免疫共沉淀操作步骤
免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于
检测特定蛋白与其他分子的相互作用。本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。
一、前期准备
1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提
缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控
制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。
2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲
液裂解细胞膜或组织。
3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确
定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。
二、取样
1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细
胞核。
2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后
续计算抗体的用量。
3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。
三、免疫共沉淀
1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，
使抗体与磁珠形成固定复合物。
2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。
4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。
四、洗涤
1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。
2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。
4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
五、洗脱
1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。
2.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液（洗脱液）小心地转移到新的离心管中。
六、分析结果
1. 将洗脱液用于进一步的分析，如Western blot、质谱等，以确定共沉淀的目标蛋白。
2.根据实验目的和要求，对目标蛋白进行进一步的功能和相互作用研究。
总结：
免疫共沉淀是一种非常有用的实验技术，在研究蛋白的互作关系和功能方面发挥着重要作用。通过严格的实验操作步骤和条件，可以获得高质量的共沉淀样品，并进一步进行分析和研究。但是需要注意的是，免疫共沉淀存在一定的局限性，例如可能存在非特异性结合、特异性抗体选择等问题，因此在实验设计和结果分析中需要谨慎对待。
免疫共沉淀操作步骤 具体步骤： 1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次，最后洗涤完成后吸干PBS液。 2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。 3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入 1.5mlEP 管中，EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min。 4. 4℃，14000g离心15min。 5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。 6. 准备Protein A琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。 *为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。 7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃10min。 *目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。 8. 4℃，14000g 离心15min，将上清转移到一个新的离心管中。 9. 测定蛋白浓度，可选用Bradford法做蛋白标准曲线。 10. 蛋白定量，分装，-20℃保存，可保存1个月。 11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。 12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。 13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。 14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。 15. 14000rpm瞬时离心5s，去上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。 16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。
