酰胺I带和酰胺III带测定花生磷脂酶D
的α-螺旋和β-折叠含量
曹栋史苏佳张永刚袁凯马雪婷
（江南大学食品学院无锡 214122）
摘要用傅立叶红外光谱对酰胺I带和酰胺III带测定花生磷脂酶D的α-螺旋和β-折叠含量进行了研究。结果显示，酰胺I带与酰胺III带都可以用来测定花生磷脂酶D的α-螺旋和β-折叠的含量，两个谱带测定的β-折叠含量误差在3%以内，α-螺旋含量的误差在5%左右。
关键词酰胺I带酰胺III带磷脂酶D
The Determination of the Contents of α-Helix and β-Sheet of Phospholipase D from Peanut by Investigating Amide I and III Regions of FT-IR Spectra
Cao Dong, Shi Sujia, Zhang Yonggang, Yuan Kai, Ma Xueting
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122)
Abstract The contents of α-helix and β-sheet of phospholipase D from peanut had been determined by investigating amide I and III regions of FTIR spectra. The errors of measurements of the α-helix and β-sheet were less than 3% and around 5% respectively. Keywords Amide I, Amide III, Phospholipase D
测定蛋白质的二级结构，X-射线衍射技术是最准确和最可靠的，但它需要获得合格的晶体。因而该技术的应用不仅工作量大，成功率低(蛋白质单晶不易获得)，而且测定结果不易说明蛋白质在生理状态下的构效关系。圆二色光谱(CD)法通常测定溶液状态下蛋白质的结构。核磁共振（NMR）技术一般测定小分子蛋白质的结构。荧光和紫外光谱只能测定蛋白质分子中少数带有发色团的氨基酸残基(如Trp，Tyr等)。相比之下，傅立叶红外光谱法（FTIR）具有其独特之处，它既可以测定液体样品,又可以测定固体样品。将FTIR与去卷积(deconvolution)、二阶导数谱(Second derivative spectrum)和曲线拟合(curve-fitting)等数学处理方法结合来研究蛋白质的二级结构，是颇有发展前景的新兴研究领域[1~9]。对于用FTIR测定蛋白质分子的二级结构，研究最多的是位于1700~1600 cm-1 的酰胺I带(amide I)。近年来，对于蛋白质红外光谱位于1340~1220 cm-1的酰胺Ⅲ带的研究也越来越多[10~15]。本文报道用傅立叶红外光谱对酰胺I带和酰胺III带测定花生磷脂酶D的α-螺旋和β-折叠含量，结果显示，两个谱带测定的β-折叠含量误差在3%以内，α-螺旋含量的误差在5%左右。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
Nicolet Nexus傅立叶红外光谱仪及水平衰减全反射(ATR)附件(美国，热电公司)；HN超声波发生器(无锡华能超声电子有限公司)。
磷脂酶D(PLD)为Sigma公司产品。乙醚为分析纯且经分子筛脱水。
1.2 实验
1.2.1 pH =5.6的PLD酶液的配制取1.36g磷酸二氢钾溶于50mL去离子水中，加入少量磷酸氢二钠，调节pH至5.6，得到pH 5.6的200mmol/L磷酸盐缓冲液。取50mgPLD溶于4mL磷酸缓冲液中，得到pH=5.6的PLD酶液。
___________
江苏省自然科学基金（BK2006018）
2008-01-19收稿，2008-04-08接受
1.2.2 PLD乙醚悬浮液的制备取4mg PLD原酶加入到1mL经分子筛脱水的乙醚中，超声波振荡
30s。
1.2.3 FT-IR测定取pH＝ 5.6的PLD酶液2mL，加入ATR中，以相同条件下的磷酸盐缓冲液(pH ＝5.6, 200mmol/L)为背景，采集红外谱图；取2mg PLD原酶与100mg KBr混合均匀后压片，以空气为背景采集红外谱图；将超声波处理后的PLD乙醚悬浮液立即置于IR液池中，以脱水乙醚为背景采集红外谱图。
以上测定均在室温下进行，扫描范围4000~400cm-1，仪器分辨率为4cm-1，扫描次数32次，每个样品至少检测5次。
1.2.4 数据处理
采用OMNIC6.2软件对曲线做基线校正（谱图在1800~2200cm-1范围内呈平滑直线）和平滑处理。以FTIR原谱差减本底的吸收干扰（即水蒸气和有机溶剂的吸收光谱），差减的程度以谱图在1800~2200 cm-1呈一条平滑直线为原则。根据仪器分辨率对谱图进行平滑处理。本文采用了5点平滑处理，并用OMNIC软件得出其二阶导数曲线和傅立叶自去卷积(FSD)曲线。FSD曲线参数选择应以二阶导数曲线和FSD曲线中的各子峰的峰位和峰宽基本吻合为原则。本文采用的参数为：峰宽15.9cm-1，增强因子2.5。根据二阶导数曲线选定各子峰的峰位和峰宽，分别对酰胺I带和酰胺III带的FSD进行两点基线校正之后，对所得曲线进行拟合。得到的子峰数目在8~11之间，其残差(r2)大于0.9。当确定了各子峰与不同二级结构的对应关系后，根据其积分面积计算各种二级结构的相对百分含量。
2 结果与讨论
2.1 由酰胺I带与酰胺III带测定的PLD α-螺旋和β-折叠的比较
酰胺I带和酰胺III带对PLD二级结构测定结果见图1、表1和图2和表2。
(A) (B) (C)
图1 PLD的酰胺I带红外光谱(上)、自去卷积谱(中)和高斯曲线拟合图谱(下)
Fig. 1 FTIR spectra (upper), Fourier self-deconvolved curves (middle) and Gaussian fitting curves (bottom) in amide I region of PLD
A：pH= 5.6的PLD酶液；B：PLD原酶；C：PLD原酶在乙醚中的悬浮液
表1 PLD在酰胺I带的二级结构
Tab. 1 Infrared band positions, band areas determined by Gaussian curve fitting, and band assignments in the amide I spectral region
