想成功应用于人体，防止发生免疫反应是最主要的问题。而对于已上市的HLE抑制剂进行构效关系研究，加以结构改造可成为小分子抑制剂研究的捷径。我们有理由相信，在不久的将来，一定会有化学性质更稳定，作用更高效，更具有特异性的小分子抑制剂为人类的健康服务。
参 考 文 献
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Research progress of human leukocyte elastase inhibitors
HU Xianteng, SONG Ge, KONG Lingchao, LIU Xiaoyu
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Abstract Human leukocyte elastase widely participates in the tissue damage of body and plays an important role in inflammatory reactions, immunologically mediated diseases and tumor metastasis. Thus human leukocyte elastase inhibitor has become a new research hotspot of drug development. Sivelestat sodium hydrate, as a successful example, has already come into the medicine market. The structures and functions of human leukocyte elastase inhibitors founded in recent years were reviewed here.
Key words human leukocyte elastase; inhibitor; sivelestat sodium hydrate
产品名: Sivelestat sodium salt 修订日期: 6/30/2016产品说明书 化学性质 产品名: Sivelestat sodium salt Cas No.: 150374-95-1 分子量: 456.44 分子式: C20H21N2NaO7S 化学名: sodium;2-[[2-[[4-(2,2-dimethylpropanoyloxy)phenyl]sulfonylamino]b enzoyl]amino]acetate SMILES: CC(C)(C)C(=O)OC1=CC=C(C=C1)S(=O)(=O)NC2=CC=CC=C2C(=O)NCC(=O)[O-].[Na+] 溶解性: Soluble in DMSO > 10 mM 储存条件: Desiccate at RT 一般建议: For obtaining a higher solubility , please warm the tube at 37°C and shake it in the ultrasonic bath for a while.Stock solution can be stored below -20°C for several months. 运输条件: Evaluation sample solution : ship with blue ice All other available size: ship with RT , or blue ice upon request 生物活性 靶点 : Proteases 信号通路: Elastase 产品描述: Selective leukocyte elastase inhibitor (IC50 = 44 nM) that displays no activity at a range of other proteases. Inhibits NF-κB activation and LTB4-induced neutrophil transmigration in vitro. Significantly attenuates ischemia-induced spinal cord injury, decreases serum cytokine levels and reduces acute inflammatory lung injury in vivo.
2012年4月 *陕西省咸阳市永寿县县人民医院药剂科（713400） 2012年2月14日收稿 不动杆菌广泛分布于外界环境中，易在潮湿环境中生存，还可 存在于健康人皮肤、 咽部、结膜、唾液、胃肠道及阴道分泌物中。不动杆菌分为6种， 即醋酸钙不动杆菌、鲁菲不动杆菌、鲍曼不动杆菌、溶血不动杆菌、琼氏不动杆菌和约翰逊不动杆菌。鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanii ，AB ）为条件致病菌，主要引起呼吸道感染、败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。近年来，鲍曼不动杆菌感染的病例数日益增多，而随着广谱抗生素的广泛使用，该菌多重耐药现象日趋严重。通常把对常用的7种抗假单胞菌的抗生素（包括抗假单胞菌的青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、碳青霉烯类、四环素类、磺胺类）中的至少3类耐药的AB 菌株称之为多重耐药的鲍曼不动杆菌（MDR —AB ），而对上述7类抗生素全耐药的AB 菌株称之为泛耐药的鲍曼不动杆菌（PDR —AB ）。