第五章沉淀技术
学习目标：了解蛋白质的基本性质
掌握蛋白质沉淀的基本原理
掌握沉淀技术的基本方法
能够正确进行蛋白质的沉淀分离方法
第一节蛋白质沉淀的基本原理
沉淀是溶液中溶质由液相变为固相析出的过程。
沉淀技术是通过加入试剂或改变条件,使溶液中的溶质离开溶液生成不溶性颗粒而沉降析出的技术.
第一节蛋白质沉淀的基本原理
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程.此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的.
一蛋白质的溶解性
蛋白质的溶解性是由其组成,构象以及分子周围的环境所决定.影响蛋白质溶解度的主要因素分成蛋白质性质和溶液性质两类.
蛋白质性质的因素有:分子大小,氨基酸序列,可离子化的残基数,极性/非极性残基比率,极性/非极性残基分布,氨基酸残基的化学性质,蛋白质结构,蛋白质电性,化学键性质.
溶液性质的因素有:溶剂可利用度,pH值,离子强度,温度.
二蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质属于胶体分散系统.由于水化膜和双电层着两种稳定的因素,使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液.由于水化膜和双电层的存在,蛋
白质颗粒彼此不能接近,因而增加了蛋白质溶液的稳定性,阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来.
三沉淀动力学
溶解度是一个平衡特性，但是溶解度的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起:口热运动(布朗运动); 2对流运动，由机械搅拌产生:3差速沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中D和@两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，而机理3在沉隆过程中起主导作用(如在废水处理中)。由布朗运动所造成的碰撞导致异向聚集，而由对流运动所造成的碰撞导致同
向聚集。
为了简化沉淀过程的动力学，可把沉淀过程分成下述6 个步骤: @初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合; @晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒; 3扩散限制生长，晶核在布朗扩散作用下生长，生成亚微米大小的核，这一步速度很快: @流动引起的生长，这些核通过对流传递(搅拌) 引起的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在较低的速度下进行的; 5絮体的破碎，破碎取决于它们的大小、密度和机械阻力; 6 聚集体的陈化，在陈化过程中，絮体取得大小和阻力平衡。
第二节蛋白质沉淀技术实施
－、基本方法
蛋白质的沉淀有可逆和不可逆两种。生化分离纯化中最常用的几种蛋白质的沉淀方法是:盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法、等点电沉淀法、有机聚合物沉淀法、聚电解质沉淀法、金属离子沉淀法。
1.盐析法（中性盐沉淀）
盐析法中常用的中性盐有（NH4）2SO4、Na2SO4、NaH2PO4等。
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为“盐溶”；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称为“盐析”。盐析法突出的优点是:①成本低，不需要特别昂贵的热备；②操作简单、安全；③对许多生物活性物质具有稳定作用。常用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
（1）中性盐沉淀蛋白质的基本原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水性基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子和溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。
（2）中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点。①溶解度大；②分离效果好；③不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。④价格便宜，废液可以肥田，不污染环境。
（3）盐析曲线的制作以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵
饱和度作图，即可得到盐析曲线。
（4）盐析的影响因素:①蛋白质的浓度；②pH值；③温度的影响。
2.有机溶剂沉淀法
（1）基本远离有机溶剂对于许多蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是最早使用的沉淀方法之一。其沉淀远离主要是降低溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，因而向有机溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间嗯相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
有机溶剂的优点是:①分辨能力比盐析法高；②沉淀不用脱盐，过滤比较容易。
（2）有机溶剂沉淀的影响因素:①温度，多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。②样品浓度，通常，使用5～20mg／mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到很好的沉淀效果。③pH值，有机溶剂沉淀适宜的pH值。④离子强度。
3.选择性沉淀法
是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
4.等电点沉淀法
用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，此法多与其他方法结合使用。
5.有机聚合物沉淀法
该法主要使用聚乙二醇作为沉淀剂。
6.聚电解质沉淀法
加入聚电解质的作用和絮凝剂类似，同时还兼有一些盐析和降低水化等作用。缺点是往往使蛋白质结构改变。
7.金属离子沉淀法
一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效
8.亲和沉淀法
亲和沉淀是利用亲和反应远离将配基与可溶性载体偶联形成载体－配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择与蛋白质结合，当采用物理场（如pH、离子强度和温度等）改变时发生可逆性沉淀，从而利用目标分子与其配体的特异性结合作用及沉淀分离的原理进行目标分子的分离纯化，是蛋白质等生物大分子的亲型亲和分离技术之一。
二、沉淀工艺及其操作
沉淀方法有多种，沉淀工艺随沉淀方法的不同而不同，沉淀技术在实施过程中，应考虑3个因素:①沉淀方法和技术应具有一定的选择性，以使所要分离的目标成分得以‘很好的分离，选择性越好，目标成分嗯纯度就越高；②对于酶类和蛋白质的沉淀分离，除了要考虑沉淀方法的选择性外，还必须注意所用的沉淀方法对这类目标成分中的活性
和化学结构是否有破坏作用；③对于用于食品和医药中的目标成分，要考虑残留在目标成分中的沉淀剂对人体是否有害，否则所用的沉淀法以及所获得的目标成分都会变得无应用价值。
第三节沉淀技术的应用
沉淀是一个广泛应用于生物产品（特别是蛋白质）下游加工过程的单元操作。
沉淀技术分离蛋白质的主要特点是：1.浓缩速度快 2.产物稳定性得到提高 3.可以作为其他分离方法的前处理
盐析法分离血清中各主要蛋白质组分的例子：
低饱和共沉淀法 低饱和共沉淀法，按照一定的比例，将金属硝酸盐溶液配成一定浓度的混合盐溶液（SolS），将NaOH和Na2CO3按照一定比例的配成混合碱溶液（SolB），在大烧杯中预先装入一定量的蒸馏水，加热至一定的温度，将SolS和SolB按一定的滴速同时滴入大烧杯中，维持反应体系的pH为一恒定值，剧烈搅拌。滴定完毕后，继续搅拌陈化，最后经过滤、洗涤、烘干，得产物。此合成方法是水滑石合成中的一种常用方法。其中镁盐和铝盐可以采用硝酸盐、硫酸盐、氯化物等，碱可以采用氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等，碳酸盐可以采用碳酸钠、碳酸钾等，也可以采用尿素代替碱和碳酸盐。 高过饱和共沉淀法 高过饱和共沉淀法，即将SolS和SolB各自预先加热至反应温度，快速将两种溶液同时倒入装有预先加热到和该溶液具有相同温度的二次蒸馏水的大烧杯中，剧烈搅拌 水热合成法 水热合成法，是先将SolS和SolB缓慢滴加在一起活着快速混合，然后将得到的浆状液立即转移至高压釜中，在一定的温度下（通常是100 °C）陈化较长时间，最后经过过滤、洗涤、干燥、研磨得产品。此法特点是使水滑石的成核和晶化过程隔离开，并通过提高陈化温度和压力来促进晶化过程。水热合成法由于反应发生在密闭的系统中，因而没有其他杂质被引入。制备所得纳米金属氧化物具有粉末细（纳米级）、纯度高、分散性好、颗粒均匀、晶粒发育完整、形状可控等优异特性。另外水热法还能够避免高温下反应物的挥发、应力诱导缺陷、物相相互反应等缺点，更重要的是水热法通过调整反应条件可控制生成物的形貌、大小、粘度分布等。 