of PLD
16971β折叠16894β转角16815β转角167311β转角166414α螺旋165616α螺旋164616无轨卷曲163711β折叠16296β折叠16146侧链振动1606
5侧链振动16936β折叠168112β转角167014β转角166013α螺旋165014无轨卷曲164016β折叠162815β折叠1615
6侧链振动16932β折叠168012β转角167013β转角165816α螺旋165115无轨卷曲164118β折叠163012β折叠16186侧链振动1606
3
侧链振动
峰位置(cm -1
)Band position(cm -1)
峰面积百分比(%)
Percentage of Band Area(%)峰归属
Band Assignment
PLD 乙醚悬浮液pH 5.6 PLD 酶液
PLD 原酶样品Sample
(D)
(E)
(F)
图2 PLD 红外光谱酰胺III 带红外光谱(上)、自去卷积谱(中)和高斯曲线拟合图谱(下)
Fig. 2 FTIR spectra (upper), Fourier self-deconvolved curves (middle) and Gaussian fitting curves (bottom) in amide III region of PLD
D ：pH= 5.6的PLD 酶液；
E ：PLD 原酶；
F ：PLD 原酶在乙醚中的悬浮液。
表2 PLD 在酰胺III 带的二级结构
Tab.2 Infrared band positions, band areas determined by Gaussian curve fitting, and band assignments in the amide III spectral region of
PLD
13286α螺旋131718α螺旋13075α螺旋12966α螺旋128612β转角127713β转角125819无轨卷曲123815β折叠1226
6β折叠13272α螺旋131514α螺旋13042α螺旋128010β转角126916β转角125919无轨卷曲124612β折叠123815β折叠1228
8β折叠13274α螺旋131515α螺旋12923α螺旋128214β转角127315β转角125918无轨卷曲124812β折叠123813β折叠1226
6
β折叠
PLD 乙醚悬浮液PLD 原酶样品Sample 峰位置(cm -1
)
Band Position(cm -1
)
峰面积百分比(%)Percentage of Band Area(%)峰归属 Band Assignment
pH 5.6PLD 酶液
酰胺I 带峰的归属如下：1693和1640 cm -1处为分子内β-折叠；1628处为分子间β-折叠；1663和
1657cm -1处为α-螺旋；1673和1685 cm -1处为β-转角；其他位置为无规卷曲[16~18]。酰胺III 带峰的归属如下： 1333~1290 cm -1之间为α-螺旋，1250~1226 cm -1之间为β-折叠。同时把1290~1250 cm -1之间的谱带归属为β-转角和无规卷曲等结构[19]。在进行峰的归属的指认时，应该注意的是，酰胺I 带中α-螺旋和无规卷曲相邻较近，进行峰的确认要注意，但在酰胺Ⅲ带中α-螺旋和无规卷曲距离较远，易于确认。因此，把酰胺I 带与酰胺Ⅲ带结合来确认，有利于得到更可靠的蛋白质二级结构的相对含量。酰胺I 带的1618 cm -1和1606 cm -1两处子峰为侧链振动吸收，而非β-折叠结构，测定时也应注意。
由图1可见， pH= 5.6的PLD 酶液的FT-IR 谱图(图1a) 与原酶的谱图(图1b)差别较大，说明PLD 在溶解于磷酸盐缓冲液(pH=5.6)的过程中改变了自身的天然构象。表1可见，通过对高斯曲线拟合所得子峰面积的量化统计表明，PLD 溶解于磷酸缓冲液以后，酶分子中的α-螺旋结构含量由13%上升到30%，而β-折叠则从35%下降至18%，酶分子的二级结构发生了较大的变化。由图2及表2可见，在酰胺III 带也存在类似情况。由于购得的原酶已经过冻干处理，因此可以认为原酶溶解于pH 缓冲液是冷冻干燥的逆向过程，以上差异也就反映了冻干过程对于PLD 的影响。PLD 分子经冻干后的结构重排与Klibanov 等[20,21]对其他蛋白质的研究结果有类似的规律。通过对原酶在乙醚中的悬浮液的红外检测发现，酶分子在乙醚中的二级结构更接近于其原酶的状态，PLD 原酶悬浮于乙醚中之后，蛋白质分子的二级结构并没有发生太大的变化。其PLD 的α-螺旋和β-折叠在酰胺I 带和酰胺III 带的测定结果见表3。
表3 PLD 红外光谱酰胺I 带和酰胺III 带的比较
Tab. 3 Secondary structure of PLD determined by IR spectroscopy
酰胺I 带
Amide I
酰胺III 带Amide III 酰胺I 带Amide I 酰胺III 带Amide III pH 5.6PLD 酶液30351821PLD 原酶13183735PLD 乙醚悬浮液
16
22
32
31
样品Samples
α螺旋 αhelix β折叠 β
sheet 二级结构含量(%) Contents
of Secondary Structure(%)
由表3可见，酰胺I 带与酰胺III 带两个区域谱图的拟合结果基本吻合，β-折叠含量误差在3%以内，α-螺旋含量误差在5%左右。对照Klibanov 等[21]对枯草杆菌蛋白酶二级结构以及谢孟峡等[19]对牛血清蛋白、核糖核酸酶A 及伴刀豆球蛋白A 二级结构的研究结果可以得知，利用红外光谱酰胺I 带和酰胺III 带测定花生磷脂酶D α-螺旋和β-折叠误差分别在6%和5%以内都是可接受的，表明，本文的方法是合理、可行的。
3 结论
酰胺I 带与酰胺III 带都可以用来测定PLD 的α-螺旋和β-折叠的含量，β-折叠含量的误差在3%以内，α-螺旋含量的误差在5%左右。在测定PLD 的α-螺旋和β-折叠含量时，由于酰胺I 带中α-螺旋和无规卷曲相邻较近，酰胺Ⅲ带中α-螺旋和无规卷曲距离较远，因而在遇到峰的指认困难时可以通过对同时测定的酰胺I 带与酰胺III 带结果的比较分析来确定。
参考文献
[1] R A Engh ，R Huber ．Acta Crystallogra. Sec. A ，1991，A47：392 ~ . [2] W C Johnson Jr ．Protein ，1990，7(3)：205 ~ .
