免疫共沉淀质谱
免疫共沉淀质谱（IP-MS）是一种常用的蛋白质相互作用分析技术，它结合了免疫沉淀和质谱分析技术，能够高效准确地鉴定蛋白质相互作用。该技术已经被广泛应用于生物医学研究、药物发现和疾病诊断等领域。
一、免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术是一种基于抗体特异性识别目标蛋白质的方法。该方法通常包括以下步骤：首先，将含有目标蛋白质的细胞或组织裂解，得到蛋白质混合物；然后，将抗体与蛋白质混合物共同孵育，使抗体与目标蛋白质结合形成复合物；接着，使用磁珠或琼脂糖等材料将复合物捕获下来，去除非特异性结合的蛋白质；最后，通过洗涤和洗脱等步骤，将目标蛋白质从复合物中分离出来。
二、质谱技术
质谱技术是一种分析化学技术，通过对分子的质量和荷质比进行测定，可以确定化合物的分子结构和组成。质谱技术主要包括样品制备、离子化、质谱分析和数据解析等步骤。其中，离子化是质谱技术的关键步骤，常用的离子化方法包括电子轰击、化学电离、电喷雾离子化和激光诱导离子化等。
三、IP-MS技术
IP-MS技术是将免疫共沉淀和质谱技术结合起来的一种方法，它可以用于鉴定蛋白质相互作用和蛋白质复合物的组成。IP-MS技术的基本步骤如下：首先，使用抗体将目标蛋白质与其相互作用的蛋白质
共沉淀下来；然后，将共沉淀物进行质谱分析，得到蛋白质的质量和荷质比信息；最后，通过数据解析，确定蛋白质相互作用和复合物的组成。
IP-MS技术具有以下优点：
1. 高通量：可以同时分析数百个蛋白质相互作用和复合物的组成。
2. 高灵敏度：可以检测到低浓度的蛋白质相互作用和复合物。
3. 高特异性：通过选择合适的抗体，可以特异性地识别目标蛋白质和其相互作用的蛋白质。
4. 无需标记：与其他蛋白质相互作用分析技术相比，IP-MS技术不需要将样品标记，避免了标记对实验结果的影响。
IP-MS技术在生物医学研究、药物发现和疾病诊断等领域已经得到广泛应用。例如，IP-MS技术可以用于鉴定药物靶点和药物作用机制，帮助新药的研发和临床试验。此外，IP-MS技术还可以用于发现新的蛋白质相互作用网络和信号通路，为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。
总之，IP-MS技术是一种高效准确的蛋白质相互作用分析技术，已经成为生物医学研究和药物发现的重要工具。随着技术的不断发展和完善，IP-MS技术将在更广泛的领域得到应用，并为人类健康和疾病防治做出更大的贡献。
免疫共沉淀-质谱联用技术 免疫共沉淀-质谱联用技术是一种重要的分析技术，它将免疫共沉 淀与质谱分析相结合，可以用于研究蛋白质相互作用、信号传导、酶 反应等生物学过程中的分子机理及其相关信号路径。该技术的应用越 来越广泛，已成为分子生物学和蛋白质组学研究中常用的工具之一。 免疫共沉淀-质谱联用技术基于免疫学的原理，即利用特异性抗体 与靶分子结合形成复合物，从而寻找它的内在结构和功能。与传统的 免疫共沉淀技术相比，免疫共沉淀-质谱联用技术可以对复合物进行更 准确更全面的鉴定，可鉴定中小分子的低丰度蛋白质，可以同时定位 蛋白质间的交互作用位点，还可以鉴定非蛋白质结合的水平等。 在免疫共沉淀过程中，首先选择具有高度特异性和亲和力的抗体，将其结合到磁珠、琼脂或凝胶上，然后在固相处将蛋白质样品加入， 与其形成复合物。随后，采取磁分离或离心沉淀的方法，将复合物分 离出来，并用冲洗液彻底清除杂质物。最终，将复合物洗脱，进行蛋 白质鉴定和分析。
质谱分析是在该技术中不可或缺的部分，它可为免疫共沉淀提供有关复合物的定量和定性信息。与传统的海绵声压提示法不同，免疫共沉淀-质谱联用技术使用质谱仪可以利用靶蛋白质的特定段序列进行定量和高效蛋白质鉴定。最常用的质谱技术包括MALDI-TOF/TOF-MS和LC-MS/MS两种。 MALDI-TOF/TOF-MS技术是一种高定量、高灵敏度的质谱技术，可以用于鉴定复合物中的大部分蛋白质，并可以提供与上下游交互蛋白质的定位。同时，它具有较高的通量和分析速率，可以在短时间内处理大量样品。 LC-MS/MS技术具有高通量、高灵敏度和高分辨率的优点，因此是鉴定复杂蛋白质混合物的理想选择。在免疫共沉淀-质谱联用技术中，LC-MS/MS通常与反向相色谱技术结合，以进一步提高检测灵敏度和分辨率。 总的来说，免疫共沉淀-质谱联用技术是一种用于鉴定蛋白质相互作用的非常有效的技术，可以提供有关蛋白质的定量和定性信息，广泛应用于分子生物学、蛋白质组学、药理学等领域。随着技术的不断发展和完善，该技术的应用前景将更加广阔。