17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。 18. 将上样样品煮5min。 19. 14000g离心，收集剩余琼脂糖珠。 20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min变性。 21. 上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳。 基础成分 （1）Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分） （2）NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分） （3）NP-40（用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂，用于提取蛋白） （4）去氧胆酸钠（用H2O配置成10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存） *因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠。
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告 步骤一：样品准备 试剂和仪器： Biopulverizer(biospec) 37% formaldehyde 甘氨酸(Glycine) PBS protease inhibitors 步骤二：细胞交联 1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。 2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。 3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。 4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。 5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。800Xg，4°C离心 5min，小心去掉上清。 步骤三：细胞裂解 试剂: 裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%; Tritonx -100 0.25%。 裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。 步骤: 1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。 2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。 3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。 步骤四：超声破碎ＤＮＡ 仪器: Bioruptor(Diagenode) 步骤: (1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。 (2)、在超声池中注入一定量的冰水。 (3)、将上述1.5ml Ep管置于超声固定架中。 (4)、将带有Ep管的固定架放入已注入冰水的超声池中，超声10分钟。(30 seconds “ON” & 30 seconds “OFF”。) (5)、超声完成后，各取25ul直接接交联和纯化(具体操作见后洗脱和纯化步骤)后于2%琼脂糖凝胶电泳。超声后电泳图附件1。
免疫共沉淀操作步骤 免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于 检测特定蛋白与其他分子的相互作用。本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。 一、前期准备 1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提 缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控 制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。 2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲 液裂解细胞膜或组织。 3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确 定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。 二、取样 1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细 胞核。 2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后 续计算抗体的用量。 3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。 三、免疫共沉淀 1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间， 使抗体与磁珠形成固定复合物。