本文就鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药机制和治疗对策进行综述。1鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药机制 目前关于AB 的耐药的机制已有很多文献报道，主要集中在 产生抗菌药物的灭活酶、 外膜蛋白缺失和外膜通透性下降、基因及细胞功能突变和菌体自身存在的药物主动外排系统等。1.1产生抗菌药物的灭活酶：在A 类中超广谱β内酰胺酶的研究中发现，这类酶是对广谱头孢菌素产生耐药最主要的原因；其在鲍曼不动杆菌中也被分离到。它通常由质粒介导，可使细菌对青 霉素和第1～3代头孢菌素以及单环菌素耐药[2] 。产生氨基糖苷类钝化酶是鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因。目 前发现的钝化酶有乙酰转移酶、 核苷转移酶和磷酸转移酶[3]。1.2外膜蛋白缺失、外膜通透性下降：近年来，有关碳青酶烯类耐药的鲍曼不动杆菌报道越来越多，其耐药机制主要为产生碳青酶烯酶，外膜孔道蛋白的表达下降，青霉素结合蛋白的改变。Li －mansky 等[4]证实，由于相对分子质量为29000的外膜蛋白丢失导致AB 菌株对亚胺培南耐药。有研究显示[5]，在碳青霉烯耐药的菌 株中， 22-、33-KDaOMPs 表达缺失并产OXA-24。1.3菌体存在药物主动外排系统：药物的主动外排机制在大肠杆菌、铜绿假单孢菌、淋球菌等多种细菌中已得到了证实。国外学者证实了鲍曼不动杆菌中存在RND 类外排泵，命名为AdeABC 外 排系统[6]。该外排系统属RND 超家族， 编码主动外排泵蛋白复合体，能非特异性地将结构不同的多种抗菌药物泵出细胞外，进而 引起细菌耐药。此外， 在鲍曼不动杆菌中发现的主动外排系统还有AdeIJK 、 AdeXYZ 、AdeDE 和AbeM 等。1.4基因突变及细胞的改变：朱健铭等在研究多重耐药鲍曼不动 杆菌（MDR-ABA ） gyrA 基因突变与环丙沙星耐药的关系时发现，临床分离的MDR-ABA 对环丙沙星耐药的分子机制主要表现为gryA 基因83位氨基酸密码子的突变[7]。此外，AB 的细胞结构及药物作用靶位的改变，都可导致抗菌药物与细菌的亲和力下降，导致药效降低或失去抗菌作用。2耐药鲍曼不动杆菌的治疗对策 近年来，随着广谱抗菌药物的广泛使用，临床上关于鲍曼不动杆菌耐药的报道越来越多，并呈现出多重耐药，甚至全耐药及高耐药率的趋势。研究显示，鲍曼不动杆菌对第一、二代头孢菌素几乎耐药，对第三代头孢菌素除头孢他啶稍低外，其他都达60％以上，并且大多数对β-内酰胺酶类的耐药率有上升趋势。防治鲍曼不动杆菌感染除了改善病人营养、提高免疫力、医护人员注意无菌操作和加强病区卫生消毒工作之外，更应注意根据药敏实验 结果合理使用抗生素。针对MDR-AB 或PDR ．AB 的治疗， 文献报道和临床使用较广的药物是含舒巴坦制剂、 多粘菌素类、替加环素以及相应药物的联合治疗。2.1含舒巴坦制剂：舒巴坦（sulbactam ，青霉烷砜）为半合成的β-内酰胺酶抑制药，直接作用于细菌的青霉素结合蛋白，从而显示出它对不动杆菌的独特杀菌作用。同时，它可抑制细菌产生的多 种β-内酰胺酶、 多数超广谱β一内酰胺酶（ESBLs ）及多种水解酶。据学者Jim énez-Mej ías ME 等[8] 报道， 用氨苄西林/舒巴坦治疗八例院内感染鲍曼不动杆菌的脑膜炎病人，用药前已呈多重耐药，用药后六例治愈。 2.2多黏菌素类：多黏菌素类是从多黏杆菌培养液中分离获得的一组多肽类抗生素。目前，临床上常用的有多黏菌素B 、E 、M 三 型。Michalopoulos 等曾对多黏菌素雾化吸入做了前瞻性研究， 雾化吸入作为呼吸机相关肺炎的辅助方式治疗多耐药的革兰阴性菌感染，同步静脉使用多黏菌素或其他抗菌药物，细菌学和临床 表现均显示有效率83.3％， 未发现与药物相关的不良反应[9]。2.3替加环素：替加环素作用机制是通过与细菌30S 核糖体结合，阻止转移RNA 的进入，使得氨基酸无法结合成肽链，最终阻断细 菌蛋白质合成，限制细菌生长。张小红[10] 等用替加环素对多重耐药菌的体外抗菌活性进行了研究，其中37株MDR-AB 对替加环 摘要：近年来，关于鲍曼不动杆菌感染的报道日益增多，广谱抗生素的大量使用又加剧了其对主要抗菌药物的耐药，多耐药甚至全 耐药的病例较多。回溯文献发现，耐药机制主要体现在产生对抗抗菌药物的灭活酶和细菌本身的特性和突变等方面。针对多重耐药和 泛耐药病例，含舒巴坦制剂、 多粘菌素类、替加环素以及联合用药已成为主流治疗方法。关键词：鲍曼不动杆菌；灭活酶；主动外排系统；菌株变异；联合用药 中图分类号：R516 文献标识码：B 文章编号：1006-0979（2012）08-0101-02 鲍曼不动杆菌耐药机制及治疗对策的研究进展 雷朝晖* alone in the treatment of pain symptoms caused by endometriosis[J].Hum Reprod ，2009，24:3033-3041. [22]Soysal S ，Soysal ME ，Ozer S ，et al.The effects of post-surgical administration of goserelin plus anastrozole compared to goserelin alone in patients with severe endometriosis:a prospective random －ized trial[J].Hum Reprod 2004，19:160-167. [23]Remorgida V ，Abbamonte HL ，Ragni N ，et al.Letrozole and norethisterone acetate in rectovaginal endometriosis.Fertil Steril ，2007，88:724-726. [24]Ferrero S ，Venturini PL ，Ragni N ，et al.Pharmacological treat －ment of endometriosis:experience with aromatase inhibitors [J].Drugs ，2009，69:943-952.