离子交换法 当金属离子在碱性介质中不稳定，或当阴离子An-没有可溶性的M2+和M3+盐类，共沉淀法无法进行时，可采用离子交换法。该法是从给定的水滑石出发，通过溶液中某种阴离子对原有阴离子的交换作用，形成新的相。然而在层状双金属氢氧化物材料上，直接用大体积无机阴离子通过离子交换法制备很困难，一般先用大体积有机阴离子把层间撑开，然后用无机阴离子交换制得样品。 尿素分解—均匀共沉淀法 该法利用尿素在低温下呈中性，可与金属离子形成均一溶液，而溶液温度超过90 °C时尿素分解使溶液pH值均匀逐步地升高这一特点，用尿素代替混合碱溶液，该罚的优点是溶液内部的pH值始终是一致的，因而可以合成出高结晶度的Mg-Al、Zn-Al、Ni-Al类水滑石，而难以合成Co-Al、Mn-Al、Co-Cr类水滑石。另一方面以尿素为沉淀剂，反应过程中在层间形成NH2COO-插层，经水热处理即转化为CO32-，而溶液内形成的[Ni(NH3)6]2+水热条件下则释放出NH3，所以尿素可以取代强碱混合液来制备碳酸型水滑石并且可以制备得到结晶较好、粒径均匀的水滑石样品。
共沉淀法 沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合，在混合液中加入适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物,再将沉淀物进行干燥或锻烧，从而制得相应的粉体颗粒。 共沉淀法是指在溶液中含有两种或多种阳离子，它们以均相存在于溶液中，加入沉淀剂，经沉淀反应后，可得到各种成分的均一的沉淀，它是制备含有两种或两种以上金属元素的复合氧化物超细粉体的重要方法。 浸渍法 制造固体催化剂的方法之一，即将一种或几种活性组分通过浸渍载体负载在载体上的方法。通常是用载体与金属盐类的水溶液接触，使金属盐类溶液吸附或贮存在载体毛细管中，除去过剩的溶液，再经干燥、煅烧和活化制得催化剂。浸渍方式有过量溶液浸泡与等体积吸附等。有时加入竞争吸附剂使活性组分均匀吸附在整个载体上。 过量浸渍法 也就是浸渍溶液（浓度x%）的体积大于载体。该实验过程是活性组分在载体上的负载达到吸附平衡后，再滤掉（而不是蒸发掉）多余的溶液，此时活性组分的负载量需要重新测定。该方法的优点是活性组分分散比较均匀，并且吸附量能达到最大值（相对于浓度为x%时），当然这也是它到缺点：不能控制活性组分的负载量。且很多时候并不是负载量越大活性越好，且负载量过多离子也容易聚集。还有一种所谓的过量浸渍法：也是溶液过量，但此时是边搅拌边蒸发，等溶液变成粘稠状后，再放到烘箱烘干。这实际上并不是真正意义上的浸渍法，而只能算是一种modified的浸渍法。在升温蒸发过程中活性相在孔中的负载量会随温度的变化而变化，而水分蒸干后，活性相的分布也很不均匀。且还要考虑升温后活性相或者载体是否有水解过程，它会对之后煅烧过程中的催化剂有很大的影响。根据我在试验中的结果，此方法效果并不是很好。 等体积浸渍 就是载体的体积（一般情况下是指孔体积）和浸渍液的体积一致，浸渍液刚好能完全进入到孔里面。该方法的特点与过量浸渍法相反：活性组分的分散度很差，有的地方颗粒小，有的地方颗粒则很大（毕竟，在实际实验中，载体倒入时有一个前后顺序，先与溶液接触的载体会吸附更多的活性相）；但是它能比较方便地控制活性组分地负载量，并且负载量能很容易算出。对颗粒大小要求不是很严的催化剂，该方法效果还比较好。 问题：上次做的那个等体积浸渍，用的1.2ml/g，是一般是这个比列？还是不同的材料有不同的比列呢？
免疫共沉淀技术的研究进展 S t u d y P r o g r e s s o f C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n T e c h n o l o g y 郭纯 (湖南省人民医院,湖南 长沙 410005) [摘要] 免疫共沉淀(c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法。文章对近10余年有关免疫共沉淀技术的原理和应用及其优缺点的分析进行文献综述。 [关键词] 免疫共沉淀;蛋白质;相互作用;技术 [A b s t r a c t] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t e c h n o l o g y i s c l a s s i c a l m e t h o dt o e x a m i n e t h e i n t e r a c t i o na m o n g p r o t e i n s,a l s o ac o m m o n m e t h o d.T h e p a p e r m a d e a l i t e r a t u r er e v i e w,w h i c hr e f e r r