2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。 3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。 4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。 5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。 四、洗涤 1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。 2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。 3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。 4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。 五、洗脱 1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。 2.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液（洗脱液）小心地转移到新的离心管中。 六、分析结果
免疫共沉淀(CO-IP)实验方法与操作步骤 CO-IP是用于检测或探究蛋白与蛋白之间相互作用的实验，属于IP实验的扩展，在样品溶液中，捕获和纯化通过天然相互作用及靶标结合的其他大分子蛋白，基于抗原抗体的特异性免疫结合，以饵蛋白为诱饵蛋白，通过饵蛋白抗体捕获，磁珠吸附结合，进而将饵蛋白结合的互作蛋白捕获得到，纯化定量定性分析。 实验操作步骤： 1.样本准备 组织和细胞是最常见的样本类型。组织用液氮研磨，研磨时少量多次加入液氮，研磨时用研磨杵按住组织旋转研碎，需戴护目镜或是头盔。细胞直接消化或刮下离心，预冷1XPBS清洗1-2次，消化是影响细胞膜表面蛋白构象，尤其是层黏连蛋白和粘附蛋白改变，导致细胞贴壁不牢，进而脱落，对细胞内蛋白影响几乎没有，细胞刮下来也行，虽然存在物理机械损伤，但损伤相基本可忽略。 2.细胞裂解 使用弱裂解液，不要直接用WB裂解蛋白的裂解液，做免疫共沉淀，要保留细胞内天然构建结合，强裂解液会使蛋白变性，弱性裂解液在于表面活性剂，比如NP-40、Triton X-100。
3. 磁珠清洗及抗体孵育 磁珠用之前摇一摇，按照使用量吸取，不要用小枪头，用1ml大枪头，且是无菌无酶，加入适量抗体与buffer，混入磁珠即可。 4. 磁珠-抗体-裂解液孵育 此为核心步骤，磁珠与抗体孵育完成后，buffer清洗3次，加裂解液。清洗是为去除未结合至磁珠表面的游离抗体，防止游离未结合的抗体结合到饵蛋白，降低结合总量。磁珠-抗体复合物清洗完，加裂解液孵育，注意要颠转孵育，不能静置，磁珠是固体，溶液沉降，颠转孵育，不但能使磁珠不沉降，而且使磁珠-抗体与蛋白结合更充分全面。放置4℃，颠转过夜。 5.清洗纯化磁珠-抗体-蛋白复合物 关键步骤，需清洗6次，清洗少了会导致假阳性，清洗次数过多结合蛋白损失大，清洗时要用两种buffer，一种低盐，一种高盐，尽量去除未结合的蛋白，防止假阳性出现。 6.检测 检测分为三种，根据实验目的区分。一是银染：按照input组、目的组、IgG 组、beads组跑胶银染，查看蛋白差异性；二是WB检测：根据预测结合的靶蛋白，进行WB检测，看有无条带，确认是否结合（要做内参）；三是MS（质谱）检测：质谱检测是根据产物蛋白，进行酶解消化成多肽，再测定多肽，获取序列，比对蛋白数据库，查看潜在结合蛋白有哪些，探讨结合蛋白。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤 研究蛋白之间相互作用必不可少的实验是免疫共沉淀(CoIP)，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分，因其具有可信度高的优点，在现在基础医学研究中广泛应用，本文将为您详解CoIP的实验原理和操作步骤，实验刚入门的同学必看哦。 一、实验目的 1)检测两种目标蛋白是否在体内相互作用; 2)找到与目标蛋白在体内存在相互作用的新蛋白。 运用这项技术，说不定你会有新的发现哦! 二、实验原理 CoIP是利用抗原蛋白和抗体的特异性结合、以及“Protein A/G"特异性地结合抗体(免疫球蛋白)FC段的现象开发出来的方法。 目前多用Protein A/G预先结合在Argarose Beads上，使之与含有抗原蛋白的溶液(如细胞裂解液)及抗体(诱饵蛋白X抗体)反应后，Beads上的Prorein A/G就能通过抗体吸附诱饵蛋白X，诱饵蛋白X通过与靶蛋白Y相互作用将其从细胞裂解液中分离出来，从而达到免疫共沉淀的目的。 三、实验材料
细胞、RIPA缓冲液(RIPA buffer)、偶联有Protein A/G的免疫磁珠(Protein A/G Beads)、诱饵蛋白X与靶蛋白Y的抗体、IgG对照抗体、移液枪、4度冰箱以及低温离心机等。 四、实验步骤(不同实验室略有差异) 1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。 2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。 3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。 五、实验心得体会
免疫共沉淀实验原理及详细步骤 免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于确定蛋白质与其他分子（例 如核酸，蛋白质和脂类等）之间的相互作用关系。该方法利用抗体与目标 蛋白结合的特异性，将其与蛋白质一起纯化或检测。下面将详细介绍免疫 共沉淀的实验原理及步骤。 实验原理： 在免疫共沉淀实验中，首先需要利用对目标蛋白高度特异性的抗体经 抗原抵结的方式将目标蛋白与抗体结合。然后将这种特异性抗体抵结的蛋 白（复合体）与抗体相结合的固相支架接触，利用固相支架上特异抗体识 别结合复合体，并通过洗脱和沉淀步骤将目标蛋白纯化或检测。 实验步骤： 1.目标蛋白和抗原抵结：首先需要纯化目标蛋白或从合适的细胞系或 动物模型中提取目标蛋白。将目标蛋白与对其高度特异性的抗体一起孵育，使抗体能够特异性地与目标蛋白结合。 2.制备固相支架：在实验管中加入含有特异抗体的磁珠或琼脂糖等固 相支架。特异抗体可以是直接专一抗体，也可以是经过交联的间接专一抗体。 3.孵育复合体与固相支架：将目标蛋白与抗原抵结后的复合物加入到 含有固相支架的实验管中，并进行充分的振荡孵育，使复合物能够与固相 支架上的抗体结合。