[25]李旭冰，毕慧霞.血管内皮生长因子与子宫内膜异位症[J].中国保健营养，243-244. [26]Mahnke JL ，Dawood MY ，Huang ，JC.Vascular endothelial growth factor and interleukin-6in peritoneal fluid of women with en －dometriosis[J].Fertil Steril ，2001，73，166-170. [27]Mclaren J ，Prentice A ，Charnock-Jones DS ，et al.Vascular en －dothelial growth factor （VEGF ）concentrations are elevated in peri －toneal fluid of women with endometriosis [J].Hum Reprod ，1996，11，220-223. [28]Hull ML ，Charnock-Jones DS ，Chan CL ，et al.Antiangiogenic agents are effective inhibitors of endometriosis [J].J Clin Endocrinol Metab ，2003，88，2889-2899. [29]Attar E ，Bulun SE ，Aromatase inhibitors:the next generation of therapeutics for endometriosis[J].Fertil Steril 2006，85:1307-1318.[30]Vonkeman HE ，Brouwers JR ，van de Laar MA.Understanding the NSAID related risk of vascular events[J].BMJ ，2006，332:895-898. 101
人中性粒细胞弹性蛋白酶酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 0pg/ml-160pg/ml 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中中性粒细胞弹性蛋白酶含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人中性粒细胞弹性蛋白酶水平。用纯化的人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入中性粒细胞弹性蛋白酶，再与HRP标记的中性粒细胞弹性蛋白酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的中性粒细胞弹性蛋白酶呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人中性粒细胞弹性蛋白酶浓度。 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
蛋白酶抑制剂的研究进展 郭川 微生物专业，200326031 摘要：自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点，活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。 关键词：蛋白酶抑制剂；结构；应用 天然的蛋白酶抑制剂(ＰＩ)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等，PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。从Ｋｕｎｉｔｚ等最早分离纯化出一种ＰＩ至今,已有多种ＰＩ被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶Ｄ等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[1]。 1 结构与功能 1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protease Inhibitor,Serpin） 丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。Sepin为单一肽链蛋白质。各种serpin大约有30％的同源序列，疏水区同源性高达70％。血浆中的serpin多被糖基化，糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。位于抑制性serpin表面、距C端30～40个氨基酸处的环状结构区RSL（reactive site loop）中，存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1[2]；近C端与P1相邻的氨基酸为P1’，依此类推，即肽链结构表示为N端-P15～P9～P1-P1’～P9’～P15’-C端。