《动物病毒学》实验课
讲稿
任课教师：方六荣
授课对象：2002级动物医学专业1-4班
授课时间：2004.09-2005.01
目录
实验一鸡胚接种 (1)
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 (6)
实验三原代细胞培养 (9)
实验四病毒TCID50的测定 (11)
实验五中和试验 (13)
实验一鸡胚接种
一、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。
二、鸡胚接种的作用
主要用于：
①分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒
②培养病毒，制造抗原和疫苗
③测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验）
④测定病毒毒力
三、材料
1、鸡胚10日龄
2、病毒鸡传染性支气管炎病毒（IBV）
3、照蛋灯
4、打孔器
5、石蜡
6、注射器
7、蛋座
8、酒精棉球、碘酊棉球
四、鸡胚用于病毒培养的优缺点
（一）优点
1、组织分化程度低
2、可选择不同的日龄和接种途径
3、病毒易于增殖
4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒
5、容易采集和处理
6、来源充足
7、设备和操作简便易行
（二）缺点
1、胚内可能污染细菌和病毒
沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒
2、母源抗体
3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
五、鸡胚的结构与功能
1、卵壳上有细孔，进行气体交换
2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。
3、气室呼吸和调节压力
4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。
5、尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中
尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。
6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中
7、卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。
8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
六、受精卵的选择
1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。
2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。
3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
七、鸡胚的孵育
1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃
2、相对湿度：50%-60%
3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后
4、从孵育后第3天开始，每天翻卵一次
八、检卵
自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。
孵育4-5日后即可于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
未受精卵：只见模糊的卵黄卵影，不见血管和鸡胚痕迹
活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以后胎动不明显，甚至无胎动。
死胚：血管昏暗模糊，没有胚动
九、接种前处理
1、用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。
2、对鸡胚进行消毒。
十、接种途径
1、绒毛尿囊膜接种
2、尿囊腔接种
3、卵黄囊接种
4、静脉接种蓝舌病毒
5、羊膜腔接种正粘病毒和副粘病毒
6、脑内接种狂犬病毒
7、眼球接种
（一）卵黄囊接种法
主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。
方法一：
1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上(大头向上)
2）用碘酊和酒精消毒气室端
3）用钢锥在气室中央锥一小孔
4）用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。
5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。
方法二：
1）2）同一
3）将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长径的1/2处用碘酊和酒精消毒。
4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm，注入病毒液0.1-0.5ml
5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，24h内死亡者废弃
（二）绒毛尿囊膜接种
主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
方法一：
1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒
2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口