免疫共沉淀质谱 免疫共沉淀质谱（IP-MS）是一种常用的蛋白质相互作用分析技术，它结合了免疫沉淀和质谱分析技术，能够高效准确地鉴定蛋白质相互作用。该技术已经被广泛应用于生物医学研究、药物发现和疾病诊断等领域。 一、免疫共沉淀技术 免疫共沉淀技术是一种基于抗体特异性识别目标蛋白质的方法。该方法通常包括以下步骤：首先，将含有目标蛋白质的细胞或组织裂解，得到蛋白质混合物；然后，将抗体与蛋白质混合物共同孵育，使抗体与目标蛋白质结合形成复合物；接着，使用磁珠或琼脂糖等材料将复合物捕获下来，去除非特异性结合的蛋白质；最后，通过洗涤和洗脱等步骤，将目标蛋白质从复合物中分离出来。 二、质谱技术 质谱技术是一种分析化学技术，通过对分子的质量和荷质比进行测定，可以确定化合物的分子结构和组成。质谱技术主要包括样品制备、离子化、质谱分析和数据解析等步骤。其中，离子化是质谱技术的关键步骤，常用的离子化方法包括电子轰击、化学电离、电喷雾离子化和激光诱导离子化等。 三、IP-MS技术 IP-MS技术是将免疫共沉淀和质谱技术结合起来的一种方法，它可以用于鉴定蛋白质相互作用和蛋白质复合物的组成。IP-MS技术的基本步骤如下：首先，使用抗体将目标蛋白质与其相互作用的蛋白质
共沉淀下来；然后，将共沉淀物进行质谱分析，得到蛋白质的质量和荷质比信息；最后，通过数据解析，确定蛋白质相互作用和复合物的组成。 IP-MS技术具有以下优点： 1. 高通量：可以同时分析数百个蛋白质相互作用和复合物的组成。 2. 高灵敏度：可以检测到低浓度的蛋白质相互作用和复合物。 3. 高特异性：通过选择合适的抗体，可以特异性地识别目标蛋白质和其相互作用的蛋白质。 4. 无需标记：与其他蛋白质相互作用分析技术相比，IP-MS技术不需要将样品标记，避免了标记对实验结果的影响。 IP-MS技术在生物医学研究、药物发现和疾病诊断等领域已经得到广泛应用。例如，IP-MS技术可以用于鉴定药物靶点和药物作用机制，帮助新药的研发和临床试验。此外，IP-MS技术还可以用于发现新的蛋白质相互作用网络和信号通路，为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。 总之，IP-MS技术是一种高效准确的蛋白质相互作用分析技术，已经成为生物医学研究和药物发现的重要工具。随着技术的不断发展和完善，IP-MS技术将在更广泛的领域得到应用，并为人类健康和疾病防治做出更大的贡献。
免疫共沉淀质谱 免疫共沉淀质谱是一种重要的蛋白质相互作用研究技术，可以用于鉴定蛋白质间的相互作用关系和寻找新的蛋白质交互伙伴。本文将介绍免疫共沉淀质谱的原理、步骤、优缺点及应用。 一、原理 免疫共沉淀质谱是利用抗体对目标蛋白进行免疫沉淀，然后通过质谱技术分析沉淀物中的蛋白质组成，以鉴定目标蛋白的交互伙伴。该技术可以分为两个步骤：免疫共沉淀和质谱分析。 免疫共沉淀是将抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。然后通过抗体的特异性，将该复合物沉淀下来，同时也将与之结合的蛋白质一同沉淀下来。这样就可以得到含有目标蛋白及其交互伙伴的复合物。 质谱分析是将免疫共沉淀得到的复合物进行蛋白质分析，利用质谱技术鉴定复合物中的蛋白质组成及其相互作用关系。常用的质谱技术包括质谱图谱法、时间飞行质谱法、离子阱质谱法等。 二、步骤 免疫共沉淀质谱的步骤如下： 1. 样品制备：将需要研究的样品提取出蛋白质，并经过必要的处理，如蛋白质定量、蛋白质电泳等。 2. 免疫共沉淀：将抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。然后将该复合物通过抗体的特异性沉淀下来。 3. 洗涤：用洗涤缓冲液将非特异性蛋白质清洗掉，以减少假阳