在对靶酶的抑制中。Serpin 以RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密的不易解离的酶-抑制剂复合物，同时P1-P1’间的反应活性位点断裂。几种perpin氨基酸序列比较发现，serpins各成员的抑制专一性是由P1决定的，且被抑制的酶特异性切点一致。如抗凝血酶，抑制以Arg羧基端为敏感部位的丝氨酸蛋白酶，其中P1为Arg[2]。 1.2巯基蛋白酶抑制剂（Cytsteine Proteinase Inhiitor，CPI） 对于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)已有大量研究,巯基蛋白酶抑制剂(CPI)的研究则相对要晚一些。而动物和微生物来源的CPI已有一些研究,发现它们在结构上具有同源性,Barrett等将CPI统称为胱蛋白超家族,并按分子内二硫键的有无与数量,分子量大小等将此家族分为3个成员(F1、F2、F3)。在3个家族中,大多数F1和F3的CPI中都有Glu53-Val54-Val55-Ala56-Gly57保守序列,其同源序列在其它CPI中也被发现,如Ｆ2中的Gln-Ｘ-Val-Ｙ-Gly和CHα-ras基因产物中的Gln-Val-Val肽段。人工合成的Glu-Val-Val-Ala-Gly 短肽也显示对木瓜蛋白酶有抑制活性,因此可以认为这一保守区段在抑制活性中起着全部或部分的关键作用[3]。对植物来源的ＣＰＩ研究的不多,已有报道的有水稻、鳄梨和大豆。水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) 具有102个氨基酸残基,有典型的Glu-Val-Val-Ala-Gly保守序列,应与动物CPI同源进化而来。从OCI没有二硫键来看,它应归为F1成员,但从序列比较看,则更接近F3。对OCIGlu---Gly保守序列进行点突变试验表明,突变使其抑制活性大幅度下降,其中当Glu被Pro替代时则活性全无,由此说明,这一段保守序列在OCI的抑制活性中,同动物CPI一样必不可少。除Glu---Gly保守区域外,OCI序列中其
Promega公司近日宣布推出四款新的蛋白酶，包括胃蛋白酶（Pepsin）、弹性蛋白酶（Elastase）、测序级别的Arg-C以及嗜热菌蛋白酶（Thermolysin）。这些高品质的蛋白酶是Promega市场领先的蛋白样品制备试剂中的最新成员。 Promega公司近日宣布推出四款新的蛋白酶，包括胃蛋白酶（Pepsin）、弹性蛋白酶（Elastase）、测序级别的Arg-C以及嗜热菌蛋白酶（Thermolysin）。这些高品质的蛋白酶是Promega 市场领先的蛋白样品制备试剂中的最新成员。 这些新的蛋白酶是以冻干粉形式提供的，可重悬于任何缓冲液中。它们的应用包括肽段作图和蛋白鉴定实验，以及翻译后修饰的鉴定。 胃蛋白酶优先切割苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸和色氨酸的羧基端。弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，有着消化弹性蛋白的独特能力。它优先切割丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的羧基端。Arg-C是一种测序级别的肽链内切酶，切割精氨酸残基的羧基端，包括挨着脯氨酸的位点。切割还会发生在赖氨酸残基。在质谱及其他应用中，这三种蛋白酶可单独使用，或与其他酶结合使用。 嗜热菌蛋白酶是一种热稳定的金属蛋白酶，其最佳消化温度在65-85°C。高的消化温度可替代变性剂，以改善某些耐水解蛋白的消化。嗜热菌蛋白酶优先消化疏水氨基酸亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和蛋氨酸的氨基端。 Promega公司为质谱分析提供了多款特色产品，包括“金牌胰蛋白酶”（Trypsin Gold）。胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，可特异性地切开赖氨酸和精氨酸残基的羧基端。胰蛋白酶这种严格的特异性是蛋白质鉴定的基础。天然胰蛋白酶易于自我水解，产生假胰蛋白酶，后者特异性较广，含有胰凝乳蛋白酶样活性。这些自我水解产物能产生多余的肽片段，从而干扰质谱检测。 为此，Promega将猪胰蛋白酶中的赖氨酸残基经过还原甲基化修饰，成为活性高且稳定的分子，抗拒自我水解的性能特别强。通过TPCK 处理使胰凝乳蛋白酶失活，又进一步提高了胰蛋白酶的特异性。处理过的胰蛋白酶经过亲和层析纯化，制成冻干粉，成为Trypsin Gold。胰蛋白酶常用于胶内消化。消化产物经纯化和浓缩，然后再进行质谱分析确定分子量，通过数据库搜索，可鉴定分离在胶中的蛋白质。 rLys-C（质谱级）则是在大肠杆菌中表达的重组Lys-C。与天然的Lys-C类似，rLys-C非常特异地切割赖氨酸残基的C末端。即使在蛋白变性条件（如8M 尿素）下，rLys-C也能保持蛋白水解活性，从而可用于提高对不易水解的蛋白质的消化。当pH值范围在 8-9 时，rLys-C具有最佳活性。
当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期：2012-06-13 来源：互联网 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;