4.洗脱非特异结合物质：通过连续洗涤步骤，将非特异性结合的杂质 分子从固相支架上洗脱。一般可以使用高盐浓度或化学物质（例如尿素或 磺酸盐）来打破非特异结合以保留特异性结合复合体。 5.纯化或检测目标蛋白：通过洗脱步骤，从固相支架上将目标蛋白的 特异性抵结复合物分离出来。这些分离物可以用于进一步的纯化、分析或 检测。 6.质谱分析或其他分析方法：将纯化后的目标蛋白样品进行质谱分析，确定目标蛋白自身和与其相互作用的分子。 总结： 免疫共沉淀实验是一种利用抗体与目标蛋白之间的相互作用来纯化或 检测蛋白质的方法。这种方法可用于确定蛋白质与其他分子之间的相互作 用关系，从而揭示生物学过程中的重要调节机制。免疫共沉淀实验步骤繁多，需要注意实验操作的细节，但也是一个非常有价值和实用的技术。
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程 一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子 8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月） 9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl） 10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
免疫共沉淀实验方法 一、介绍 免疫共沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种常用的实验方法，用于研究 蛋白质相互作用、蛋白质与其他生物分子的结合以及蛋白质的定位等。该方法基于抗体的高特异性与目标蛋白质结合的原理，通过将目标蛋白质与其结合的分子一同沉淀下来，从而实现对目标蛋白质及其相关分子的富集。 二、常用的免疫共沉淀方法 2.1 直接免疫共沉淀 直接免疫共沉淀是最常用的方法之一。该方法需要选择适当的抗体，将其与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。随后，通过添加沉淀剂如蛋白A/G琼脂糖或磁珠，使抗原-抗体复合物与沉淀剂结合，然后经过洗涤步骤去除非特异性结合物， 最后获得目标蛋白质及其结合分子。 2.2 间接免疫共沉淀 间接免疫共沉淀是另一种常用的方法，其优势在于可以使用不同物种的抗体。首先，选择一种抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。然后，通过添加第二种 抗体与第一种抗体结合，形成复合物。随后，将沉淀剂与第二种抗体结合，将目标蛋白质及其结合分子一同沉淀下来。 2.3 交叉免疫共沉淀 交叉免疫共沉淀是一种结合了直接和间接免疫共沉淀的方法。该方法可以同时检测多个蛋白质相互作用或结合的情况。首先，选择多种抗体与目标蛋白质结合，形成多个抗原-抗体复合物。然后，将这些复合物与沉淀剂结合，将目标蛋白质及其结 合分子一同沉淀下来。
三、免疫共沉淀实验步骤 3.1 样品制备 1.收集细胞或组织样品，可以通过细胞培养、动物模型或临床样本等方式获取。 2.将样品进行裂解，可以使用裂解缓冲液如RIPA缓冲液，含有蛋白酶抑制剂 和磷酸酶抑制剂等。 3.离心样品，去除细胞碎片和细胞核等。 3.2 抗体选择 1.根据实验目的选择合适的抗体，可以使用商业提供的特异性抗体或自制抗体。 2.对于直接免疫共沉淀，选择与目标蛋白质结合的一抗体。 3.对于间接免疫共沉淀，选择与目标蛋白质结合的一抗体和第二抗体。 3.3 抗原-抗体结合 1.将抗体与样品中的目标蛋白质结合，可以通过加入抗体到样品中并进行孵育 来实现。 2.孵育时间和温度根据抗体的特性和实验要求进行优化。 3.4 共沉淀步骤 1.添加沉淀剂如蛋白A/G琼脂糖或磁珠到样品中，使抗原-抗体复合物与沉淀 剂结合。 2.孵育样品和沉淀剂的混合物，使复合物与沉淀剂充分结合。 3.使用离心将复合物与沉淀剂沉淀下来。 4.将上清液去除，保留沉淀物。 3.5 洗涤步骤 1.使用洗涤缓冲液如PBS或TBST等进行洗涤，去除非特异性结合物。 2.可以进行多次洗涤，确保将非特异性结合物充分去除。 3.6 溶解沉淀物 1.使用溶解缓冲液如SDS-PAGE样品缓冲液溶解沉淀物。 2.孵育样品和缓冲液的混合物，使沉淀物充分溶解。
免疫沉淀免疫共沉淀 免疫沉淀和免疫共沉淀是常用的免疫学实验技术，用于检测蛋白质间的相互作用以及蛋白质的表达水平。本文将分别介绍免疫沉淀和免疫共沉淀的原理、步骤和应用。 一、免疫沉淀 免疫沉淀是通过抗体的高选择性与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体和结合的蛋白质分离出来。其原理是利用抗体与抗原的特异性结合，形成免疫复合物，并通过沉淀剂使复合物从溶液中沉淀下来。 免疫沉淀的步骤如下： 1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。 2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。 3. 沉淀复合物：加入沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠），使免疫复合物沉淀下来。 4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物。 5. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。 6. 脱离抗体：使用洗涤缓冲液将免疫复合物与抗体分离开。 7. 分析：将沉淀的免疫复合物进行后续分析，如Western blot、质谱等。 免疫沉淀的应用：