性的出现。 4. 洗脱：用洗脱缓冲液将蛋白质从沉淀物中洗脱出来，得到免疫共沉淀得到的复合物。 5. 质谱分析：将免疫共沉淀得到的复合物进行质谱分析，以鉴定复合物中的蛋白质组成及其相互作用关系。 三、优缺点 免疫共沉淀质谱具有以下优点： 1. 可以鉴定蛋白质间的相互作用关系，寻找新的蛋白质交互伙伴。 2. 可以在生理条件下进行研究，获得更真实的结果。 3. 可以针对不同种类的蛋白质进行研究，不受蛋白质分子量和结构的限制。 4. 可以进行定量分析，确定蛋白质间的相互作用强度。 但是，免疫共沉淀质谱也存在一些缺点： 1. 可能存在假阳性和假阴性的情况，需要进行验证。 2. 该技术需要特异性较高的抗体，且抗体的质量和纯度对结果影响较大。 3. 该技术需要较高的技术要求，对操作人员的经验和技能要求较高。 四、应用 免疫共沉淀质谱在生命科学研究中有广泛的应用，可以用于研究蛋白质的相互作用关系、信号通路、疾病机制等方面。以下是一些应
免疫共沉淀实验原理及详细步骤 免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于确定蛋白质与其他分子（例 如核酸，蛋白质和脂类等）之间的相互作用关系。该方法利用抗体与目标 蛋白结合的特异性，将其与蛋白质一起纯化或检测。下面将详细介绍免疫 共沉淀的实验原理及步骤。 实验原理： 在免疫共沉淀实验中，首先需要利用对目标蛋白高度特异性的抗体经 抗原抵结的方式将目标蛋白与抗体结合。然后将这种特异性抗体抵结的蛋 白（复合体）与抗体相结合的固相支架接触，利用固相支架上特异抗体识 别结合复合体，并通过洗脱和沉淀步骤将目标蛋白纯化或检测。 实验步骤： 1.目标蛋白和抗原抵结：首先需要纯化目标蛋白或从合适的细胞系或 动物模型中提取目标蛋白。将目标蛋白与对其高度特异性的抗体一起孵育，使抗体能够特异性地与目标蛋白结合。 2.制备固相支架：在实验管中加入含有特异抗体的磁珠或琼脂糖等固 相支架。特异抗体可以是直接专一抗体，也可以是经过交联的间接专一抗体。 3.孵育复合体与固相支架：将目标蛋白与抗原抵结后的复合物加入到 含有固相支架的实验管中，并进行充分的振荡孵育，使复合物能够与固相 支架上的抗体结合。
4.洗脱非特异结合物质：通过连续洗涤步骤，将非特异性结合的杂质 分子从固相支架上洗脱。一般可以使用高盐浓度或化学物质（例如尿素或 磺酸盐）来打破非特异结合以保留特异性结合复合体。 5.纯化或检测目标蛋白：通过洗脱步骤，从固相支架上将目标蛋白的 特异性抵结复合物分离出来。这些分离物可以用于进一步的纯化、分析或 检测。 6.质谱分析或其他分析方法：将纯化后的目标蛋白样品进行质谱分析，确定目标蛋白自身和与其相互作用的分子。 总结： 免疫共沉淀实验是一种利用抗体与目标蛋白之间的相互作用来纯化或 检测蛋白质的方法。这种方法可用于确定蛋白质与其他分子之间的相互作 用关系，从而揭示生物学过程中的重要调节机制。免疫共沉淀实验步骤繁多，需要注意实验操作的细节，但也是一个非常有价值和实用的技术。
免疫共沉淀质谱 免疫共沉淀质谱（immunoprecipitation-massspectrometry， IP-MS）是一种广泛应用于生物学研究的方法，用于鉴定蛋白质相互 作用的伴侣。该方法结合了免疫沉淀和质谱分析技术，可以从复杂的混合物中鉴定目标蛋白质的相互作用伴侣，从而揭示蛋白质相互作用网络的组成和功能。 本文将介绍IP-MS的原理、步骤和应用，并讨论该技术的优缺点以及未来的发展方向。 一、原理 IP-MS的原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，将其与其相互作用伴侣共同沉淀下来，再用质谱技术检测沉淀物中的蛋白质成分。该方法的关键在于选择合适的抗体，以确保沉淀物中仅含有目标蛋白质及其相互作用伴侣。 通常，IP-MS分为两种类型：单一免疫共沉淀（single IP-MS）和串联免疫共沉淀（tandem IP-MS）。单一免疫共沉淀是指将抗体与 目标蛋白质结合后，直接进行质谱分析。而串联免疫共沉淀则是在单一免疫共沉淀的基础上，将沉淀物再次进行免疫沉淀和质谱分析，以筛选出更加特异的相互作用伴侣。 二、步骤 IP-MS的实验步骤如下： 1. 选择合适的抗体：选择与目标蛋白质结合的特异性抗体，并 进行验证。