3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜
4）滴入接种物
5）用胶布或透明胶纸封闭切口
方法二：（要做人工气室）
1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
2、用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。
3、在气室端中央钻一个小孔。
4、用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。
5、用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形
成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。
6、用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用
石蜡密封。
8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三）尿囊腔接种
主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病毒、新城疫病毒的分离和增殖。
1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位
2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒
3、用钢锥穿一小孔
4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接种物
5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。
十一、传染性支气管炎病毒（IBV）接种鸡胚后对鸡胚的影响
IBV一般采用尿囊腔接种
最初几代鸡胚极少发生变化，随着传代次数的增加，鸡胚死亡率增高，鸡胚病变明显，至第10代时，可使80%鸡胚死亡。
病变：
1、鸡胚停止生长，卷曲呈球形，即所谓卷曲胚。
2、羊膜水肿增厚，紧贴鸡胚，尿囊液增量，卵黄囊皱缩，肾中尿酸盐沉着，鸡胚发生肝坏死、肺炎和肾炎。
3、病毒经尿囊腔接种后36h，最高滴度可达107个鸡胚致量。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料
1、绒毛尿囊膜接种收获接种部位绒毛尿囊膜
2、尿囊腔接种收获尿囊液（5-8ml）
3、卵黄囊接种收获卵黄囊或胚体
4、羊膜腔接种收获羊水（0.5-1ml）
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养
一、实验目的
了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类
BHK-21：仓鼠肾传代细胞
PK-15：猪肾传代细胞
IBRS-2：猪肾传代细胞
Hela：人的子宫瘤细胞
Vero：非洲绿猴肾细胞
Marc-145：来源于Vero细胞
TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞
Sf9：昆虫细胞
三、材料
1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头
2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞
3、0.25%胰酶
4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV）
四、传代细胞培养的条件要求
1）细胞密度：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
五、常用细胞分散剂与作用原理
1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水
解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液
1、人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清
1）血清的种类
胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理
无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。
3）血清的作用
A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。
E、给培养液提供良好的缓冲系统。
F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。
4）应用血清存在的问题
A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。
B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。
C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。
七、传代细胞系培养
1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
3、培养方法
1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养
1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。
2、加入适量的病毒悬液
3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。