e dt ot h e p r i n c i p l e o f c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o nt e c h n o l o g y a n di t sm e r i t o r f l a w. [K e y w o r d s] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n;P r o t e i n;I n t e r a c t i o n;T e c h n o l o g y [中图分类号]R392-33 [文献标识码]A [文章编号]1672-951X(2007)12-0086-04 蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和死亡。通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内蛋白质的动力学特征。如底物结合特性、催化活性;也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性;还可失活其它蛋白质,调控其它基因表达。因此,只有使蛋白质间相互作用顺利进行,细胞的正常生命活动过程才有保障。由于蛋白质间相互作用具有如此重大的意义,因此其检测方法的研究也备受重视由生化方法,如蛋自质亲和层析(p r o t e i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y)、亲和印迹(a f f i n i t yb l o t t i n g)、免疫沉淀(i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)及交联(c r o s s-l i n k i n g),发展到当今的分子生物学方法,如以基因文库为基础的蛋白探测(p r o-t e i np r o b i n g)、噬菌体显示(p h a g e d i s p l a y)及双杂交系统(t w o -h y b r i ds y s t e m)等。另外,还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法,如表面胞质团共振(s u r-f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e)等。通过这些方法的联合使用,实验得出的蛋白质间的相互作用的结论显得更为可靠[1]。 1 免疫共沉淀基本原理 细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物,若存在与已知抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中还应包含这种蛋白质,经过洗脱,收集免疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细胞构建成c D N A文库,以上述核苷酸序列为探针从c D N A文库中分离出c D N A克隆。 1.1 免疫共沉淀技术的主要步骤 1.1.1 用磷酸盐缓冲液洗30块10c m培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1m l冰冷的E B C裂解缓冲液中。 1.1.2 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15m i n。 1.1.3 收集上清(约30m l)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1h。 1.1.4 加入0.9m l的蛋白质A-S e p h a r o s e悬液,4℃摇动免疫沉淀物30m i n。 1.1.5 用含900m m o l/L N a C l的N E T N洗蛋白A-S e p h a r o s e 混合物,再重复洗5次。最后,用N E T N洗1次。 1.1.6 吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×S D S胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4m i n。 1.1.7 将样品加入到大孔的不连续S D S-P A G E梯度胶中,在10m A的恒定电流下电泳过夜。 1.1.8 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。 1.1.9 从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1m l 50%乙腈洗两次,每次3m i n。 