2. 免疫沉淀：将抗体与混合物中的目标蛋白质结合，然后添加磁珠或琼脂糖等固相材料，使其与目标蛋白质及其相互作用伴侣结合并沉淀下来。 3. 洗涤：用缓冲液洗涤沉淀物，以去除非特异性结合的蛋白质和杂质。 4. 质谱分析：将沉淀物进行蛋白质分离和消化，并用质谱技术进行分析和鉴定。 5. 数据分析：使用生物信息学工具对质谱分析结果进行分析和解释，以确定目标蛋白质的相互作用伴侣。 三、应用 IP-MS已被广泛应用于生物学研究中，尤其是在蛋白质相互作用网络的研究中。以下是IP-MS的一些应用领域： 1. 鉴定蛋白质相互作用伴侣：通过IP-MS可以鉴定目标蛋白质的相互作用伴侣，从而揭示蛋白质相互作用网络的组成和功能。 2. 研究蛋白质修饰：通过IP-MS可以鉴定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化和乙酰化等。 3. 研究信号转导通路：通过IP-MS可以鉴定信号转导通路中的关键蛋白质和相互作用伴侣，从而揭示信号转导通路的调控机制。 4. 研究药物作用机制：通过IP-MS可以鉴定药物作用的靶标蛋白质和相互作用伴侣，从而揭示药物的作用机制。 四、优缺点 IP-MS具有以下优点：
免疫共沉淀串联蛋白质谱（CoIP-MS）是一种用于研究蛋白质相互作用的重要技术。它通过将特定抗体与靶蛋白质结合，然后利用质谱技术鉴定和分析与该蛋白质相互作用的其他蛋白质，从而揭示细胞内复杂的信号传导网络和蛋白质功能。在本篇文章中，我们将深入探讨CoIP-MS技术的原理、应用和局限性，以及个人对这一技术的理解和看法。 一、CoIP-MS技术原理 1. CoIP原理 免疫共沉淀（Co-IP）是一种将特定抗体与靶蛋白质结合的技术。通过免疫沉淀的方式，来极大程度地富集我们需要的蛋白质。 2. 质谱技术原理 质谱技术是一种通过离子化和加速来测定分子质量的技术。在CoIP-MS中，利用质谱技术鉴定和分析与靶蛋白质相互作用的其他蛋白质。 二、CoIP-MS技术应用 1. 蛋白质相互作用研究
CoIP-MS技术被广泛应用于蛋白质相互作用的研究中。通过对一种蛋白质进行免疫共沉淀，然后利用质谱技术鉴定与其相互作用的其他蛋白质，可以揭示信号传导、细胞周期、转录调控等生命活动的分子机制。 2. 蛋白质功能验证 CoIP-MS技术也可以用于验证蛋白质的功能。通过鉴定与某一特定蛋白质相互作用的其他蛋白质，可以初步推测该蛋白质在细胞内的功能和通路位置。 三、CoIP-MS技术局限性 1. 验证性 由于CoIP-MS技术对蛋白质相互作用的鉴定依赖于抗体的质量和特异性，因此在实际应用中需要进行多次重复实验来验证结果的可靠性。 2. 数据解析 CoIP-MS生成的数据量庞大，需要借助生物信息学和统计学的方法来进行数据解析和筛选，因此在数据分析的过程中存在一定的复杂性和技术门槛。
四、个人理解和看法 对于CoIP-MS技术，我个人认为它是一种非常有价值的蛋白质相互作用研究技术。通过CoIP-MS技术，我们可以全面了解蛋白质的相互作用网络和功能，为生命科学领域的研究提供了强有力的工具。然而，在实际操作中需要注意抗体的选择和数据的解析，以确保结果的可靠性和准确性。 总结回顾： 通过本文的详细介绍，我们对免疫共沉淀串联蛋白质谱（CoIP-MS）技术有了更深入的了解。我们深入探讨了CoIP-MS的原理、应用和局限性，以及个人对这一技术的理解和看法。CoIP-MS技术在揭示蛋白质相互作用和功能方面具有重要意义，但在实际应用中需要注意实验操作和数据解析的细节，以确保结果的可靠性和准确性。 通过以上介绍，我们可以清楚地了解CoIP-MS技术的原理和应用，以及对这一技术的个人看法。希望这篇文章能够对您有所帮助，更深入地理解和应用CoIP-MS技术。CoIP-MS技术的原理和应用在生命科学领域具有重要意义，在进行蛋白质相互作用研究和蛋白质功能验证时起到了关键作用。然而，正如前面提到的，CoIP-MS技术在实际操作中存在一些局限性，需要及时解决和克服。
免疫共沉淀的原理 首先，将所研究的细胞或组织进行裂解。裂解的目的是将细胞或组织的膜以及胞浆部分破坏，释放出蛋白质。裂解的方法一般有机械方法（如超声裂解）和化学方法（如洗涤试剂混合物），目的是破坏细胞或组织的完整性，并使蛋白质均匀地释放出来。 接下来，将抗体固定在一个固相基质上，通常是磁珠或琼脂糖。抗体的选择应基于抗原的特异性和免疫原性。抗体与固相基质结合后，形成抗体-固相复合物。 将抗体-固相复合物与细胞裂解液共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。在共孵育的过程中，由于抗体与目标蛋白质的高亲和力和特异性，抗原与非特异性蛋白质可以通过洗涤步骤有效地清除。 接下来，通过洗涤步骤除去非特异性蛋白质的干扰。洗涤可以利用一系列缓冲液，如含有高浓度盐的缓冲液或非离子表面活性剂。洗涤的目标是去除那些与抗体无关的蛋白质，并增加抗原与抗体之间的特异性结合。 最后，将共沉淀物洗脱并进行鉴定和分析。洗脱步骤的方法通常是用含有高浓度盐的酸性或碱性缓冲液。通过洗脱，将共沉淀物从固相基质上解离，并将其收集。 获得的共沉淀物可通过多种方式进行鉴定和分析。最常见的方法是通过蛋白质质谱分析，通过质谱仪鉴定蛋白质的氨基酸序列，以确认共沉淀物中的蛋白质身份。此外，还可以利用免疫印迹、酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法进行蛋白质的定性和定量分析。 总结起来，免疫共沉淀是一种基于抗体的高亲和力和特异性的免疫学技术，用于检测特定蛋白质与其他细胞或分子之间的相互作用。该技术的