蛋白酶抑制剂选择指南 1 蛋白酶抑制剂选择指南 抑制剂 工作浓度 分子量 抑制蛋白酶种类 稳定性 AEBSF终浓度1mM MW:239.5不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制胰蛋白酶,糜 蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及激肽释放酶. 可溶于水,其pH7的水溶液在4o C可保持稳定1-2个月,在pH>8的情况下会发生缓慢水解 Aprotinins 抑肽酶终浓度2ug/ ml MW:6512 可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制纤溶酶,激肽 释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶,但不抑制凝血酶和 Factor Xa。 非常稳定,当pH>12.8时失去活性,可溶于 水(10mg/ml),-20o C下可长期保存 Bestatin终浓度10uM MW:308.4 可逆的丙氨酰-氨基肽酶抑制剂, 工作液可保存一天,1mM的甲醇贮存液在 -20o C可保存至少一个月 E-64 Protease Inhibitor终浓度10uM MW:357.4 不可逆的半胱氨酸酸蛋白酶抑制剂,抑制半胱氨酸 酸蛋白酶而不会影响其他酶的半胱氨酸残基,与小 分子量的巯基醇如beta-巯基乙醇不会产生反应, 具有高度特异性。工作液在正常pH值下可保持稳定数天,1mM的水溶液在-20o C可保存几个月 EDTA, 4Na终浓度10mM MW:380.2 金属蛋白酶的可逆性螯合物,可能同时影响其他金 属依赖性生物过程。其水溶液很稳定,其贮存液(pH8.5的0.5M 水溶液)在4o C可保存数月 Leupeptin, 半硫酸盐 亮抑酶肽（亮肽素） 终浓度100uM MW:493.6 可逆的丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶制剂,可抑制胰蛋 白酶样蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C内 切蛋白酶,激肽释放酶,木瓜蛋白酶,凝血 酶,Cathepsin B及胰蛋白酶。 工作液的稳定期为数小时,贮存液(10mM 水溶液)在4o C时稳定期为一周,-20o C时 稳定期为一个月 Pepstatin A 终浓度1uM MW:685.9 可逆的天冬氨酸蛋白酶,可抑制胃蛋白 酶,Cathepain B&L,血管紧张肽原酶(renin)及以1mg/ml溶于甲醇,搅拌过夜可以 1mg/ml溶于乙醇,333mg/ml溶于6N的
血常规白细胞计数的影响因素 白细胞增多的因素: 有炎症的时候，血液，尿液里面的白细胞就会增加。还有一些血液病的白细胞也会增加。 此外医生常常要根据血常规中的白细胞状况进行分析，判断患者是否存在感染。一般来讲感染会引起白细胞增高。但某些白细胞增高不一定就是存在感染。 许多生理因素:可以引起白细胞总数增加。白细胞的生理波动幅度很大，在安静和休息时白细胞数较低，活动和进餐后较高，一日之间的最高值与最低值之间可相差1倍比如：剧烈运动；体力劳动；在冬季长时间暴露于冷空气之后；饱餐、淋浴后也常有白细胞轻微增高。生理性白细胞增高还见于情绪紧张，饥饿时低血糖等。但生理性白细胞增多是暂时的，去除影响因素则很快恢复。产生机制可能是与各种生理因素刺激时，体内儿茶酚胺分泌增多，导致边缘白细胞进入循环所致。 许多药物可以引起白细胞总数增加。比如：某些抗生素(antibiotic)如红霉素、头孢赛曲等；还有儿茶酚胺类药如肾上腺素、去甲肾上腺素、间羟胺、多巴胺等；另外肾上腺皮质激素氢化可的松、地塞米松、促肾上腺皮质激素等均可引起白细胞总数增多。抗精神病药碳酸锂也可以引起白细胞数量增多。
总之，血常规中白细胞增高不一定是感染，很可能是由于上述生理因素或药物所致.血液病的白细胞也会增加。 白细胞减少的原因看你存在那些因素 （1）药物因素：能引起白细胞减少的药物很多，主要有抗癌药、氯霉素、磺胺类消炎药止痛片，治疗甲亢的药物，治疗糖尿病的药物等。 （2）感染因素：很多感染性疾病可引起血细胞减少，如伤害、病毒感染、支原体肺炎、传染性肺炎、粟粒性肺结核等。（3）血液病：如急性白血病、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞病、脾功能亢进、再生障碍性贫血等。 （4）接触放射线：如接触X线、钴60、磷32等。 （5）其他：结缔组织病，系统性红斑狼疮、肝硬化特别是伴有脾肿大者。
2014年第二季度细菌耐药监测结果预警与应对策略由于抗菌药物的广泛不合理应用。细菌耐药现象日益严峻，临床出现大量多耐药和泛耐药菌株，给医院感染预防控制带来挑战。细菌耐药有一定的区域性和时间性，及时了解和掌握本院常见多耐药菌的流行现状及耐药特征，有利于临床医师合理选择抗菌药物，提高治疗效果，以达到减少为耐药菌的产生。现对2014年第二季度病原菌分布情况和耐药率进行公布，并向临床科室提供细菌耐药应对措施。
菌药物，提示“慎用抗菌药物”；耐药率超过50%的抗菌药物，提示“参照药敏试验结果用药”；耐药率超过75%的抗菌药物，提示“暂停该类抗菌药物的临床应用”。2细菌产生耐药性机制 2.1铜绿假单胞菌耐药机制