1.1.10 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。 1.1.11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在A B I 477A或494A机器上进行自动E d m a n降解测序。 2 免疫共沉淀技术的应用 2.1 肿瘤 鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白质的分离与鉴定:免疫共沉淀与L C2E S I2M S/M S分析相结合的方法对H N E1细胞蛋白条带3鉴定的p53相互作用蛋白之一H S P78进行了验证。首次在鼻咽癌细胞中鉴定了9个p53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要 第13卷第12期 中 医 药 导 报 2007年12月V o l.13 N o.12 G u i d i n g J o u r n a l o f T C M D e c e m b e r.2007 DOI:10.13862/https://www.doczj.com/doc/998140921.html, https://www.doczj.com/doc/998140921.html,43-1446/r.2007.12.038
共沉淀法是指在溶液中含有两种或多种阳离子，它们以均相存在于溶液中，加入沉淀剂，经沉淀反应后，可得到各种成分的均一的沉淀，它是制备含有两种或两种以上金属元素的复合氧化物超细粉体的重要方法。. 共沉淀法，就是在溶解有各种成份离子的电解质溶液中添加合适的沉淀剂，反应生成组成均匀的沉淀，沉淀热分解得到高纯纳米粉体材料。共沉淀法的优点在于：其一是通过溶液中的各种化学反应直接得到化学成分均一的纳米粉体材料，其二是容易制备粒度小而且分布均匀的纳米粉体材料 化学共沉淀法制备ATO粉体具有制备工艺简单、成本低、制备条件易于控制、合成周期短等优点，已成为目前研究最多的制备方法。 化学共沉淀法是把沉淀剂加入混合后的金属盐溶液中，使溶液中含有的两种或两种以上的阳离子一起沉淀下来，生成沉淀混合物或固溶体前驱体，过滤、洗涤、热分解，得到复合氧化物的方法。沉淀剂的加入可能会使局部浓度过高，产生团聚或组成不够均匀。 化学共沉淀法不仅可以使原料细化和均匀混合，且具有工艺简单、煅烧温度低和时间短、产品性能良好等优点。 产生共沉淀的原因有：①表面吸附，由于沉淀表面的离子电荷未达到平衡，它们的残余电荷吸引了溶液中带相反电荷的离子。这种吸附是有选择性的：首先，吸附晶格离子；其次，凡与晶格离子生成的盐类溶解度越小的离子，就越容易被吸附；离子的价数愈高、浓度愈大，则愈容易被吸附。吸附是一放热过程，因此，溶液温度升高，可减少吸附。②包藏，在沉淀过程中，如果沉淀剂较浓又加入过快，则沉淀颗粒表面吸附的杂质离子来不及被主沉淀的晶格离子取代，就被后来沉积上来的离子所覆盖，于是杂质离子就有可能陷入沉淀的内部，这种现象称为包藏，又叫吸留。由包藏引起的共沉淀也遵循表面吸附规律。例如，在过量氯化钡存在下沉淀硫酸钡时,沉淀表面首先吸附构晶离子Ba2+；为了保持电中性，表面上的Ba2+又吸引Cl-；如果晶体成长很慢，溶液中的硫酸钡将置换出大部分Cl-；如果晶体成长很快, 则硫酸钡来不及交换Cl-, 就引起较大量的氯化钡的包藏共沉淀。因为硝酸钡比氯化钡的溶解度小，所以钡的硝酸盐比氯化物更易被包藏。③生成混晶，如果晶形沉淀晶格中的阴、阳离子被具有相同电荷的、离子半径相近的其他离子所取代，就形成混晶。例如,当大量Ba2+和痕量Ra2+共存时，硫酸钡就可和硫酸镭形成混晶同时析出，这是由于二者有相同的晶格结构,Ra2+和Ba2+的离子大小相近的缘故。 注意事项:
实验1 共沉淀法制备BaTiO3 一、实验目的 1.掌握纳米材料的共沉淀制备技术。 2.掌握利用XRD的物相和成分分析的方法。 二、实验原理 钛酸钡（BaTiO3）具有强介电、压电、铁电和正温度系数效应等优异的电学性能，是电；器件的制造。近年来，随着电子元件的高精度、高可靠性和小型化，对钛酸钡粉体也有了高纯、超细和均匀化的要求，多种制备方法的取得了很大进展，如溶胶-凝胶法、水热法、化学沉淀法和微乳液法等。化学城沉淀法因具有条件温和、分体性能优异等特点而得到广发关注。其中共沉淀法从工艺条件、经济成本、分体性能综合考虑，为制备碳酸钡的较好方法。 用共沉淀法制备纳米BaTiO3粉体的工艺是从对应水热法的工艺演变而来的。共沉淀法制备纳米BaTiO3粉体，不需要加额外压强，BaTiO3粉体可以在90℃下得到，即纳米BaTiO3粉体可以在常压低温下得到。溶液的pH值和CO2分压是两个非常重要的热力学变量。BaTiO3的溶解性强烈依赖于pH值，90℃下，当[Ba ]=10-6 mol/L时，完全沉淀BaTiO3需要pH 值≥4；当[Ba ]=10-1 mol/L时，完全沉淀BaTiO3需要pH值≥11。