[3]李晓晶，张善荣，张树功 等．高等学校化学学报，1999，20（1）：127~ . [4]赵陈光，刘兰英，邱爱东 等．高等学校化学学报，1997，18（5）：744~ . [5] A Dong ，P Huang ，W S Caughey ．Biochemistry ，1990，29：3303~ . [6]邓 桦，宋占军，王德文 等．光谱学与光谱分析，2006，26（8）：1437~ . [7]王 靖，郭 晨，刘会洲 等．光谱学与光谱分析，2006，26（9）：1598~ ． [8] Y B Deng ，T Q Yang ．Spectroscopy and Spectral Analysis ，2007，27（7）
：1312~ ． [9] F N Fu ，D B De Oliveria ，W R Trumble et al ．App1．Spectrosc ．1994，48：1432~ ． [10] M Jackson ，H H Mantsch ．Crit ．Rev ．Biochem ．Mol ．Biol ．，1995，347：187~ ． [11] K G C Mirada ．Dissertation of University of Puerto Rico ，2001． [12] A Barth ．Biochim ．Biophys ．Acta ，2007，1767：1073~ ．
[13] G M Kavanagh ，S B Ross-Murphy ．Prog ．Polym ．Sci ．，1998，23：533~ ．
[14] P O Souillac ，C R Middaugh ，J H Rytting ．International J ．Pharmaceutics ，2002，235：207~ ． [15] W K Surewicz ，H H Mantsch ，J Biochem ．Biochem ．Biophys ．Res ．Commun ．，1988，150：245~ ． [16] U Gorne-Tschelnokow ，D Naumann ，C Weise et al ．Eur ．J ．Biochem ．，1993，213：1235~ ． [17] A Dong ，P Huang ，W S Caughey ．Biochemistry ，1990，29：3303~ ． [18] A Dong ，S J Prestrelski ，S D Allison et al ．J ．Pharm ．Sci ．，1995，84：415~ ． [19]谢孟峡，刘 媛．高等学校化学学报，2003，24（2）：226~ ．
[20] K Griebenow ，A M Klibanov ．Proc ．Natl ．Acad ．Sci ．USA ，1995，92：10969~ ． [21] K Griebenow ，A M Klibanov ．Biotechnol ．Bioeng ．，1997，53：351~ ．
酰胺I带和酰胺III带测定花生磷脂酶D的α-螺旋和β-折叠含量作者：曹栋， 史苏佳， 张永刚， 袁凯， 马雪婷
作者单位：江南大学食品学院 无锡 214122
刊名：
化学通报（网络版）
英文刊名：Chemistry Online
年，卷(期)：2008(1)
本文链接：https://www.doczj.com/doc/6610076585.html,/Periodical_hxtb200801146.aspx
β-内酰胺酶来源分析 β-内酰胺酶（β-lactamase）的产生是细菌对(β内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机制，在各种耐药机制中占80%。β-内酰胺酶是由多种酶组成的酶家族，能水解β-内酰胺类抗生素，这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中。至今β-内酰胺酶的数量已超过200种，其中超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase,ESBL)已超过50种。 β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其 N -酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶。细菌产生β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。β-内酰胺酶分为染色体介导酶和耐药质粒介导酶二大类，以其水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶、广谱酶和超广谱酶四种。质粒是一种密闭环状双股螺旋结构的DNA，存在于胞浆内，也是具有遗传功能的基因成分，质粒带有各种基因，包括耐药基因，但不是细菌存活所不可缺少的组成物质。染色体基因决定细菌对抗生素固有耐药性，近代研究证明在院内感染病人中产生质粒介导酶的耐药菌，其产生耐药性大多是在接触抗生素后获得的，并通过耐药基因的转移而播散，也可由基因表达而传至下代。 β-内酰胺酶掺杂于饲料中或直接喂食的可能性：可操作性几乎为零。 1.成品饲料的保存条件下（温度和氧化），β-内酰胺酶会很快失活。 2.β-内酰胺酶直接喂食：β-内酰胺酶在进入动物胃肠道后，会在胃酸，及各种胃肠道内 的蛋白酶（如胃蛋白酶，胰蛋白酶，胆汁，糜蛋白酶等等）作用下水解失活，而不能进入血液循环。即便有微量β-内酰胺酶进入血液循环，其也会在肝脏解毒分解失活或经肾脏排出。 内源性β-内酰胺酶 —— 本身存在于动物体内的β-内酰胺酶：微乎其微 β - 内酰胺酶是由细菌产生的酶类,生成后存在于细菌内，通过水解或非水解方式破坏进入菌体内的β - 内酰胺环,导致β - 内酰胺类抗生素失活,这是大多数致病菌对β - 内酰胺类抗生素耐药性的主要机制。因此，产生β - 内酰胺酶的耐药菌在保持其本身结构完整时，是不会将其自身的β - 内酰胺酶释放至宿主（动物）体内的；而当产生β - 内酰胺酶的耐药菌被宿主细胞（如白细胞或淋巴细胞）吞噬破坏后，细菌内的β - 内酰胺酶会释放至动物体细胞内（如白细胞或淋巴细胞），而动物细胞内部的蛋白酶会自动识别作为异体蛋白的
β-内酰胺类抗生素：联合酶抑制剂，提升抗菌能力 文张永信（复旦大学附属华山医院传染科教授） 基层医院2013年5月20日D11版 【问】氨曲南属于窄谱抗生素，有哪些药理特点？其临床适应证是什么？ 【答】氨曲南是单环类β-内酰胺抗生素，主要针对革兰阴性（G-）菌。对肠杆菌和铜绿假单胞菌有效，但对不动杆菌、产碱杆菌以及革兰阳性（G+）菌和厌氧菌无效。该药化学结构特殊，对β-内酰胺酶稳定，毒性低；对青霉素和头孢菌素过敏的患者仍可选用该药。临床适用于敏感菌引起的脑膜炎、严重感染、院内感染、免疫缺陷者感染，以及不能使用青霉素和头孢菌素的患者。如合并有G+菌感染，应加用林可霉素或克林霉素。 【问】头霉素与二代头孢菌素，氧头孢烯类与三代头孢菌素的抗菌谱有什么不同？对临床适应证有何影响？ 【答】头霉素与二代头孢菌素、氧头孢烯类与三代头孢菌素抗菌谱上的不同在于：头霉素、氧头孢烯类对各种厌氧菌(包括脆弱类杆菌)有良好的抗菌活性。由于头霉素和氧头孢烯类对需氧菌和厌氧菌均有良好的抗菌作用，常适用于需氧菌和厌氧菌的混合感染。 【问】β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联用，有什么作用？舒巴坦、克拉维酸和三唑巴坦(他唑巴坦)在透过血脑屏障方面有何差异？ 