5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。
实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。
二、材料
1、9-11日龄鸡胚
2、照蛋灯与蛋座
3、碘酊棉球与酒精棉球
4、大剪子、眼科剪、小镊子
5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、
6、胰酶、生长液、维持液
三、细胞培养的条件要求
1）细胞密度
原代细胞：4-6×105个/ml
传代细胞：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
四、操作步骤
1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放
于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。
4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静置几分钟，待组织
块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。
6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感
作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml，用大口径
吸管反复吹打，使细胞游离。
8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。
9、细胞计数
取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于细胞培养瓶中，每
瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
五、结果的观察
于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。
实验四病毒感染力的滴定（TCID50的测定）
一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID
50
的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法
半数致死量LD
50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
○表示可计数
●表示不计数
半数鸡胚感染量EID
(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测
50
（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测
半数细胞培养物感染量TCID
50
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
三、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl。
3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液）
5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
五、TCID50的计算方法
1、Reed-Muench两氏法
CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
lgTCID
50
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
=10-3.8/0.1ml
TCID
50
含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。
2、Karber法
=L-d(s-0.5)
lgTCID
50
L：最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
=-1-1×(3.375-0.5)
lgTCID
50
=-3.875
=10-3.875/0.1ml
TCID
50
含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。
实验五血清中和试验
一、实验目的
了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。
二、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。
三、用途
1、疾病诊断
2、病毒分离株的鉴定
3、不同病毒株的抗原关系研究
4、疫苗免疫原性的评价
5、免疫血清的质量评价
6、测定实验动物血清中是否存在抗体
四、分类
(一) 蚀斑（痘斑）减数试验
将病毒—正常血清混合物以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒—正常血清组和病毒—待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(二) 交叉保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。这一方法的缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。可用于以下几方面：应用已知V鉴定未知V ；应用已知免疫血清鉴定未知V；应用已知V鉴定未知血清。
（三）终点法中和试验
1、固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID50、EID50或LD50）混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。