1. 确定蛋白质间的相互作用：通过沉淀目标蛋白质及其相互作用的蛋白质，可以鉴定蛋白质间的相互作用关系。 2. 鉴定蛋白质的修饰：通过沉淀修饰蛋白质及其相关蛋白质，可以鉴定蛋白质的翻译后修饰。 3. 确定蛋白质的表达水平：通过沉淀目标蛋白质及其相关蛋白质，可以确定目标蛋白质的表达水平。 二、免疫共沉淀 免疫共沉淀是在免疫沉淀的基础上进行的一种技术，旨在检测蛋白质与其他分子（如蛋白质、RNA）之间的相互作用。其原理是利用抗体与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体、目标蛋白质以及与其相互作用的分子沉淀下来。 免疫共沉淀的步骤如下： 1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。 2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。 3. 沉淀复合物：加入沉淀剂，使免疫复合物及其相互作用的分子沉淀下来。 4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物及其相互作用的分子。 5. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。 6. 脱离抗体：使用洗涤缓冲液将免疫复合物与抗体分离开。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤 染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤： 1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。 2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。 3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。 4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。 5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。 6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。 7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。 这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
免疫共沉淀实验方法与操作步骤 免疫共沉淀（Immuno-precipitation，简称IP）是一种用于研究蛋 白质间相互作用的分子生物学技术。该技术主要通过将抗体与蛋白质结合，然后利用纯化方法将其他与该蛋白质相互作用的蛋白质一起沉淀下来。以 下是免疫共沉淀实验的方法和操作步骤： 实验方法： 1.设计实验：首先要明确要研究的目标蛋白质的特性，选择合适的实 验条件和抗体。 2.制备样品：提取和纯化目标蛋白质样品，可以使用细胞裂解、分离 技术等方法获得纯度较高的样品。 3.选择抗体：根据目标蛋白质的性质和已有的文献，选择合适的抗体。可以选择专一性较高的单克隆抗体，或使用多个抗体以增加实验结果的可 靠性。 4.交联抗体：使用足够浓度的亲和素，将抗体与纯化的亲和素交联。 5.准备阻断物：阻断物可以用于防止非特异性结合，在进行共沉淀实 验时添加适量的BSA、奶粉等阻断物。 6.制备阳性对照：在同一实验中添加阳性对照，以验证实验的可行性 及抗体的有效性。 7.孵育样品：将目标蛋白质样品与抗体复合物孵育在特定的缓冲液条 件下，通常需要孵育12至24小时，以确保充分的结合。 8.添加亲和素：添加与抗体结合的亲和素（如蛋白A、蛋白G等）， 使抗原-抗体结合物与亲和素结合。
9.沉淀抗原-抗体复合物：通过添加亲和素的磁珠、琼脂糖或琼脂脂球等材料，将抗原-抗体复合物沉淀下来。 10.洗涤：使用高浓度的洗涤缓冲液，将非特异性结合和杂质物质洗掉。 11.洗涤完毕后，用洗涤缓冲液再洗30s,然后将磁珠用有效药液（如样本缓冲液）悬浮。 12.洗涤和沉淀：重复洗涤步骤2至3次以增加纯度，然后使用洗涤缓冲液将沉淀的样品转移到新的离心管中。 13.洗涤完毕后，去除冗余的缓冲液。 14.脱附和洗脱：使用脱附缓冲液将目标蛋白质从磁珠上脱附下来。 15.分析和检测：将洗脱的蛋白质样品用于Western blotting、质谱分析等方法进行进一步的研究和检测。 操作步骤： 1.将目标蛋白质样品溶解在特定的细胞裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。 2.将裂解液中的蛋白质沉淀下来，并将上清液移至新的离心管中。 3.用一个专一性较高的抗体与目标蛋白质结合，通过交联抗体将抗体固定在琼脂糖磁珠上。 4.将琼脂糖磁珠悬浮在上清液中，孵育12至24小时，以便与目标蛋白质结合。 5.使用磁场将磁珠从上清液中分离出来，并将上清液吸附掉。
免疫共沉淀详细操作方法 一、准备实验材料和试剂 1.细胞培养基和细胞培养酶：根据实验需要选择不同种类的培养基和酶。 2.细胞系：选择适当的细胞系，如HEK293T细胞等。 3.抗体：选择特异性强、亲和力高的单克隆或多克隆抗体。 4. 蛋白提取缓冲液：例如，含10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、0.5% NP-40等。 5.磷酸盐缓冲液：例如，PBS（含1.5mMKH2PO4、 6.5mMNa2HPO4、 137mMNaCl、2.7mMKCl，pH7.4）。 6. 免疫共沉淀缓冲液：例如，含50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0.5% NP-40、5%甘油。 7.带有亲和树脂的免疫沉淀缓冲液：例如，蛋白A或蛋白G亲和树脂结合的PBS。 二、细胞处理和蛋白质提取 1.培养细胞：将细胞培养在合适的培养基中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养至适当的细胞数。 2.细胞刺激：根据实验需要，将细胞进行刺激处理，如药物刺激、细胞因子刺激等。 3.细胞裂解：将培养的细胞用蛋白提取缓冲液裂解，放在冰上离心，使细胞溶解并得到细胞裂解液。