【答】β-内酰胺酶抑制剂可以保护β-内酰胺类抗生素免受细菌产生的β-内酰胺酶破坏，两者联合应用具有协同作用，能增强β-内酰胺类抗生素的抗菌效果。而且扩大了β-内酰胺类抗生素的抗菌谱。如原来对产酶葡萄球菌无效的药物，在联用后对产酶葡萄球菌有效。β-内酰胺类抗生素对脆弱类杆菌等厌氧菌的抗菌活性较弱，但联用后的复合制剂对厌氧菌具有良好的抗菌活性。 舒巴坦、克拉维酸和三唑巴坦对β-内酰胺酶都有抑制作用，但以三唑巴坦最强，其次为克拉维酸，舒巴坦最弱。在血脑屏障穿透力方面，舒巴坦比三唑巴坦更易透过，而克拉维酸基本不能透过。所以克拉维酸的复合制剂不宜用于中枢神经系统感染。 【问】氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦这5种复合制剂在抗菌谱、临床适应证及不良反应方面有何异同？ 【答】在抗菌谱方面，对厌氧菌的差别不大，对需氧菌有所不同。氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸对肠杆菌科细菌有良好的抗菌作用，但对铜绿假单胞菌和沙雷菌等没有抗菌作用；其他3种药物不仅对肠杆菌科细菌有良好抗菌作用，且优于前两者，对铜绿假单胞菌和沙雷菌、不动杆菌等葡萄糖不发酵菌也有良好的抗菌活性。 由于抗菌谱不同，临床适应证也就不同。氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸主要应用于肠杆菌科或肠杆菌科与厌氧菌的混合感染；由于克拉维酸的抑酶作用优于舒巴坦，阿莫
β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂临床应用专家共识 一、概述 革兰阴性菌是我国细菌感染性疾病最常见的病原体。近年来，革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性不断增加，最重要的耐药机制是细菌产生各种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制大部分β-内酰胺酶，恢复β-内酰胺类抗生素的抗菌活性。因此，β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂在临床抗感染中的地位不断提升，已成为临床治疗多种耐药细菌感染的重要选择。目前我国临床使用的β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂的种类和规格繁多，临床医师对该类合剂的特点了解不够，临床不合理使用问题较突出。为规范β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂的临床应用，延缓其耐药性的发生和发展，特制定本共识。 二、主要β-内酰胺酶及β-内酰胺酶抑制剂 β-内酰胺酶是由细菌产生的能水解β-内酰胺类抗生素的一大类酶。β-内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有根据β-内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），将β-内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶和碳青霉烯酶等；根据β-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将β-内酰胺酶分为丝氨酸酶和金属酶。目前引用较多的是基于上述2种方法建立的分类方法。见表1。 表1：β-内酰胺酶的分类和3种主要酶抑制剂的作用 功能分类分 子 分 型 主要底物 可被抑制 代表性酶 克 拉 维 酸 舒 巴 坦 他 唑 巴 坦 1 C 头孢菌素类- - - AmpC,ACT-1,CMY-2,FOX-1,MIR-1 2a A 青霉素类+ + + 青霉素酶 2b A 青霉素类，窄谱头孢菌素类+ + + TEM-1，TEM-2，SHV-1 2be A 青霉素类，超广谱头孢菌素类，单环酰胺类+ + + TEM-3,SHV-2,CTX-M-15,PER-1,VER-1 2br A 青霉素类- - - TEM-30,SHV-10,TRC-1
B-内酰胺酶的检测方法 牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法 随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为β- 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止，还没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，无法从源头上监测、把控原奶质量。 奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。 微生物方法和理化方法均利用β-内酰胺酶能够裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的原理检测乳制品中是否添加解抗剂。 一、理化方法 （一）高效液相色谱法 1、间接法 方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。 实验步骤：称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1 mL,待上机测定。 色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm； 流动相甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60； 检测波长 268 nm 讨论：该方法只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；前处理方法相对复杂、费时。
超广谱β—内酰胺酶细菌感染的防治分析 摘要目的探讨分析超广谱β-内酰胺酶细菌感染的相关防治措施以及临床效果。方法总结分析60例β-内酰胺酶细菌感染患者的具体流行情况以及控制情况。结果60例患者经治疗后，显效30例（50.0%），有效25例（41.7%），无效5例（8.3%），总有效率为91.7%。结论应尽可能防止同β-内酰胺酶感染或者定植相关的危险因素，如果出现β-内酰胺酶感染，应该及时有效的采取头霉素类以及碳青霉烯类药物对感染进行控制。 关键词超广谱；β-内酰胺酶；细菌感染；防治 【Abstract】Objective To investigate relevant prevention and treatment measures and clinical effects for extended spectrum β-lactamases bacterial infection. Methods Summary and analysis were made on specific prevalence condition and control status in 60 extended spectrum β-lactamases bacterial infection patients. Results After treatment in the 60 cases，there were 30 excellent effective cases （50.0%），25 effective cases （41.7%），and 5 ineffective cases （8.3%），with total effective rate as 91.7%. Conclusion It is necessary to avoid risk factors of β-lactamases infection and planting. Timely and effective implement of cephamycin and carbapenem drugs is essential to suppress β-lactamases infection. 