以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD50）。
2、固定血清——稀释病毒法
在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。
五、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
6、待检血清、PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清
六、操作步骤
1、固定病毒—稀释血清法
1）测定病毒液的TCID50
2）将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。
3）在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50μl生长液，再加50μl待检血清，混匀后，吸50μl至下一孔，如此下去。一直到1∶256），每个稀释度作4孔。
4）在上述各孔内加入50μl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃5%CO2培养箱中作用45min-60min。5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要作200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID504个不同浓度的对照。
6）感作完成后每孔加入100μl细胞悬液，放37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。
7）结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
血清稀释度CPE孔数无CPE孔数
累计
保护率% CPE孔数无CPE孔数
1∶2（10-0.3）0 4 0 15 100（15/15）
1∶4（10-0.6）0 4 0 11 100（11/11）
1∶8（10-0.9） 1 3 1 7 87.5（7/8）
1∶16（10-1.2） 1 3 2 4 66.7（4/6）
1∶32（10-1.5） 3 1 5 1 16.7（1/6）
1∶64（10-1.8） 4 0 9 0 0（0/9）
1∶128（10-2.1） 4 0 13 0 0（0/13）
1∶256（10-2.4） 4 0 17 0 0（0/17）
lgPD50=高于50%的保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差
=-1.2+0.33×(-0.3)
=-1.299
距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/（高于50%的保护率—低于50%的保护率）=（66.7-50）/（66.7-16.7）
=0.33
PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20
即1∶20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。
2、固定血清——稀释病毒法
1）将病毒作连续10倍稀释
2）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl，做两块板子。在其中一块板子的每孔加入50μl待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl正常血清（对照组），混合后置37℃5%CO2培养箱作用1h。
3）然后在每孔中加入100μl细胞悬液。
4）设两纵排正常细胞对照。
5）置37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
6）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。
中和指数=试验组TCID50 /对照组TCID50
如：中和指数=10-4.0/10-7.0 =103.0=1000
判定标准：以待检血精的中和指数大于50者，判为阳性；10-49为可疑；小于10为阴性。
t
一、名词解释： 1. spike 2. DI(defective interfering) 3. Replication intermediate (RI) 4. Plague（噬斑） 5. PFU（噬斑形成单位）、CPE（细胞病变）、隐蔽期 6、信息体（informosome） 7、温度敏感性变异株连 8、抗原漂移与抗原转变 9 准种10、互补11、细胞原癌基因12、干扰素 13、Ribozyme 14、DNA疫苗15单克隆抗体 16法氏囊，网状内皮组织增殖症等（传染病英文翻译成中文） 二、简答题： 1、慢病毒感染的概念及原因（两个方面即病毒方面与机体方面） 2、病毒载体活疫苗的概念并举例说明病毒载体构建的技术路线 3、亚病毒的分类及其定义 4、病毒的特性及其疫苗的研究进展（病毒学） 5、病毒的吸附和侵入过程（分两步）（病毒学） 6、请设计试验方案，如何证明某一种病毒的核酸具有感染性（病毒学） 7、简述病毒对细胞的损害作用方式（病毒学） 8、叙述新病毒出现的机制（病毒学） 9、叙述反转录病毒的复制步骤（病毒学） 10、有几个是写出病毒的英文名称让写出分别属哪科、哪属（不常见的几个） 11、如果一牛场发生布氏杆菌，请制定免疫计划（传染病）？ 12、假如发生烈性传染病如何做？（传染病） 三、论述题