4.蛋白质含量测定：使用BCA或其他合适的方法测定细胞裂解液中蛋白质的含量。 三、制备免疫复合物 1.免疫数据：将所需的抗体预先装载到蛋白A或蛋白G亲和树脂上。 2.预清洗亲和树脂：将亲和树脂与免疫共沉淀缓冲液混合，使其均匀混合，然后以适当的速度离心，去除上清液。 3.免疫共沉淀：将适当量的蛋白质样品加入预清洗的亲和树脂和免疫共沉淀缓冲液中，使其充分混合，并以适当的速度旋转培养，使抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物。 4.温和洗涤：使用免疫共沉淀缓冲液轻轻洗涤免疫复合物，以去除非特异性结合的蛋白质。 四、蛋白质沉淀 1.洗涤亲和树脂：使用洗涤缓冲液多次洗涤亲和树脂，以去除非特异性结合的蛋白质。 2. 洗涤缓冲液：例如，含50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% Triton X-100。 3.蛋白质沉淀：使用洗涤缓冲液沉淀免疫共沉淀的蛋白质，离心并去除上清液。 4.洗涤过程：对于高亲和性复合物，重复洗涤步骤2~3多次，以去除任何非特异性结合。 五、热解和电泳
免疫共沉淀实验方法 免疫共沉淀实验方法是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，通过利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合来寻找与目标蛋白相互作用的蛋白质。下面将详细介绍免疫共沉淀实验方法的步骤和注意事项。 步骤一：制备样品 首先需要制备含有目标蛋白的样品，可以是细胞提取物、组织提取物或纯化的蛋白。样品需要在低温下保存，并在实验前加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以保持蛋白的完整性。 步骤二：制备抗体 制备抗体需要选择与目标蛋白特异性结合的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体需要在低温下保存，并在实验前进行免疫球蛋白纯化和浓度调整。 步骤三：免疫共沉淀实验 1. 将制备好的样品加入到含有抗体的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
2. 将混合物加入到预先平衡好的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。 3. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 4. 重复步骤3，洗涤3次。 5. 加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 6. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 7. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 8. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 9. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
10. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 11. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 12. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 13. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 14. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 15. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 16. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。 17. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤 免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物 学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地 沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。本文将详细介绍免疫共沉淀实 验的原理及步骤。 免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特 异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。该实验主 要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性 的抗体与目标蛋白质结合。2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体 结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除 非特异性结合的蛋白质和杂质。