实施步骤包括细胞或组织的裂解，抗体的固相耦联，抗原的结合和洗脱，以及共沉淀物的鉴定和分析。通过免疫共沉淀技术，我们可以更深入地了解蛋白质的相互作用网络，从而揭示细胞内生物过程的分子机制。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤 研究蛋白之间相互作用必不可少的实验是免疫共沉淀(CoIP)，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分，因其具有可信度高的优点，在现在基础医学研究中广泛应用，本文将为您详解CoIP的实验原理和操作步骤，实验刚入门的同学必看哦。 一、实验目的 1)检测两种目标蛋白是否在体内相互作用; 2)找到与目标蛋白在体内存在相互作用的新蛋白。 运用这项技术，说不定你会有新的发现哦! 二、实验原理 CoIP是利用抗原蛋白和抗体的特异性结合、以及“Protein A/G"特异性地结合抗体(免疫球蛋白)FC段的现象开发出来的方法。 目前多用Protein A/G预先结合在Argarose Beads上，使之与含有抗原蛋白的溶液(如细胞裂解液)及抗体(诱饵蛋白X抗体)反应后，Beads上的Prorein A/G就能通过抗体吸附诱饵蛋白X，诱饵蛋白X通过与靶蛋白Y相互作用将其从细胞裂解液中分离出来，从而达到免疫共沉淀的目的。 三、实验材料
细胞、RIPA缓冲液(RIPA buffer)、偶联有Protein A/G的免疫磁珠(Protein A/G Beads)、诱饵蛋白X与靶蛋白Y的抗体、IgG对照抗体、移液枪、4度冰箱以及低温离心机等。 四、实验步骤(不同实验室略有差异) 1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。 2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。 3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。 五、实验心得体会
免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；
3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测； 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：
具体步骤： 1免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation） (1) 培养HEK293FT细胞至90%汇集，将pCMV-Myc-AP-2β用磷酸钙转染法转入HEK293FT细胞中。 磷酸钙转染方法: a.在转染前一天，对于100mm培养皿，每皿用10m1不含抗生素的培养液培养细胞。 b.转染的当天，细胞密度最好达到90-95%，吸掉旧培养液，PBS漂洗一次，换成l0mL无血清无抗生素的培养液。 c. 将待转染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液； d、在不断搅拌振荡过程中，逐滴缓缓地加入到HEPES-磷酸钙溶液中去，形成一种磷酸钙-DNA共沉淀； e.将磷酸钙-DNA 复合物滴加入细胞中，轻轻混匀，常规条件培养。 f.磷酸钙-DNA复合物与细胞接触时间为4-6 h后，换成有血清和抗生素的培养液。 (2)继续培养24h后，用1 x PBS悬浮细胞并用细胞刮收集细胞。 (3)在4 ℃条件下500 g离心23min，弃上清沉淀用RIPA缓冲液重悬。 (4)细胞于-80℃快速冷冻15min，然后于37℃快速融解15min。重复两次。 (5)细胞裂解液超声80秒后在4℃条件下12000r/min离心10 min，上清转移至新管中，每管取出一部分做Western Blot检测，其余的一半加入抗Myc的多抗，另一半加入免疫前血清做阴性对照，反应4h. (6)加入protein-A/G耦连珠子继续在室温反应6h或过夜. (7)在4℃条件下500g离心2 min，弃上清珠子用裂解缓冲液重悬。重复三次。 (8)在第四次洗涤后，珠子用20 u L的加样缓冲液重悬，105 ℃加热5min. (9)进行10%的SDS/PAGE电泳后，将蛋白胶进行银染。 2 蛋白银染和质谱分析样品的制备 2.2. 3.1蛋白银染 电泳结束后,将胶小心取下,双蒸水洗两次,然后进行凝胶染色，银染方法如下： 1.固定液固定2h或者过夜。 2.漂洗液漂洗20min,三次 3.敏压液敏压2min. 4.双蒸水漂洗5min,三次。 5.银染液银染30min. 6.双蒸水漂洗1min,2次。 7.加入显色液显色5~10min. 8.终止液终止。 9.双蒸水漂洗干净，置双蒸水中保存。 3 质谱分析样品的制备: 从胶中切取分辨较好的4蛋白质带, 置于1.5 ml Eppendorf 管中,对染色的蛋白质带分别进行脱色、还原、烷基化、酶解、萃取等处理, 将制备好的样品用于质谱分析. 银染蛋白质点酶解步骤：
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程 一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子
免疫共沉淀结合质谱分析筛选HMGB4相互作用蛋白 王成;赵晓蒙;帅勇;李晓峰;刘喜枝;张晓婷;周畅 【摘要】为揭示HMGB4在精子发生过程中所起的作用,采用免疫共沉淀技术富集NTera-2细胞中的HMGB4 结合蛋白.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对免 疫沉淀复合物进行分离,从胶中切取HMGB4结合蛋白条带,胶内酶解后进行电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)分析,得到相应的肽序列标签(peptide sequence tags,PST).通过搜索数据库在NTera-2细胞系中鉴定到5个HMGB4相互作用蛋白,分别是Pdhal、Keratin 6B、Keratin 5、Actb Actin cytoplasmic 1、RPL18. 为进一步研究HMGB4在精子发生机制中的生理功能提供了基础.%In order to reveal the role of HMGB4 in the process of spermatogenesis, the binding proteins of HMGB4 were enriched in NTera-2 cells using co-immunoprecipitation assay. The immunoprecipitates were separated on 10% SDS-polyacrylamide gel, then the binding proteins were cut from the gel and analyzed by LC-ECI-MS/ MS after the enzymolysis. The corresponding peptide sequence tags(PST) and identified 5 interacting proteins of HMGB4 were obtained in the NTera-2 cells using the database. These interacting proteins, such as Pdhal, Keratin 6B, Keratin 5, Actb Actin cytoplasmic 1, RPL18, established foundation for the further study on physiological functions of HMGB4 in the mechanism of spermatogenesis.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》 【年(卷),期】2012(035)002 【总页数】5页(P71-75)