1、详细叙述禽流感病毒的基因组结构，并写出每段基因组所编码的蛋白及其每 种蛋白的功能（病毒学） 2、详细叙述SARS病毒与禽流感病毒在分子水平上的异同（传染病）。 2003年农科院考博题 动物病毒学 一、名词解释 1 DI 2 Antigentic drift 3 感染性cDNA 4 核酸疫苗 5 PFU 6 Ribozyme 7 LTR 8 温度敏感突变株 9 envelope 10 准种 二、简答题 1 类病毒与朊病毒的区别。 2 鉴定新城疫病毒毒力的依据。 3 病毒血凝、血凝抑制作用及血吸附机理。 4 写出下列各科病毒的一种病毒 Herpesviridae, Adenoviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae 5 黄病毒科有几个属，各写出一个病毒。 6 OIE高致病力禽流感病毒的特征。 7 J亚群白血病病毒的致病特点。 三、问答题 1 动物病毒的分离与鉴定过程。 2 以某动物病毒为例，论述研究病毒的分子致病机理的技术路线。 传染病试题可能与中国农大相同 2003年中国农业大学考博试题 微生物试题 1 名词解释： prion 感染性核酸回复突变CTL MAC 合胞体溶原化重组抗体cytokine 2 简答： 缺损病毒微RNA病毒属共有几个科，各种的代表病毒 动脉炎病毒属蛋白特性内源性抗原 胞内菌相关的细胞内免疫抗体产生的动力学 3 论述 阻断ELISA的原理，技术路线，操作，判定 分子生物学诊断技术 外源性抗原的加工过程 2003传染病试题 1 进口动物时应如何做 2 鸡呼吸道疾病的区别 3 子猪肠道疾病的病变 4 非典型猪瘟的控制 5 猪伪狂犬病的种猪场净化 6 从传染病流行的三因素，论述防治措施
《动物病毒学》实验课 讲稿 任课教师：方六荣 授课对象：2002级动物医学专业1-4班 授课时间：2004.09-2005.01
目录 实验一鸡胚接种 (1) 实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 (6) 实验三原代细胞培养 (9) 实验四病毒TCID50的测定 (11) 实验五中和试验 (13)
实验一鸡胚接种 一、实验目的 了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。 二、鸡胚接种的作用 主要用于： ①分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验） ④测定病毒毒力 三、材料 1、鸡胚10日龄 2、病毒鸡传染性支气管炎病毒（IBV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球 四、鸡胚用于病毒培养的优缺点 （一）优点 1、组织分化程度低 2、可选择不同的日龄和接种途径 3、病毒易于增殖 4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒 5、容易采集和处理 6、来源充足 7、设备和操作简便易行 （二）缺点 1、胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒 2、母源抗体 3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
五、鸡胚的结构与功能 1、卵壳上有细孔，进行气体交换 2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。 3、气室呼吸和调节压力 4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。 5、尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中 尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。 6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 7、卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。 六、受精卵的选择 1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。 2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。 3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。 七、鸡胚的孵育 1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 2、相对湿度：50%-60% 3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后
第三篇病毒学实验技术 实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。 实验一实验须知 一、实验室注意事项 1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。 2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。 3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。 4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。 5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。 6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。 7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。 8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。 二、病毒材料收集、运送和保存 （一）材料的收集 分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。 由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。