温度的降低使溶解度曲线移向高pH值方向，即当温度降低时，需要更高的pH值使之沉淀完全。同时应避免CO2的存在，因为BaCO3较BaTiO3稳定。 传统的钛酸被共沉淀法采用的是草酸共沉淀法，草酸盐共沉淀法已经工业化生产，是将TiOCl2和BaCl2的混合溶液在室温下加入到草酸溶液中，并加入表面活性剂，不断搅拌，发生沉淀反应生产BaTiO(C2O4）24H2O沉淀，经过滤、洗涤、干燥。煅烧，制得BaTiO3粉体，但是这种方法引起的Ti/Ba波动较大，不能保证其化学组成，同时，还存在团聚。本实验选择采用改进的草酸盐共沉淀法和NaOH共沉淀法制备BaTiO3粉体。 改进的草酸盐共沉淀法的制备原理：利用在钛酸丁酯溶液中，TiO2+与H2C2O4在一定条件下形成TiO(C2O4)22-配合粒子的特点，先形成络离子，再使它与Ba2+反应生成BaTiO(C2O4）24H2O 前驱体，然后经过滤、洗涤、干燥、煅烧得到BaTiO3超细粉体。此过程相对于传统的草酸氧钛沉淀法，具有操作简单，操作条件的微小变化不会造成产物Ba/Ti波动大的优点。在TiO2+和BaTiO3体系中涉及反应式如表1.1。 表1.1 TiO2+和H2C2O4体系中反应及反应常数 适当比例的TiCl4溶液与BaCl2的溶液混合，加入添加剂后倒入BaOH溶液中产生沉淀，
1.沉淀溶液的浓度 沉淀溶液的浓度会影响沉淀的粒度、晶形、收率、纯度及表面性质。通常情况下，相对稀的沉淀溶液，由于有较低的成核速度，容易获得粒度较大、晶形较为完整、纯度及表面性质较高的晶形沉淀，但其收率要低一些，这适于单纯追求产品的化学纯度的情况；反之，如果成核速度太低，那么生成的颗粒数就少，单个颗粒的粒度就会变大，这对于微细粉体材料的制备是不利的，因此，实际生产中应根据产品性能的不同要求，控制适宜的沉淀液浓度，在一定程度上控制成核速度和生长速度。 2.合成温度 沉淀的合成温度也会影响到沉淀的粒度、晶形、收率、纯度及表面性质。在热溶液中，沉淀的溶解度一般都比较大，过饱和度相对较低，从而使得沉淀的成核速度减慢，有利于晶核的长大，得到的沉淀比较紧密，便于沉降和洗涤；沉淀在热溶液中的吸附作用要小一些，有利于纯度的提高。在制备不同的沉淀物质时，由于追求的理化性能不同，具体采用的温度应视试验结果而定。例如：在合成时如果温度太高，产品会分解而只得到黑色氧化铜；在采用易地分解、易挥发的沉淀剂时，温度太高会增加原料的损失。 3.沉淀剂的加入方式及速度 沉淀剂的加入方式及速度均摊会影响沉淀的各种理化性能。沉淀剂若分散加入，而且加料的速度较慢，同时进行搅拌，可避免溶液局部过浓而形成大量晶核，有利于制备纯度较高、大颗粒的晶形沉淀。例如：制备白色无定形粉末状沉淀氢氧化铝，使用的原料为NaAlO2及碳酸氢铵，其主要杂质为碱金属，开始时以较慢的线速度将NH4HCO3加入到NaAlO2的热溶液中，待沉淀析出大半时，再加快沉淀剂的加入速度，直至反应结束。这样得到的Al(OH)3颗粒较大，只需要洗涤数次，产品中碱金属杂质即可合格。如将沉淀剂浓度加大，加料速度加快、反应温度又低，这样得到的是Al(OH)3的胶状沉淀，即使洗涤数十次，产品中碱金属含量也不容易合格。当然，这只是从化学纯度的角度来考虑的，或要生产专用性的Al(OH)3产品，沉淀剂的加入方式及速度则应该根据具体要求而定。 4.加料顺序 加料方式分正加、反加、并加三种。生产中的“正加”是指将金属盐类先放于反应器中，再加入沉淀剂；反之为“反加”；而把含沉淀物阴、阳离子的溶液同时按比例加入到反应器的方法，称为“并加”。加料顺序与沉淀物吸附哪种杂质以及沉淀物的均匀性有密切的关系。“正加”方式的沉淀主要吸附原料金属盐的阴离子杂质；且在中和沉淀时，先、后生成的沉淀，其所处的环境PH值不同，得到的沉淀产品均匀性差。“反加”方式主要吸附沉淀的阴离子杂质；若是中和填充沉淀时，在整个沉淀过程占卜PH值变化很小，产品均匀性较好。“并加”方式可避免优秀作品溶液的局部过浓，沉淀过程较为稳定，且吸附杂质较小，从而可得到理化性能较好的产品。在实际生产中应视产品的具体要求而定。 5.沉淀剂 沉淀剂的选择应考虑产品质量、工艺、产率、原料来源及成本、环境污染和安全性等问题。在工艺允许的情况下，应该选项用溶解度较大、选择性较高、副产物影响较小的沉淀剂，也便易于除去多余的沉淀剂、减少吸附和副反应的发生。在生产碳酸盐沉淀产品时，可选择的沉淀剂有Na2CO3、NaHCO3 NH4HCO3和其他多种可溶性碳酸盐，但一般以NH4HCO3为好，因为它的溶解度大、易洗涤、副产物易挥发、污染也较小，而且原料来源广泛、价格也低。沉淀剂的使用一般应过量，以便能获得高的收率，减少金属盐离子的污染；但也不可太过量，否则会因络合效应和盐效应等降低收率。一般过量20%-50%就能满足要求了。 6.沉淀的陈化 陈化可释出沉淀过程带入的大部分杂质。在陈化过程中，因小颗粒沉淀的比表面积大，表面能也大；相同量大颗粒沉淀的比表面积较小，表面能就小，体系的变化有从高能量到低能量的自发趋