铜绿假单胞菌对生存环境和营养条件要求很低，在自然界分布广泛，甚至在医院内环境经常可见，其具有多药耐药性及耐药机制：（1）该菌能够产生破坏抗菌药物活性的多种灭活酶、钝化酶和修饰酶。（2）基因突变，作用靶位变异。（3）细胞膜通透性降低。（4）主动泵出机制将进入的药物排到体外。（5）产生生物膜，阻隔白细胞、多种抗体及抗菌药物进入细菌细胞内吞噬细菌。由于铜绿假单胞菌复杂的耐药机制导致其感染具有难治性和迁延性。 2.2大肠埃希氏菌耐药机制 大肠埃希菌是G－杆菌中分离率较高的机会致病菌，可引起人体所有部位的感染并且呈多重耐药性。 （1）β-内酰胺酶的产生 ①大肠埃希菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药主要是由超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）引起的，对头霉素类及碳青霉烯类药物敏感。ESBLs可分为五大类：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型，大肠埃希菌ESBLs酶以TEM型最常见。TEM型ESBLs 呈酸性，可水解头孢他啶、头孢噻肟。SHV型ESBLs呈碱性，有水解头孢噻吩的巯基。CTX-M型ESBLs呈碱性，对头孢噻肟水解能力强于头孢他啶。OXA型ESBLs 呈弱酸性或弱碱性，主要水解底物是苯唑西林，OXA型酶主要见于铜绿假单胞菌中，在大肠埃希菌中的分离率较低。 ②AmpCβ-内酰胺酶AmpC酶主要作用于头孢菌素类抗菌药物，且不能被克拉维酸抑制。它是水解酶，与β-内酰胺环羧基部分共价结合，在水分子作用下导致β-内酰胺环开环，破坏β-内酰胺类抗菌药物抗菌活性。 ③对酶抑制剂药的耐药的β-内酰胺酶对酶抑制剂药的耐药的β-内酰胺酶（IRT）主要有TEM系列衍变而来，又称为耐酶抑制剂TEM系列酶。 （2）药物作用靶位的改变 （3）主动外排 （4）外膜通透性的下降 2.3肺炎克雷伯杆菌耐药机制 肺炎克雷伯杆菌属于阴性杆菌，通常存在于人类肠道、呼吸道，是除大肠埃希氏菌外导致医源性感染的最重要的条件致病菌。由于抗菌药物的大量使用，在选择性压力下多药耐药肺炎克雷伯杆菌（KPN）菌株不断出现，耐药率日益上升，KPN 耐药机制包括：（1）产抗菌药物灭活酶 ①β-内酰胺酶包括产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、AmpC酶、耐酶抑制剂β-内酰胺酶、碳青霉烯酶(KPC酶)及金属β-内酰胺酶（MBLs）等。 ESBLs是耐药KPN产生的最主要的一类酶，由质粒介导，产ESBLsKPN对青霉素类、头孢菌素类及单环类药物耐药，但对头霉素类和碳青霉烯类及酶抑制剂敏感。
人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究 人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophi l elastase，HNE)在机体各种炎症反应、组织损伤重构（如肺炎）、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急（慢）性肺损伤、肺水肿、动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中起重要作用，并且具有促进病毒、细菌的侵人及癌细胞转移的功能。炎症机制研究显示，体内该酶及其内源性抑制剂的平衡失调可导致组织基质降解和炎症的恶化。目前，国外用HNE抑制剂来治疗这一类炎症疾病的研究非常广泛，并已成功开发出第一个以抑制HNE为治疗途径的上市药物西维来司钠（sivelestat sodium hydrate），从而促进了HNE抑制剂的研究与开发。 1 BM的生理、病理作用及结构特征 HNE，又称人白细胞弹性蛋白酶（human leukocyte elastase，IRE），属于基质金属蛋白酶类（matrix metalloproteinases,MMPs），即MMP-12,是一种金属离子依赖性基质降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+离子的存在才具有酶活性，其底物类型非常广泛，几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶，中性粒细胞中其含量很高，大约每106个细胞中含有HNE的总量为 3μg。生理条件下，HNE可以协助清除异源性物质，促进吞噬细胞消除有害病菌，并帮助消化受损组织，有助于伤口的愈合与组织再生。而HNE过量表达则会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分，使中性粒细胞更容易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-8、TNF-α等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase 3诱导的细胞凋亡。据报道，HNE还能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力，促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。 HNE存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由 218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约25.9 kD，含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30%～40％的同源性，最适pH值接近中性。HNE的基因位于19号染色体的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒细胞中并无HNE的mRNA表达，说明此种酶只在未成熟的骨