【Key words】Extended spectrum；β-lactamases；Bacterial infection；Prevention and treatment 本研究总结分析本院重症加强护理病房（ICU）中超广谱β-内酰胺酶细菌感染的具体流行情况以及控制情况，以探讨分析超广谱β-内酰胺酶细菌感染的相关防治措施以及临床效果，现总结如下。 1 资料与方法 1. 1 一般资料选取本院2014年1月～2015年1月ICU中收治的60例β-内酰胺酶细菌感染患者，其中男40例，女20例，病程1～30 d。 1. 2 方法 1. 2. 1 细菌学检查培养标本分别源自于静脉导管、粪便、疱疹液、脐部分泌物、气管插管、尿液、脑脊液以及血液等；其采集方法均在无菌操作下进行，把标本放置于无菌瓶或者是培养基中，立刻送到细菌室进行培养鉴定。其中，药物敏感试验选择纸片扩散法进行。通过双纸片协同试验判断β-内酰胺酶，其判断标准为：若含克拉维酸复合剂与三代头孢的抑菌圈比单药三代头孢抑菌圈扩大超过5 mm，则认为超广谱β-内酰胺酶为阳性[1]。 1. 2. 2 β-内酰胺酶防治对策①充分对抗菌药物的适应证进行掌握。滥用抗生
β-内酰胺类抗生素β内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用 专家共识（2020年版） 一、概述 革兰阴性菌及少数革兰阳性菌对β-内酰胺类抗生素耐药的最重要机制是产生各种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制部分β-内酰胺酶，避免β-内酰胺类抗生素被水解而失活。因此，β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂（简称β-内酰胺酶抑制剂复方制剂）是临床治疗产β-内酰胺酶细菌感染的重要选择。我国临床使用的β-内酰胺酶抑制剂复方制剂的种类和规格繁多，临床工作者对该类制剂的特点了解参差不齐，临床不合理使用问题比较突出。 二、主要β-内酰胺酶及产酶菌流行情况 β-内酰胺酶是由细菌产生的，能水解β-内酰胺类抗生素的一大类酶。β-内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有两种： 一、是根据β-内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），其将β-内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC酶）和碳青霉烯酶等； 二、是根据β-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将β-内酰胺酶分为丝氨酸酶（包括A类、C类酶和D 类酶）及金属酶（B类酶）。目前引用较多的是1995年Bush等基于上述二种方法建立的分类方法，2019年Bush等又将该分类表进一步完善和细化（表1）。其中临床意义最大的是下列三类β-内酰胺酶： 表1 常见β-内酰胺酶分类及特点，常见酶抑制剂抑酶活性
1、ESBLs主要属2be\2br\2ber类酶，是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类等β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。根据编码基因的同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、CTX-M 型、OXA型和其他型共5大类型。 2、AmpC酶属C类酶，通常由染色体介导，可以被β-内酰胺类抗生素诱导。部分由质粒介导，常呈持续高水平表达。其对第一、二、三代头孢菌素水解能力强，但对碳青霉烯类抗生素和第四代头孢菌素的水解能力弱。该酶主要存在于肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、普鲁菲登菌属、黏质沙雷菌属和摩根菌属等细菌，非发酵菌中主要见于铜绿假单胞菌。质粒介导的β-内酰胺酶可分为CMY-2组、CMY-1组、MIR-1/ACT-1组、DHA-1组和ACC-1组等。 3、碳青霉烯酶是指能水解碳青霉烯类抗生素的一大类β-内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类和D类酶。A类、D类为丝氨酸酶，B类为金属酶，以锌离子为活性中心。A类碳青霉烯酶可由染色体介导，也可由质粒介导。前者包括SME、NMC和IMI酶等，后者包括KPC和GES酶等。KPC酶是近年来肠杆菌科细菌尤其是肺炎克雷伯菌对包括碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药的最主要机制，我国最常见的是KPC-2，其对头孢吡肟和头孢他啶的水解能力相对较弱。
综述 超广谱β-内酰胺酶的基因分型及研究进展超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrum beta-lactamases, ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类、单环内酰胺类抗生素的耐药性酶，由于作用底物广泛而称之，并可在菌株间转移和传播[1、2]。ESBLs主要由革兰氏阴性杆菌产生，尤其以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为代表。肺炎克雷伯菌是呼吸道感染最常见的病原菌，由产ESBLs肺炎克雷伯菌引起的医院感染爆发流行时有发生[3]。自1983年在德国首次报道分离出SHV-2型ESBLs以来，全世界许多地方不断有新的ESBLs检出[4]。目前，产ESBLs细菌在临床标本中的分离率有增加的趋势，产ESBLs菌对氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类交叉耐药也呈逐年上升趋势，这给临床感染的治疗带来了新的难题。 1.ESBLs的定义 超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类、单环酰胺类抗生素的耐药性酶，由于作用底物广泛而称之[5]。有人将ESBLs 理解为以下几条：主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生；在体外试验中可使三代头孢菌素和氨曲南的抑菌圈缩小，但并不一定在耐药范围；加入克拉维酸可使其抑菌圈扩大；临床对β-内酰胺类药物（包括青霉素和头孢类）耐药，但对碳青霉素类药物敏感；由质粒介导，往往由普通的β-内酰胺基因（TEM-1、TEM-2、SHV-1）突变而来。 2.ESBLs的耐药机制 细菌对抗生素的耐药机制可分为以下几点：细胞膜通透性的改变，使抗生素不能或很少透入细菌体内到达作用靶位;灭活酶或钝化酶的产生，如β-内酰胺酶使抗生素的作用下降；与抗生素结合靶位（亲和力）的改变，使抗生素的作用下降；其他，如主动外排系统等。对于ESBLs的近年来发现，其多种耐药性的产生与其质粒编码的ESBLs有直接关系。随着第三代头孢菌素及其他β-内酰胺类抗生素的广泛使用，产ESBLs菌增加很快。世界上许多国家和地区都有ESBLs菌流行的报道，国内也有许多地区产ESBLs菌的报道[6]。因此国内外专家一致认为广谱头孢菌素类尤其是第三代头孢菌素的广泛使用产生的选择性压力是导致产生ESBL革兰阴性杆菌增加的主要原因。由于ESBLs是质粒编码的，能通过接合、转化和转导形式，使耐药基因在菌间扩散，使敏感菌变成耐药菌