第三章病毒的遗传和进化 遗传和变异，是生物界不断地普遍发生的现象，也是物种形成和生物进化的基础，而病毒比任何生物都显示了巨大的遗传多样性，这主要是由于病毒没有细胞结构，病毒的基因组极易受外界环境及细胞内分子环境的影响而发生改变，不断地突变、重组和再分配的结果。病毒的遗传能保持物种的相对稳定，维系生物界的平衡；而病毒的变异可导致新品种出现，孕育生物界的进化。 第一节病毒的变异 病毒营无性增殖方式，故在核酸复制时能够产生与原核酸相同的子代基因组，从而保持其遗传性，大多数病毒具有明显的遗传稳定性，如伪狂犬病毒、痘病毒等的抗原性都是相当稳定的。但是病毒没有细胞结构，缺乏独立的酶系统，故其遗传机构所受周围环境的影响尤其是宿主细胞内环境的影响特别深刻；加之，病毒繁殖迅速，可在短期内产生许多世代的大量后代病毒，变异的机率相应增高，这又决定了病毒遗传具有较大的变异性，例如禽流感病毒的抗原性很不稳定，不同年代、不同次的流行所分离的病毒株之间其抗原性都有差异。其它性状，如病毒的毒力、形态、对理化因素的抵抗力等也经常发生变异。总的来说，病毒的遗传是相对的，而变异才是绝对的。 一、突变的概念 核酸是遗传变异的物质基础，病毒的变异大多是核酸的排列组合发生了不同于原来状态的变化，也就是在核酸复制过程中，碱基因某种原因发生位置或组成上的错误，例如置换、易位、重复、缺失等，因而产生了不符于原核酸分子的错误核酸，即所谓的突变（mutation)是指基因组中核酸碱基顺序上的化学变化，可以是一个核苷酸的改变，也可为上百上千个核苷酸的缺失或易位。 错误核酸中，多数不再能够构成完整的病毒粒子，也不能继续进行自我复制，所以许多突变是致死性的。但也有一部分错误核酸，不仅能够组成病毒粒子，而且在病毒粒子增殖时将这种改变了的结构遗传下去，属于非致死性的。除极少数病毒突变株能够适应环境选择外，大多数突变对病毒本身是致命的，不再具有存活和复制的能力。 二、病毒突变的类型 病毒突变的类型可分病毒的基因组变异及表型变异，后者表现为病毒颗粒的理化特性或复制性质的改变。 1、基因组变异 在核酸的变化中，有可能是单个核苷酸也可能是一段核苷酸发生变化，以单个核苷酸的
第五章病毒感染的检测与防治 病毒感染：指病毒侵入体内并在靶器官细胞中增殖，与机体发生相互作用的过程。 病毒侵入机体是否引起发病，主要取决于病毒的毒力和宿主的抵抗力（包括特异性和非特异性免疫因素），而且二者的相互作用受到外界各种因素的影响。 为什么对于病毒性疫病，“重在预防”而非治疗？迄今，对病毒感染的治疗药物效果远不如抗生素等对细菌感染的疗效，因此对病毒感染的诊断与预防工作显得尤为重要。 第一节病毒感染的检测 病毒检测对于病毒研究和病毒病的诊断十分重要。动物病毒性疾病的确诊通常必须依赖于实验室的检测。动物病毒感染的实验室检测（病毒学诊断）通常有三种方法： ①病毒的分离与鉴定（最经典的手段，要实现对病毒的分离，具体还包括病料的采集和准备、接种与培养；对分离病毒的鉴定具体来讲还包括形态学观察、理化特性测定、血清学、动物回归实验、分子生物学鉴定等基本过程。） 除对病毒作分离与鉴定外，动物病毒感染的实验室检测方法还包括： ②病毒的血清学检测（基于病毒抗原与宿主所产生的相应抗体的特异性免疫应答。可用已知特异性抗体检测感染细胞或组织中 的病毒蛋白，也可检测宿主体内对病毒感 染所产生的特异性抗体）； ③病毒核酸的检测（分子检测，可以 检测感染细胞或组织中的具有特定序列的 病毒核酸片段）。 临床诊断应根据流行病学资料、疾病 的症状与体征综合判断可能为何种病毒感 染，留取适宜的标本送检。 一、病毒的分离和鉴定 病毒的检测通常有助于病毒病的诊断，特别是对于新发病毒性传染病而言，尤其重要。 病毒的分离鉴定包括：病毒材料的采集与准备、病毒的分离与培养、病毒的形态学观察，病毒的理化特性测定、病毒的血清学鉴定、动物回归实验及病毒的分子生物学鉴定等基本过程。病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学研究提供材料。但方法复杂、要求严格且需较长时间，故不适合临床诊断，只适用于病毒的实验室研究或流行病学调查。
为什么病毒必须在活的敏感细胞内才能生长繁殖? 答：因为:1病毒本身没有合成蛋白质的场所一核糖体,故必须借助宿主细胞的核糖体合成蛋白质;2由于病毒缺乏完整而又必须的酶,故必须借助细胞的某些酶才能复制;3只有敏感细胞上才有病毒的受体,病毒与受体结合后才能进入细胞内生长繁殖。 简述病毒复制的基本过程。 答：病毒复制的基本过程为:1吸附,即病毒颗粒与细胞膜的受体发生相互作用后病毒颗粒特异性地吸附于宿主细胞表面;2穿入,病毒吸附于宿主细胞膜后以各种不同的方式进入细胞,此即穿入;3脱壳,病毒在宿主细胞内脱去核壳,病毒核酸随后进入细胞的一定部位;4病毒大分子的生物合成,病毒基因组进入宿主细胞后,一方面表达与合成病毒复制过程中所必需的结构蛋白和非结构蛋白,另一方面进行复制合成子代病毒核酸;5装配与释放,病毒核酸与壳体蛋白合成完毕后,在细胞核内或胞浆内装配成熟为病毒颗粒(核衣壳),此即子代病毒体,然后子代病毒体以不同方式从感染细胞中释放到细胞外环境。 简述病毒鉴定的基本原则。 答：鉴定病毒的基本原则包括:根据病毒的生物学特性如病毒的形态、大小与结构等加以鉴定;根据病毒的宿主范围及受染宿主的症状加以鉴定;根据病毒的理化性质如核酸的类型及其对理化因素的抵抗能力等加以鉴定:根据病毒的血清学反应加以鉴定。 流感病毒的快速诊断方法有哪几种? 答：(1)免疫方法检测标本中抗原如IFA、EIA及放射免疫技术均可检测培养物及标本中的抗原。(2)分子杂交检测病毒RNA。 (3)RT-PCR检测培养物及标本中流感病毒RNA,并能进行病毒分型及分亚型。(4)免疫电镜技术。 目前最常用的培养病毒的方法是细胞培养。根据细胞来源和性状的不同可分为三类： (1)原代细胞：新鲜组织经胰酶消化后形成单细胞，加入培养液后37℃培养，数日可贴壁长成单层细胞，即为原代细胞培养。