粗粮含蛋白酶抑制剂。荞麦、燕麦、莜麦、高粱面、红薯等粗粮中，含有抗营养素蛋白酶抑制剂。其中，荞麦、莜麦含量最高。粗粮发酵以后，酵母菌大大降低蛋白酶抑制剂的活性，所以粗粮发酵后蒸窝头、贴饼子等食用为好。 各种粗 粮 甘蓝含有硫苷。卷心菜、紫甘蓝、荠菜、萝卜、洋葱、花菜等十字花科蔬菜中，含有抗营养素——硫苷。硫苷降解的某些产物能抑制甲状腺素的合成和对碘的吸收。硫苷具有两面性，虽然它有副作用，但对子宫癌、乳腺癌等多种癌有显著的抑制作用。硫苷对热敏感，将蔬菜炒熟后，可去除其中的大部分硫苷。理想的做法是，将其一半生吃一半熟吃，这样既可保留防癌成分，又有利于其他营养成分的吸收。 黄瓜等含有抗坏血酸氧化酶。黄瓜、西葫芦、莴笋、水芹、花菜、南瓜等食物中，含有抗营养素——抗坏血酸氧化酶。抗坏血酸氧化酶会破坏蔬菜和水果中维生素C的含量。所以食用黄瓜时不必切开，生吃即可。西葫芦、莴笋、水芹、花菜等蔬菜宜大火快炒，最好不要加醋。 蛋白质抑制剂:这是大豆和其它豆类中存在的一种特殊蛋白质，可以抑制体内胰蛋白酶等十几种消化酶的流活性，其代表为胰蛋白酶抑制剂，它能抑制蛋
白酶对蛋白质的消化吸收。它需经蒸发气加热30分钟或高压蒸气加热15~2 0分钟才能被破坏。 皂角素：大豆中含有的皂角素，对消化道粘膜有强烈的刺激性，人吃了没有煮熟的大豆或豆浆，常会产生恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，就是由于皂角素没有完全破坏所引起。皂角素需加热至100度才破坏，因此食用豆类或豆浆必须煮开10~20分钟后才能食用。 凝血素：也是一种特殊蛋白质，称为植物血球凝集素，可使人体细胞凝集，但加热即可被破坏，或在体内经蛋白酶作用也可使其失去活性，不致被肠道吸收后引起凝血。 棉子糖合成酶:众所周知，多吃大豆后肚子容易胀气。其原因是大豆中含有一种棉子糖合成酶，它进入人体后，可以合成大量低聚糖，如棉子糖、水苏糖等。这些糖不能被子人体吸收，大部分在肠中被细菌分解利用，同时产生大量二氧化碳、氢和甲烷。但大豆充分加熟后，此酶即被破坏，产气也随之减少；加工成豆制品或发酵制品也可去除这种酶，故吃豆腐、腐乳等豆制品就不会胀气。 植酸:这是一种含磷化合物，一般植物性食品中都含有。但大豆中含量很高，大豆中占60%~80%的磷都是以植酸形式存在，植酸可与蛋白质、无机盐及矿物元素钙、磷、铁、锌等结合而影响其消化吸收。大豆中的锌很难吸收，就是受了植酸的影响，可利用发芽米分解植酸，提高大豆中铁、锌、钙、镁等矿物元素的生物利用率。
白细胞计数及分类的临床意义分析白细胞是一类有核的血细胞。白细胞不是一个均一的细胞群，根据其形态、 功能和来源部位可以分为三大类：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。白细胞与红细胞和血小板一样都起源于骨髓中的造血干细胞，在细胞发育过程中又都是经历定向祖细胞、前体细胞，而后成为具有各种细胞功能的成熟白细胞。 1 白细胞计数 1.1 检验标本的正确采集严格使用EDTA-K2抗凝静脉血，抽血后立即轻轻颠倒混匀，防止血小板黏附和聚集，摇晃切勿用力，防止产生气泡及造成溶血；取样后2小时内及时送检进行测定，室温贮存不得超过6小时。 1.2 临床意义白细胞总数具有明显的生理波动性，一日之间最高值与最低值之间可以相差1倍。如下午较上午偏高；用餐后较用餐前偏高；剧烈运动、情绪激动时较安静状态下偏高；月经前期、妊娠、分娩、哺乳期亦可增高；新生儿及婴儿明显高于成人。 正常成年人白细胞总数是(4.0～10.0)×109／L，每日不同的时间和机体不同的功能状态下，白细胞在血液中的数目是有较大范围变化的。当每升超过10．0×109个白细胞时，称为白细胞增多。而每升少于4.0×109个白细胞时，称为白细胞减少。机体有炎症时常出现白细胞增多。 有急性感染，组织损伤、坏死、恶性肿瘤、白血病，尤其是慢性白血病、急性失血、急性中毒、类白血病反应等，白细数计数病理性增多。某些感染，如革兰阴性杆菌感染、病毒感染、寄生虫感染等；某些血液病，如再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、白细胞不增多型白血病等；自身免疫性疾病；理化损伤及药物反应；肝硬化、脾功能亢进等，出现病理性减少。抗癫痫类药物、某些抗生素、麻醉药、激素类药物可引起一过性白细胞增多。磺胺类药物、解热镇痛药、抗肿瘤药物等，会使白细胞降低。 2 白细胞分类计数、，。 参考值：中性杆状核粒细胞1％～5％，(0.04～0.50)×109／L；中性分叶核粒细胞50％～70％，(2.00～7.00)×109/L;嗜酸性粒细胞0．5％～5％，(0.02～ 0.50)×109／L;嗜碱性粒细胞0％～1％，(0～0.10)×109／L；淋巴细胞20％～40％，(0.80～4.00)×109／L；单核细胞3％～8％，(0.12～0.70)×109／L 2.2 临床意义 2.2.1粒细胞中性粒细胞有趋化作用和调节作用、变形性和粘附作用、吞噬作用和杀菌作用。由于中性粒细胞占白细胞总数的50％～70％，其增高和减低直接影响白细胞总数的变化。在临床的具体应用中单纯的白细胞总数检测意义不大，其数量变化必须参考白细胞分类的变化值。 中性粒细胞病理性增多急性化脓性感染时，中性粒细胞增高程度取决于感染微生物的种类、感染灶的范围、感染的严重程度、患者的反应能力。如感染很局限且轻微，白细胞总数仍可正常，但分类检查时可见分叶核百分率有所增高；中度感染时，白细胞总数增高大于10×109／L，并伴有轻度核象左移；严重感染时总数常明显增高，可达20×109／L以上，且伴有明显核象左移；在脾破裂