β-内酰胺酶及其活力测定法 培养基胨15g甘油50g氯化钠4g0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml枸橼酸钠5.88g20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液1ml磷酸氢二钾4g肉浸液1000ml 混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。 酶溶液的制备 取蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10ml，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体，调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。 酶活力测定法 青霉素溶液 称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。 青霉素酶稀释液 取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12 000单位的溶液，在37℃预热。 测定法 精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度］25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。 空白试验 取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。 按下式计算： E＝(B－A)×M×F×D×100 式中 E为青霉素酶活力，（单位／ml）／小时； B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L； F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数； D为青霉素酶溶液的稀释倍数。 ［附注］ 磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成1000ml。 醋酸钠缓冲液(pH4.5) 取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml，两液混合均匀
金属类β-内酰胺酶 β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。 一、发现和分布 第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。这些酶都由染色体基因编码。该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。 二、生化分类和生化性质 1995 年Bush 等将金属酶全部归入功能类型3群,主要分类依据为：能被金属螯合剂螯合，不被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦抑制。当时没有再作进一步分类。随着金属酶报道的增多，1997 年Rasmussen 和Bush 将金属酶按功能分成三个亚群：3a、3b 和3c 。 1) 3a 亚群绝大多数金属酶属于3a 亚群。其特点是底物谱宽，水解青霉素的速度与水解亚胺培南的速度相近或更快，还能有效水解头孢菌素，因此，3a亚群金属酶是β-内酰胺酶中最危险的单一酶种。许多3a 亚群酶需添加Zn2+才能达到最大活性或被激活，提示该亚群与Zn2+的亲和力低。 2) 3b 亚群分布于气单胞菌中，包括亲水气单胞、杀蛙气单胞、温和气单胞和简达气单胞菌。特点是底物特异性高，优先水解碳青霉烯，弱水解青霉素(A2h 除外) 和头孢菌素，不水解nitrocefin ，因此不能用nitrocefin 纸片法检出。等电聚焦电泳和凝胶柱层析时必须用亚胺培南作底物才能检测到。能被EDTA抑制，加EDTA 后，再加Z2+又可恢复酶活性。高浓度Zn2+可增加酶活性而在低浓度时酶活性受抑制。当Zn2+在15μmol 或更低时，至少有3 种3b 酶的活性受抑制。
产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家共识 产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家委员会 超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）是细菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的主要机制之一，其预防与治疗已成为临床医生需要面对的重要问题[1]，但国内外缺少相关问题处理的指导性意见。《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》和《医学参考报感染病学频道》编辑部组织国内部分专家制定本《共识》，以对ESBLs相关问题的处理提供指导。 一、超广谱β-内酰胺酶及相关概念 1. β-内酰胺酶及分类：β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸和7-氨基头孢烷酸及其 N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶，产β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。其分类见表1。 表1 β-内酰胺酶的功能分类和分子分类 Bush分类Ambler 分类 β-内酰胺酶特性 1 C AmpC酶革兰阴性杆菌产生，能水解三代头孢菌素，不被克 拉维酸抑制。对碳青霉烯类以外的所有β-内酰胺 类抗生素耐药 2 A、D 大多数酶可以被克拉维酸所抑制 2a A 青霉素酶包括葡萄球菌和肠球菌产生的青霉素酶，引起细菌 对青霉素类高度耐药 2b A 广谱β-内酰胺酶主要由革兰阴性菌产生，包括TEM-1、SHV-1等 2be A 超广谱β-内酰胺酶 （ESBLs）引起细菌对氧亚氨基头孢菌素和单环β-内酰胺类抗生素耐药 2br A 耐酶抑制剂的β-内酰胺酶、除一个是SHV衍生酶 之外，其余均为TEM型衍生酶（IRT）2c A 羧苄西林水解酶 2d D 邻氯西林（苯唑西林） 水解酶 不易被克拉维酸所抑制 2e A 头孢菌素酶可以被克拉维酸抑制 2f A 可以水解碳青霉烯类的丝氨酸酶、可以被克拉维酸 所抑制 3 3a、3b、3c B 金属酶或碳青霉烯酶金属酶、引起细菌对碳青霉烯类和其它所有β-内 酰胺类抗生素耐药、不能被克拉维酸所抑制 4 染色体介导的耐抑制剂的青霉素酶