原代细胞经胰酶消化后再传一次即为次代细胞培养。原代细胞培养可用于多种病毒分离和疫苗的制备。但其来源不易是限制其应用的主要原因。 (2)二倍体细胞：是目前最常用的细胞，该细胞可以在体外连续40～50代仍保持23对染色体的特点，故广泛用于病毒的分离和疫苗的制备。 (3)传代细胞：是体外可以无限传代的细胞，来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中发生的变异株。传代细胞可用于病毒的分离、鉴定和研究，但不能用于疫苗的生产。 流感病毒的分离：可采用鸡胚羊膜腔或尿囊腔培养，因其具有血凝素，可收集鸡胚羊水或尿囊液作血凝试验判定病毒是否生长；若阳性可通过血凝抑制试验来鉴定其型别。 抗原漂移：甲型流感病毒亚型内经常发生的抗原结构小变异称为抗原漂移。抗原漂移可引起流感的中、小型流行。抗原转变：甲型流感病毒的血凝素或神经氨酸酶的抗原性发生大变异，形成了新的亚型，称为抗原转变。抗原转变可导致流感的大流行。 为什么流感病毒容易发生变异？ 流感病毒抗原性变异的频率快，其变异主要以两种方式进行：抗原漂移和抗原转变。抗原漂移可引起ha和（或）na的次要抗原变化，而抗原转变可引起ha和（或）na的主要抗原变化。单一位点突变就能改变表面蛋白的结构，因此也改变了它的抗原或免疫学特性，导致产生抗原性的变异体。而当细胞感染两种不同的流感病毒粒子时，病毒的8个基因组片段可以随机互相交换，发生基因重排。通过基因重排有可能产生高致病性毒株。基因重排只发生于同类病毒之间，它不同于基因重组。 从病原学角度解释发生口蹄疫后难以控制的原因。 本病是由口蹄疫病毒引起偶蹄兽的一种急性、热性、高度接触性传染病。特征是口腔黏膜、蹄部和乳房部皮肤发生水疱和烂斑。病原体有以下特点： a.有七个主型A、O、C、南非1、2、3型，亚洲1型，60多个亚型，并不断发现新性的亚型。 b.各型间抗原性不同不能交互免疫，各型之间相互免疫力差，防制困难。 c.各型之间引起的临床症状完全相同。 d.各亚型容易变异，一旦发生一个亚型可能重点暴发又暴发一个新亚型。 e.该病毒毒力大，1g水疱液和皮肤可感染108个病毒
第五章牛羊传染病 一、牛流行热（bovine epizootic fever） P245吴清民P386 概念： 又叫三日热、暂时热，俗称牛流感（其实与流感是两码事），它是由牛流行热病毒引起的一种急性、热性传染病，其特征是起病急骤，病程短促传播迅速，高热，流泪，流涎，鼻痒，呼吸困难，躯体僵直，跛行，发病率高，死亡率低。 本病起源于非洲，现已广泛流行于亚、非及澳洲。在我国是牛的一种重要传染病，虽然死亡率低，但因治疗费用和奶产量降低而造成的经济损失却很大。我国解放前1938年就有，南方比北方严重，北方以河南最严重。 病原： 1.分类地位：单股负链RNA目，牛流行热病毒归弹状科，暂时热属。 2形态特征：子弹状，病毒粒子长130－220nm，单股负链RNA（ssRNA）。有囊膜。 3、体内存在部位：主要存在于发病牛的血清和白细胞中。 4、培养：可在牛源细胞及仓鼠和猴肾细胞上生长。 5、抵抗力：对外界环境抵抗力较强，耐低温，但对温热、酸碱及脂溶剂敏感。 流行病学： 1.易感动物：牛羊均可感染，但只有牛发病，特别是奶牛和黄牛，而且以壮年牛最多见。 其他年龄次之，犊牛较少见。高产牛，怀孕牛发病率最高，病情也重。 2.传染源及途径：病牛是主要的传染源，主要通过吸血昆虫叮咬吸而间接传播。羊为天然 贮宿主，在流行病学上有意义。 3.流行特点：季节性，炎热﹑雨季多见，南方6－10月，北方8－10月份多见。周期性， 3－5年大流行一次。（1954，1958，1966，1970，1976，1983，1988，1991，1995，1997）传播快，流行广，常为流行性或大流行。发病率高，死亡率低，1％以下。 症状： 潜伏期2－7天。突发高烧至40℃以上，恶寒战栗，精神沉郁，不食，反刍停止。流泪，怕光，结膜充血，眼睑水肿，痛苦呻吟。呼吸困难，快而无力，鼻镜干燥，有粘液性鼻涕，呈线状下垂。口腔发炎，流涎，呈泡沫及线状垂挂。全身肌肉及四肢关节疼痛，躯体僵硬，步态不稳。关节肿,跛行或不能站立。皮温不整，末梢发凉。尿量减少，尿液减少，尿液污浊。便秘或腹泻。泌乳停止或减少，孕牛可流产。 发热及病程一般2－3天，很快恢复。部分牛可继发肺炎等而死亡，但一般病死率在1％以下。 病变: 全身肌肉及四肢关节疼痛、躯体僵硬，步态不稳，关节肿胀、跛行或不能站立，皮温不整，末梢发凉。尿量减少，尿液污浊。便秘或腹泻。泌乳停止或减少，孕牛可流产。 发热及病程一般2－3天，很快恢复。部分牛可继发肺炎等死亡，但一般病死率在1％
180 生物学 180.11 生物数学(包括生物统计学等) 180.14 生物物理学 180.1410 生物信息论与生物控制论 180.1415 生物力学(包括生物流体力学与生物流变学等) 180.1420 理论生物物理学 180.1425 生物声学与声生物物理学 180.1430 生物光学与光生物物理学 180.1435 生物电磁学 180.1440 生物能量学 180.1445 低温生物物理学 180.1450 分子生物物理学 180.1455 空间生物物理学 180.1460 仿生学 180.1465 系统生物物理学 180.1499 生物物理学其他学科 180.17 生物化学 180.1710 多肽与蛋白质生物化学 180.1715 核酸生物化学 180.1720 多糖生物化学 180.1725 脂类生物化学 180.1730 酶学 180.1735 膜生物化学 180.1740 激素生物化学 180.1745 生殖生物化学 180.1750 免疫生物化学 180.1755 毒理生物化学 180.1760 比较生物化学 180.1765 应用生物化学 180.1799 生物化学其他学科 180.21 细胞生物学 180.2110 细胞生物物理学 180.2120 细胞结构与形态学 180.2130 细胞生理学 180.2140 细胞进化学 180.2150 细胞免疫学 180.2160 细胞病理学 180.2199 细胞生物学其他学科 180.24 生理学 180.2411 形态生理学 180.2414 新陈代谢与营养生理学 180.2417 心血管生理学 180.2421 呼吸生理学 180.2424 消化生理学