4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体 中释放出来，以进行后续的下游分析。 1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行 必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。可以选择不同条件下 的实验处理组和对照组进行对比。同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。 2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。抗体可以是单克 隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。此外，需要选择适当的免疫 沉淀试剂盒，确保实验的准确性。 3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。为确保抗原-抗 体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。
4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。 5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。 6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。释放步骤可以采用一些常用的方法，例如酸性或碱性洗涤，加入适当的洗涤缓冲液进行洗涤等。 7. 下游分析：释放的目标蛋白质可以进行下游分析，如Western blot、免疫组化、质谱分析等，以对蛋白质进行鉴定和分析。 总结： 免疫共沉淀实验是一种用于检测和分离复合物中的特定蛋白质的重要实验方法。实验原理以抗体与特定蛋白质的特异性结合为基础，通过抗体的柱色层析或特效筛选柱等方法将目标蛋白质及其相关复合物保留下来，并通过洗涤和释放等步骤进行后续分析。免疫共沉淀实验在生物学研究中具有广泛的应用前景，可用于研究蛋白质的相互作用、复合物的组装和调控等方面的研究。
免疫共沉淀详细步骤 1.准备样品：首先，准备含有目标蛋白质的细胞提取物或纯化的蛋白质样品。样品的制备通常包括细胞培养、细胞裂解和蛋白质提取等步骤。 2.预处理样品：根据实验需要，对样品进行预处理。例如，可以使用蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂来避免蛋白质的降解或被磷酸化。此外，也可以通过交联反应来固定蛋白质与其相互作用的分子，以增加免疫共沉淀的稳定性。 3.选择适当的抗体：根据目标蛋白质的特异性，选择适当的单克隆或多克隆抗体。这些抗体可以是经过商业购买的，也可以是实验室自行制备的。 4.免疫沉淀：将适当的抗体与蛋白质样品混合，形成免疫复合物。为了增加抗原与抗体的结合效率，可以在混合物中添加增强抗体结合的缓冲剂，如牛血清白蛋白（BSA），牛血清或鱼籽酸-Na等。将混合物孵育在4°C下，允许抗体与抗原结合。 5.加入固相支持：免疫复合物通常不稳定，为了将其固定，需要将其与固相支持材料结合。常用的固相支持材料包括蛋白A/G琼脂糖或抗体包被的琼脂糖小珠。将适当量的支持材料添加到混合物中，并在4°C下搅拌孵育一段时间，以允许免疫复合物与支持材料结合。 6.沉淀：将混合物通过离心使免疫复合物沉淀到底物质上，将上清液去除。 7.洗涤：用洗涤缓冲液多次清洗底物质来除去非特异性的结合物质，以提高纯度。洗涤缓冲液的成分可以根据实验样品的特点和所用抗体的特性来调整。
8.洗涤后处理：根据实验需要，可以加入洗涤后处理剂，如酶解抑制剂、的士速根-Na、蛋白酶抑制剂等。 9.构建免疫复合物：为了从固相支持上解离免疫复合物，可以使用低pH或高盐浓度的洗涤缓冲液。免疫复合物被解离后，可以用于进一步的分析，如免疫印迹、质谱分析等。 10. 分析：通过适当的方法对免疫复合物进行分析。常用的分析方法包括SDS-、Western blot、质谱分析等。 免疫共沉淀方法在蛋白质相互作用研究中具有重要的应用价值。在实验过程中，需要注意的是选择适当的抗体和固相支持材料，以及适当的控制实验条件，如反应时间和温度等。通过合理设计和严谨实验操作，可以获得准确、可靠的结果，从而进一步了解蛋白质复合物在生物学过程中的功能。
免疫共沉淀技术实验步骤 免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。 实验步骤详解： 一、细胞总裂解液的制备 ①转染后24h收集细胞，1400r X 3min，4°C离心，弃去上层培养基 ②冰上静置裂解细胞，加入预冷的非变性裂解液NETN(20mMpH8.0Tris HCl,100mMNaCl,1 mMEDTA,0.5% Nonidet P-40)吹打混匀，冰上静置10-15min。注意NETN用时要现加蛋白酶抑制剂，通常是Leupeptin和Aprotinin这两种(终浓度为1ug/ml) ③12000 x 5-10min, 4°C离心 ④将离心后的上清液转移至新的EP管内，每管转移的量保持一致，注意不要吸到底部沉淀，全程冰上操作 二、免疫共沉淀 ①留取20ul左右细胞裂解的上清液加2 x loading buffer煮5min，作为input组 ②提前将琼脂糖凝珠(S beads)均分至新的EP管内，要使用剪