超广谱内酰胺酶(ESBLs)研究进展 发表时间：2013-04-25T09:14:06.890Z 来源：《医药前沿》2013年第8期供稿作者：刘瑞菡1,2 董亮3 [导读] 产ESBLs的菌株可造成严重的医院交叉感染和院外耐药菌的扩散,甚至引起爆发流行。 刘瑞菡1,2 董亮3(通讯作者) (1武汉大学医学院湖北武汉 430000) (2孝感市中心医院检验科湖北孝感 432000) (3孝感市中心医院输血科湖北孝感 432000) 【中图分类号】R9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）08-0044-01 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是丝氨酸蛋白酶的衍生物,它能够水解青霉素、广谱及超广谱头孢菌素和单环β-内酰胺抗生素的β-内酰胺酶,且能被克拉维酸抑制。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生,以肺炎克雷伯杆菌和大肠埃希菌为代表。ESBLs基因由质粒介导,可通过接合、转化和转导等形式在细菌间扩散,给临床抗感染治疗造成极大的困难。目前,ESBLs已成为细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要原因。 1.ESBLs类型 自1983年德国学者首次从臭鼻克雷伯菌中发现了超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)SHV-2[1]以来,ESBLs种类已超过200多种。其类型可以分为TEM 型、SHV型、OXA 型、CTX-M 型、其它型等5类。其中TEM 和SHV型酶是临床较常见的。 1.1 TEM 型ESBLs:最早发现的TEM-3型对头孢噻肟耐药[2]2005年发现的TEM-94[3]对头孢泊肟和头孢噻肟耐药。还有小部分是抑制剂耐药性酶(IRT)。2005年F.Robin等[6]报道了一种新型的抑制剂耐药性酶TEM-109(CMT-5),它同时具有TEM-6的特性和TEM-33(IRT-5)对抑制剂的耐药性它代表了一种新型ESBLs的出现。 1.2 SHV 型ESBLs:SHV家族中第一个SHV型ESBLs是SHV-2。SHV-2发生了Gly-238-Ser位点的突变,增加了对氧亚氨基类抗生素的亲和力和水解能力。卢月梅等[4]同对新型β-内酰胺酶SHV-59的研究发现,其发生了A1a 134-Val和Pro 269-ku位点的变化,携带SHV-59基因的菌株对氨苄西林／舒巴坦耐药,对头孢噻肟中介,对其他药物均敏感。 1.3 OXA 型ESBLs:对酶抑制剂均耐药或仅低度敏感,特别是对青酶烷类抗生素（包括苯唑西林及相关复合制剂）有高度水解活性[5],主要涉及铜绿假单胞菌[6]和鲍氏不动杆菌[7-8]。2004年Poirel L.等首次在肠杆菌科的肺炎克雷伯菌中发现了OXA型ESBLs[9],该菌对包括碳青霉烯类在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药。 1.4 CTX-M 型ESBLs：Bauerufeind等[10-11]首次报道CTX-M 型ESBLs,对头孢噻肟高水平耐药,对头孢他啶相当敏感，周建英等[12]用头孢他啶治疗产CTx-M-l4型ESBLs大肠埃希菌造成的细菌性腹膜炎时发现其治疗效果明显好于头孢噻肟,而与哌拉西林／他唑巴坦相当。这为利用头孢他啶治疗产CTX-M型ESBLs的细菌的感染提供了试验依据。 1.5 其它类型的ESBLs：如VEB、GES、BES、CME、PER等，大多数容易水解头孢他啶,且呈区域性流行。GES型对头孢他啶和头孢西丁耐药,BES对氨曲南、头孢噻肟和头孢他啶高度耐药,PER型主要在地中海沿岸国家流行。 2.ESBLs的检测方法 产ESBLs的菌株可造成严重的医院交叉感染和院外耐药菌的扩散,甚至引起爆发流行。所以准确检测ESBLs至关重要,及早检测ESBLs 有助于制定相应的抗感染措施,为其他的治疗和预防打下基础。目前检测方法主要分为表型确认试验和分子生物学检测两大类。 2.1 表型确认试验：最经典的为肉汤稀释法和纸片扩散法。二者是美国临床试验室标准化委员会（NCCLs)推荐检测ESBLs的标准方法，其主要原理是ESBLs水解第三代头孢菌素的活性可被酶抑制剂所抑制。此后又研究出了Etest法、Vitek法、三维实验法(TD)双纸片、协同扩散法等快速简便的方法，特别是Etest法、Vitek法已经商品化，在临床上得到了广泛的应用。 2.2 分子生物学的检测：主要有PCR、核酸杂交、DNA指纹和基因序列分析。PCR法是目前常用的检测方法；核酸杂交法过于繁复，费时费力，目前已较少应用；DNA指纹法是检测SHV变种的一种快速检测基因突变的方法，但不能确定SHV 型ESBLs的存在；基因序列分析法是基因型鉴定的标准方法,目前已可方便地进行全长基因检测。 3.对ESBLs的治疗与预防 3.1 对产ESBLs菌株引起的感染的治疗:可选用碳青霉烯类抗生素,轻、中度感染町选头孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／三唑巴坦，也可根据药敏结果选用头霉素类、氨基糖苷类或喹诺酮类抗菌药物。疗效不佳时可改用碳青霉烯类抗生素，头孢他啶、头孢吡肟体外敏感性较高或感染部位浓度较高时可以选用，但需密切观察。 3.2 对ESBLs的预防:1.提高标本的送检率,早期发现多重耐药菌株,及早合理使用抗生素。2.加强对ICU的监控,调查各科室感染ESBLs的情况,对感染产ESBLs菌的患者进行隔离,严格消毒,控制产ESBIs菌在医院内的扩散。 临床微生物实验室应快速准确检测产ESBLs菌株,及时与临床联系，减少经验用药和盲目用药,合理使用抗菌药物。对有效地治疗疾病和控制ESBLs菌株感染具有重要意义。 参考文献 [1] Knothe H，Shah P，Kremery V，et a1.Transferable resistance to ee-fotaxime，eefoxitin，eefamandole and eefuroxime in clinical isolates of klebsiella pneumoniae an dserratia marcescens[J].Infection，1983，11：3l5-317. [2] Paterson D L, Ko W C, Von Gottberg A, et al. Antibiotic therapy for Klebsiella pneumoniae bacteremia: implications of production of extended-spectrum β-lactamases[J]. Clinical infectious diseases, 2004, 39(1): 31-37. [3] Anna Baraniak，Janusz Fiett，Agnieszka Mro wka et a1.Evolution of TEM-type Extended spectrum laetanmses in Clinical Enterobacteri-aceae Strains in Poland[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，1872-1880. [4] 卢月梅，张阮章，何林，等.一种新型13-内酰胺酶SHV一59的发现[J].中华医院感染学杂志，2005，09(15)：965～969. [5] Thomson K，Moland E.Version 2000：the new13-lactamases of Gram- negative bacteria at the dawn of the new millennium [J].MicrobInfect，2000，2(10)：1225-1235.