当前位置:生物帮〉实验技巧 > 生物化学技术＞正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期:2012—0６－13 来源:互联网 标签: 相关专题:解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质得同时可释放出蛋白酶,这些蛋白酶需要迅速得被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中,需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解、以下列举了5种常用得蛋白酶抑制剂与她们各自得作用特点,因为各种蛋白酶对不同蛋白质得敏感性各不相同,因此需要调整各种蛋白酶得浓度 恩必美生物新一轮2－5折生物试剂大促销！?Iｂiｄi细胞灌流培养系统－模拟血管血液流动状态下得细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质得同时可释放出蛋白酶,这些蛋白酶需要迅速得被抑制以保持蛋白质不被降解、在蛋白质提取过程中,需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解、以下列举了5种常用得蛋白酶抑制剂与她们各自得作用特点,因为各种蛋白酶对不同蛋白质得敏感性各不相同,因此需要调整各种蛋白酶得浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中得溶解度极低,尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂得沉淀。在宝灵曼公司得目录上可查到更完整得蛋白酶与蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PＭSＦ 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶,凝血酶)与巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); ２)1０ｍg/ｍｌ溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; ４)工作浓度:17~17４ug／ml(0。1～1.0mｍoｌ／L); ５)在水液体溶液中不稳定,必须在每一分离与纯化步骤中加入新鲜得PMSF。 EDTA １)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5ｍol/L水溶液,pH8～９; 3)溶液在4℃稳定六个月以上;
血浆蛋白的测定及临床意义 一、血浆蛋白质测定方法的进展： （一）、比色法：例如总蛋白的测定方法：双缩脲反应法；白蛋白的测定方法：溴甲酚绿法。 （二）、电泳法：是进一步分离蛋白质的方法。 （三）、免疫测定法：是利用抗原抗体反应检测标本中微量物质的分析方法。 特点：（1）特异性好：即某一抗原只与其相应的抗体起反应。 （2）敏感性高，可检测出纳克（ng）水平的的量。 免疫测定法包括： 1、免疫扩散法：敏感度在ug/ml，因此只能用于检测含量较高的蛋白质。且操作 繁琐、时间长，需18-48小时。 2、免疫电泳法：是区带电泳与免疫扩散相结合的方法。一般不能定量，仅用于检 测异常蛋白成分。 3、免疫浊度法：基本原理是：当可溶性抗原与相应抗体特异结合，在二者比例合 适，并有一定浓度的电解质存在时，可以形成不溶性的免疫复合物，即沉淀反 应。 二、免疫浊度法的原理： 免疫浊度法可分为透射免疫比浊法和散射免疫比浊法。 1、透射免疫比浊法：当一定波长的光线通过抗原抗体反应混合液时，被形成的免 疫复合物反射、遮挡或吸收而减弱。在一定范围内，吸光度（A）与IC量呈正 相关。因此当抗体量固定时，根据吸光度可计算出抗原量。要求形成的IC达到 一定的数量，而且分子颗粒较大，否则难以精确测定，因此检测灵敏度相对较 低。 2、散射免疫比浊法：光线通过检测溶液时，被反应形成的抗原抗体复合物折射而 部分偏转，产生散射光，散射光强度（I）与样本的IC量、散射夹角（θ）成 正比，而与入射光波长成反比。 散射免疫比浊法又可分为终点散射比浊法和速率散射免疫比浊法 （1）终点散射免疫比浊法：当反应达到平衡时进行检测，通常需10-30min，且灵敏度较低。 （2）速率散射免疫比浊法：由于抗原与抗体结合形成免疫复合物的速度在单
血液检查白细胞高的引起原因 人的身体当中分为白细胞与红细胞这种现象是不同的，每一种类的细胞都是平均数量的，如果一旦出现了血液检查白细胞高，就很有可能是身体出现的问题，比如说某些细菌感染而造成的疾病原因，甚至是全身性的感染那我们该怎么办呢。 一般是感染后白细胞才会升高,白细胞高提示体内有炎症感染,往往也会有发烧症状.如果白细胞计数中性粒比率偏高,说明 是细菌感染,淋巴细胞比率偏高,说明是病毒感染.你也可能是混 合感染.消炎和抗病毒治疗就可以了.意见建议:没什么大问题. 一般感冒都会引起这些症状.而婴幼儿的白细胞一般都要比成人 高一下!婴幼儿一般抵抗力较差,所以平时需要加倍呵护,平时注 意他的卫生,不要受凉就好了.白细胞多是不能判断是白血病的. 白血病的特异性诊断时做骨髓检查,血常规结果对大部分白血病 可起到提示作用.白血病诊断标准：实验室诊断标准：血红蛋白,红细胞明显较少,血小板减少,白细胞明显增高或者明显减少,血 涂片中原始加早幼粒,原单加幼单,
1)某些细菌性感染所引发的疾病，特别是化脓性球菌引起的局部炎症和全身性感染，如：脓肿、化脓性脑膜炎、肺炎、阑尾炎、中耳炎、扁桃体炎、脓胸、肾盂炎、输卵管炎、胆囊炎及败血症等。(2)某些病毒性感染所导致的疾病：乙型脑炎，传染性单核细胞增多症，麻疹等。(3)严重的组织损伤或坏死：如大手术后，烧伤，急性出血严重创伤，血管栓塞等。(4)过敏反应：如输血反应，药物过敏，急性变态反应性疾病等。 对于生活当中的常规检查朋友们是需要注意的特别是狠毒 的彭的发现血液检查白细胞高这种现象及时治疗防止病情的危害，一旦出现感染与影响很容易会造成一些疾病的发生。