去了尖头的枪头吸取beads，且保证每管里的beads量一致，小心吸去上清液，加入A蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括 1:1的 S beads与2ug A蛋白抗体 ③4°C摇床孵化2-4h(期间可以配制SDS-PAGE胶，准备下一步Western blotting) ④Binding结束，1400r x 1min, 4°C离心 ⑤真空泵或移液枪吸去上清，注意不要吸到沉淀，加入800ul NETN，上下颠倒混匀，保证底部的沉淀悬浮起来 ⑥离心，重复4)5)，洗beads三次 ⑦最后一次弃去上清，用点样枪头将残液吸净，加15ul 2xloading buffer煮5min，作为Co-IP组点样，剩下的沉淀再次加入10ul 2 x loading buffer煮一次，作为IP组点样。 三、Western blotting检测 ①点样顺序通常按照Co-IP组、Input1、Marker、IP组、Input2，跑胶。 ②转膜，封闭后Co-IP组、Input1加入蛋白B的抗体，IP组、Input2加入蛋白A的抗体4°C进行孵育。 ③回收一抗，室温孵二抗。 ④显影，观察实验结果。
免疫共沉淀的详细步骤及方法 1.实验准备 在进行免疫共沉淀实验前，需要准备实验所需的材料和试剂。这些材料和试剂包括：抗体，控制抗体，细胞提取液，蛋白质提取缓冲液，蛋白质裂解缓冲液，洗涤缓冲液，沉淀缓冲液，蛋白质样品等。 2.细胞提取及蛋白质提取 收集待测细胞，用适当的缓冲液洗涤细胞，并用蛋白质提取缓冲液提取细胞内的蛋白质。可利用机械或化学方法破裂细胞膜，释放细胞内的蛋白质。 3.预清洗和前处理 将蛋白质提取物进行预清洗，以去除非特异性结合物和杂质蛋白质。预清洗通常包括四次的离心洗涤步骤，使用洗涤缓冲液。 4.抗体交联 将抗体与蛋白质提取物进行交联。将目标抗体或控制抗体与预清洗后的蛋白质提取物特异性结合，并通过化学或免疫学方法交联两者。 5.免疫沉淀实验 将交联后的样品经过免疫沉淀实验。将抗体/蛋白质复合物与蛋白质A/G琼脂糖珠或其他免疫沉淀剂结合，使复合物与琼脂糖珠发生特异性结合。 6.洗涤和收集
将免疫沉淀后的琼脂糖珠用洗涤缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合物质。洗涤次数通常为3-5次，每次洗涤约10分钟。 7.热处理和蛋白质裂解 将洗涤后的琼脂糖珠在蛋白质裂解缓冲液中进行热处理。将琼脂糖珠加入含有蛋白酶抑制剂和变性剂的裂解缓冲液中，使蛋白质从琼脂糖珠上释放出来。 8. SDS-和Western Blot分析 使用SDS-技术对裂解后的蛋白质进行分离，然后进行Western Blot 分析。Western Blot分析是通过将蛋白质转移到膜上，并使用特定的抗体进行探测，来检测特定蛋白质。 9.数据分析 根据Western Blot结果来分析免疫共沉淀实验结果。可以通过探测特定蛋白质的存在与否，以及与其他蛋白质的互作情况来推断蛋白质间的相互作用或复合物的形成。 总结 免疫共沉淀是一种广泛应用于研究蛋白质结构和功能的实验技术。其详细步骤包括：细胞提取和蛋白质提取，预清洗和前处理，抗体交联，免疫沉淀实验，洗涤和收集，热处理和蛋白质裂解，SDS-和Western Blot 分析，以及数据分析。通过免疫共沉淀实验，可以研究蛋白质的相互作用和复合物的形成，从而深入了解蛋白质的功能和调控机制。
免疫共沉淀C o-I P实 验操作步骤 ------------------------------------------作者 ------------------------------------------日期
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤 一、原理： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)
免疫共沉淀步骤 在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。 Input是断裂后的基因组DNA,需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP 的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。 1.1.1免疫沉淀 1)蛋白提取 (1)取10盘长满10cm大皿的HepG2细胞，弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞3次，吸净PBS残液。 (2)加预冷的裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)至培养皿中(每 皿500-1000ul),冰上孵育30min。
(3)用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4c离心13,000 g,10min。 (4)将上清移至新离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期研究。 2)准备磁珠 (1)将proteinA和proteinG珠子分别摇晃5min混悬，各吸取50ul珠子到 1.5mlEP管中，组成100ul珠子混合物。 (2)小离心机离心20-30s,去上清。 3)结合抗体 (1)将肝细胞癌患者血清20ul和200ulAbBinding& WashingBuffer加入上述EP管中。 (2)室温旋转10min孵育。 (3)小离心机离心20-30s,去上清。 (4)力口入200ulAbBinding&WashingBuffer,轻柔吹打重悬珠子。 4)免疫沉淀 (1)将上述EP管离心，去上清。 (2)取5ml蛋白裂解液轻柔吹打重悬珠子-抗体复合物。 (3)室温旋转孵育30min(将抗原结合到珠子-抗体复合物上)。 (4)离心机离心20-30s,将上清吸入干净离心管备用。 (5)使用200ulWashingBuffer清洗珠子-抗体-抗原复合物3 次，即轻柔重悬、离心去上清3次。 (6)100ulWashingBuffer重悬珠子-抗体-抗原复合物，将混悬液移至干净EP