详解β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂 详解β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂 一、概述 革兰阴性菌是我国细菌感染性疾病最常见的病原体。近年来，革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性不断增加，最重要的耐药机制是细菌产生各种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制大部分β-内酰胺酶，恢复β-内酰胺类抗生素的抗菌活性。因此，β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂在临床抗感染中的地位不断提升，已成为临床治疗多种耐药细菌感染的重要选择。目前我国临床使用的β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂的种类和规格繁多，临床医师对该类合剂的特点了解不够，临床不合理使用问题较突出。为规范β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂的临床应用，延缓其耐药性的发生和发展，特制定本共识。 二、主要β-内酰胺酶及β-内酰胺酶抑制剂 β-内酰胺酶是由细菌产生的能水解β-内酰胺类抗生素的一大类酶。β-内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有根据β-内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），将β-内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶和碳青霉烯酶等；根据β-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将β-内酰胺酶分为丝氨酸酶和金属酶。目前引用较多的是基于上述2种
方法建立的分类方法。 超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类等β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。这类酶可被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦及他唑巴坦等抑制。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。到目前为止，全世界共发现了200余种ESBLs。根据编码基因的同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型共5大类型。 头孢菌素酶（AmpC酶）通常是由染色体介导，对第一、二、三代头孢菌素水解能力强，但其对碳青酶烯类抗生素和第四代头孢菌素的水解能力弱，克拉维酸钾不能抑制其活性，他唑巴坦和舒巴坦有部分抑酶作用，氯唑西林抑制头孢菌素酶作用强。该酶主要存在于肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、普鲁菲登菌属、粘质沙雷菌属和摩根菌属等细菌。染色体介导的头孢菌素酶可以被β-内酰胺类抗生素诱导和选择。近年来，质粒介导的头孢菌素酶陆续被报道，主要出现于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及沙门菌属细菌中，常呈持续高水平表达，可通过质粒广泛传播。根据其与染色体介导的头孢菌素酶的同源性，可分为CMY-2组、CMY-1组、MIR-1/ACT-1组、DHA-1组和ACC-1组等。 碳青霉烯酶是指能水解碳青霉烯类抗生素的一大类β-内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类和D类酶。A类、D类为丝氨酸酶，B类为金属酶，以锌离子为活性中心。 A类碳青霉烯酶可以由染色体介导，也可由质粒介导，前者包括
外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质。违法使用的目的，是为了掩盖违规使用大环内脂类等抗生素治疗奶牛疾病的行为。但是，内源性β-内酰胺酶的产生机理也是科学研究基本确认的事实。近几十年来，国际国内畜牧业养殖奶牛过程中无限制使用大环内脂类抗生素治疗动物、家禽等食用动物各种炎症、败血症、水肿病等病症，造成革兰氏阳性细菌对抗生素耐药，细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性一般通过4种途径。（1）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活，这是产生耐药的主要原因。目前发现的β-内酰胺酶已超过300种，它通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键从而使β-内酰胺类抗生素开环而失活。（2）改变抗生素与青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）的亲和力。当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后，PBP就会失去酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。PBP基因的变异，使β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，这是形成耐药的根本原因。（3）细胞膜和细胞壁的结构发生改变，使药物难以进入细菌内。如生物膜的形成。（4）细菌体内的能力依赖性主动转运机制，将已进入细菌内的抗生素泵出体外，也可导致耐药性。由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，同外源性β-内酰胺酶的分别鉴定检测技术尚未见报道。而目前各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法无论是化学仪器分析高效液相色谱法还是微生物法，其检测原理都是：测出的β-内酰胺酶无法判定是人为添加的或是耐药细菌产生的。奶制品中检出的β-内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。耐药性产生的机理很复杂，细菌耐药基因的转移、共生菌协同以及基因交叉耐受，等影响都要考虑。另外，根据现有的国际食源性抗生素耐药微生物的风险管理原则，建议加强畜牧业奶业生产全过程，而终产品的β-内酰胺酶检测始终是一个辅助手段，凭检测结果很难处理。化学家们要尽快建立内源性和外源性β-内酰胺酶的分离鉴定技术，当然这种技术要求是非常高的 1.常规方法(1).微生物法：[原理] 以一种对青霉素高度敏感的细菌-枯草芽孢杆菌作为指示剂，试验时如果被测细菌株产生青霉素酶，破坏了青霉素，则此高度敏感菌株即可生长，否则，指示剂则被抑制。[方法] 以枯草芽孢杆菌为指示菌，用棉拭子将枯草芽孢杆菌接种于琼脂培养基上，或倾注方法将枯草芽孢杆菌混于琼脂平板内。然后将被测菌与产青霉素酶阳性及阴性对照菌株，按下图接种划线，在琼脂培养基中央放置一含青霉素G（1单位）纸片。放置35℃培养24小时后观察结果。[结果判断] 如被检菌产生青霉素酶，则沿着被测菌处的枯草芽孢杆菌抑菌环出现凹痕(2).碘量法[3] [原理] β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为无色。[方法] ①将0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000ug/ml。取0.1ml
3-内酰胺类抗生素B内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用 专家共识（2020年版） 一、概述 革兰阴性菌及少数革兰阳性菌对3 -内酰胺类抗生素耐药的最重要机制是产 生各种3 -内酰胺酶。3 -内酰胺酶抑制剂能够抑制部分3 -内酰胺酶，避免3 - 内酰胺类抗生素被水解而失活。因此，3 -内酰胺类抗生素/ 3-内酰胺酶抑制 剂复方制剂（简称3 -内酰胺酶抑制剂复方制剂）是临床治疗产3 -内酰胺酶 细菌感染的重要选择。我国临床使用的3 -内酰胺酶抑制剂复方制剂的种类 和规格繁多，临床工作者对该类制剂的特点了解参差不齐，临床不合理使用问题比较突出。 二、主要3-内酰胺酶及产酶菌流行情况 3-内酰胺酶是由细菌产生的，能水解3 -内酰胺类抗生素的一大类酶。3-内 酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有两种： 一、是根据3 -内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），其将3 -内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱 3-内酰胺酶（ESBLs）、头抱菌素酶（AmpC酶）和碳青霉烯酶等； 二、是根据3-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将3 -内酰胺酶分为丝氨酸酶（包括A类、C类酶和D 类酶）及金属酶（B类酶）。目前引用较多的是1995年Bush等基于上述 二种方法建立的分类方法，2019年Bush等又将该分类表进一步完善和细 化（表1）。其中临床意义最大的是下列三类3 -内酰胺酶:
表1常见B-内酰胺酶分类及特点，常见酶抑制剂抑酶活性
1、E SBLs主要属2be\2br\2ber 类酶，是由质粒介导的能水解青霉素类、头抱 菌素及单环酰胺类等B -内酰胺类抗生素的B -内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。根据编码基因的同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、 CTX-M型、OXA型和其他型共5大类型。 2、A mpC酶属C类酶，通常由染色体介导，可以被B -内酰胺类抗生素诱导。部分由质粒介导，常呈持续高水平表达。其对第一、二、三代头抱菌素水解能力强，但对碳青霉烯类抗生素和第四代头抱菌素的水解能力弱。该酶主要存在于肠杆菌 属、柠檬酸杆菌属、普鲁菲登菌属、黏质沙雷菌属和摩根菌属等细菌，非发酵菌