.中国农业科学院博士研究生预防兽医学入学试题近5年考题 2004年传染病 I.兽医生物安全措施包括哪些内容？ 2疯牛病的诊断方法 3.猪瘟强毒的鉴别实验 4.写出下列病原和传播媒介 乙胞，马传贫，莱母病，蓝舌病，非洲猪瘟 5.试述鸡白痢的微生物学诊断方法和净化措施。 问答 1.高致病性AIV的诊断和确诊？我国公布的省市？提岀近期和远期防治措施 2.PRRS的流行特点和防治策略 2005年传染病， 1.高致病性AIV的控制措施 2.简述引起猪繁殖障碍的四种疾病及其区别（病原学，流行病学，剖检） 3.简述引起鸡呼吸系统疾病的四种疾病及其区别 4.简述引起鸡免疫抑制的四种疾病及其区别 论述 1.三种分子生物学诊断方法及其应用 2.如果你在实验室新分离出一-种病原微生物，你将从哪几个方面去研究？ 3.人畜共患病不断出现的原因和措施 一、名词解释 1、抗原肽 2、TNF 3、MHC 4、毒力岛 5、REASSORTMENT 6> MAC 7、核酸疫苗8、 病毒9、条件致死性突变株 二、简答 1、确定病院微生物的致病性的柯赫氏法则的要点 2、B淋巴细胞表而抗原标志BCR组成及其作用 3、单克隆抗体制备过程 4、正粘病毒组成和基因组结构 5、胞内菌感染参与的免役因素 6、病毒分类的机构和依据 ■ 、 1.PRRS产生免役抑制，你认为从何入手说明PRRS对巨噬细胞免役抑制的影响的分子机制（基本研究内容，基本路线，方法手段，结果结论意义） 2.进行动物病毒分子流行病学研究的方法及其应用 一名词解释（3分X10个） 抗原漂移持续性感染慢病毒感染流氏细胞术亚病毒航病毒缺陷性干扰颗粒（注意考题均为英文给出，先翻译后解释） 二简答：lo负链RNA病毒复制过程（5分）2。内源性抗原和外源性抗原递呈过程（5 分）3o 沙门氏菌的鉴定流程（10分） 三问答1。有些疾病一定要用基因工程疫苗来预防，试举2到3例并解释原因。2c PRRSV 能引
第一章 病毒的基本特征与分类 上一节课我们谈到了病毒的本质，病毒的本质是什么？我们可以通过病毒的定义及其特征予以回答。 什么是病毒呢？ 所谓病毒，它是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。其的特征包括5个方面，即病毒形体微小，具有比较原始的生命形态和生命特征，缺乏细胞结构；只含一种核酸，DNA或RNA；依靠自身的核酸进行复制，DNA或RNA含有复制、装配子代病毒所必须的遗传信息；缺乏完整的酶和能量系统；严格的细胞内寄生，任何病毒都不能离开寄主细胞独立复制和增殖。 关于病毒的特征，有几点需要强调和补充。这里所讲的病毒的特征都是针对自然情况下的病毒而言。因为在特定的人工实验条件下，人们已经建立了可使病毒的组成成分——核酸和蛋白质，在无细胞系统下复制并装配成感染性病毒的技术（动物病毒的反向遗传学），例如猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒等等。 在烟草花叶病毒以及随后的动物病毒(如脊髓灰质炎病毒)被提纯为结晶体以后，有人曾怀疑病毒是否还属于生物范畴? 的确，细胞外的病毒，特别是病毒的结晶型，没有新陈代谢，不表现生命活性。但是必须指出，病毒在进入宿主细胞后，病毒核酸迅即启动和复制，并且合成病毒特异的蛋白质，包括酶类，最后产生数量增多的子代病毒，却又表现出明显的生命特征；此外，病毒所呈现的遗传性和变异性，也是证明病毒确实属于生物界。因此，对于病毒我们可以这样认为：病毒具有生命活动型和生命静止型的双重存在形式，即病毒具有生命和非生命两种形式。 b：利福平可抑制痘病毒繁殖
根据单细胞微生物的大小和复杂性可分为：原虫、真菌、细菌、立克次氏体、支原体和衣原体。这些微生物个体微小，结构简单，但仍具有细胞结构。它们有自身DNA携带的遗传信息，同时也含RNA，本身具有产生能量和大分子物质的机制。通过合成自身的大分子物质（核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质）而生长。它们绝大多数通过二分裂进行繁殖。 病毒是自然界最小的生物。所有病毒都只有一种核酸，DNA或RNA。它们与非病毒微生物的区别在于：在其生活周期中，所有病毒都以两种形式存在，在易感细胞外，病毒粒子没有新陈代谢，它是病毒的传播形式，这种形式随着其进入细胞内复制而发生改变，即病毒核酸进入宿主细胞后才具有活性，通过宿主细胞的新陈代谢而产生子代核酸和病毒特异蛋白质，进而装配形成新的病毒粒子，与其它微生物相比，病毒还具有另一特点：许多病毒仅其核酸进入宿主细胞就可复制自身，也就是说，它们的核酸通常具有感染性。相反，其它微生物在整个生活周期中，都由细胞结构组成，含有细胞膜和内部的一些大而复杂的独立的代谢系统，包括线粒体和核糖体等。 第一节病毒的形态与结构 病毒形态是指电子显微镜下见到的病毒的大小、形状和结构。掌握病毒的形态知识，对于认识病毒和发现病毒以及研究病毒与细胞的关系乃至病毒学诊断，都有重要意义。随着电子显微镜(电镜)技术的改进，特别是以磷钨酸为染料的阴性染色法(即负染法)以及X光衍射技术的应用，使我们进一步加深了对病毒粒子形态结构的认识。 病毒是自然界中最小的生物。成熟病毒粒子其大小通常用纳米（nm） 表示，即1/1000微米。病毒个体不仅微小，而且不同类型的病毒大小差异 很大。最大的动物病毒，如痘病毒，直径可达300～450nm，可在普通光学 显微镜下看到，但是绝大多数病毒是超显微镜的。最小的动物病毒，如猪 圆环病毒，病毒粒子大小为14nm～25nm，平均直径17nm ，猪圆环病毒是 迄今发现的一种最小的动物病毒。因此只在发明了电 子显微镜之后，才使病毒成为我们直接观察的对象。 图中属微RNA病毒科，小核糖酸病毒科的口蹄疫病毒， 形态呈球形，病毒粒子直径20～25纳米，无囊膜，单股RNA。