共沉淀法制备磁性Fe3O4 余春宇08化学85号 摘要考察了普通共沉淀法制备过程中的一些影响因素，采用一种改进，了的共沉淀法，制备磁性Fe3O4 纳米粒子。并对获得的粉体采用进行初步表征用化学共沉淀法制备了纳米Fe3O4颗粒, 研究了影响纳米Fe3O4 颗粒磁性的因素[1]。 关键词磁性Fe3O4；共沉淀法；制备； 引言 磁流体作为一种新型纳米材料，在工业上也有着广阔的应用前景。目前磁流体技术在国内未得到广泛应用的主要原因是纳米铁氧体粉体的制备不够完善，目前应用较广泛的铁氧体是纳米Fe3O4，近年来纳米材料取得了很大的进展[2]Fe3O4更多应用于化学领域[3]近几年来Fe 3 O4便成为了一种新型材料[4]纳米粒子(nano particle)也叫超微颗粒，一般是指尺寸在1～100 am间的粒子[5] Fe 3O 4 纳米粒子是一种新型材料，具有良好的磁性能，即超顺磁性[6]Hao-Yu等人制 备出来的Fe3O4可达5–10 nm[7]使用XRD，TEM，VSM 对材料进行了相关测试，测试结果发现，用水热法制备的磁性纳米复合材料具有典型的层型结构[8]。，近年来有关纳米粒子的制备方法及其物性的研究受到很大的重视，这在纳米粒子基本理论上有重大意义[9]通过共沉淀法制备纳米FeO 性能影响因素的研究，以得到合理优化的制备工[10]采用化学沉淀法制备纳米Fe304颗粒，并以聚乙二醇为改性剂，蒸馏水为载液[11] 本文综述了多种制备磁性Fe3O4纳米粒子的方法且分析了它们的诸多影响因素，在前人的基础上总结了很多经验取长补短得出了在共沉淀发的基础上再对一些反应条件以及其他一些试剂进行了改进 内容 近年来，随着纳米技术的飞速发展，有关纳米Fe304的制备方法及其性能的研究受到很大的重视。纳米材料的制备方法多种多样，目前纳米Fe304的制备方法主要有[12]机械球磨法、溶胶一凝胶法、化学共沉淀法、热分解法、电弧蒸发法、液相微介质电加热分解法、水热法等，但每种方法有其自身的不足。 机械球磨法 机械球磨法机械球磨法是在球磨机中加入粒度为几十微米
免疫共沉淀技术的研究进展 李昊,李义,高建梅 (内蒙古医学院附属医院影像科,内蒙古呼和浩特010050) [关键词]免疫共沉淀;蛋白质;相互作用 [中图分类号]R446.6[文献标识码]A[论文编号]1004-0951(2008)04-0452-03 蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和死亡。通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内蛋白质的动力学特征。如底物结合特性、催化活性;也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性;还可失活其它蛋白质,调控其它基因表达。因此,只有使蛋白质间相互作用顺利进行,细胞的正常生命活动过程才有保障。另外,还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法(如表面胞质团共振等)。通过这些方法的联合使用,实验得出的蛋白质间的相互作用的结论显得更为可靠[1]。 1免疫共沉淀基本原理 细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物,若存在与已知抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中还应包含这种蛋白质;经过洗脱,收集免疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细胞构建成cDNA文库,以上述核苷酸序列为探针从cDNA文库中分离出cDNA克隆。 2免疫共沉淀技术的应用 2.1肿瘤 鼻咽癌细胞中P53相结合蛋白质的分离与鉴定:免疫共沉淀与LC2ESI2MS/MS分析相结合的方法对H NE1细胞蛋白条带3鉴定的P53相互作用蛋白之一HSP78进行了验证。首次在鼻咽癌细胞中鉴定了9个P53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中P53蛋白聚集及失活的机制提供了重要依据和线索。人肝癌中热休克蛋白70(HSP70)与Pp53的相互作用:用免疫组织化学染色法,从12例肝癌组织中筛选HSP70与P53均呈阳性表达的标本,并以免疫共沉淀法提取,然后用SDS-PAGE及West2ern blot分析双阳性标本中两种蛋白的存在形式。检测到12例肝癌组织中有3例为双阳性,用抗HSP70mAb免疫共沉淀的样品,可检测到p53蛋白。用抗P53mAb免疫共沉淀的样品也可检测到HSP70蛋白,证明人肝癌中P53H SP70以复合物的形式而存在,此可为肝癌的发病机制及免疫治疗的研究提供新的思路[2]。肿瘤的异质性是指单克隆起源的肿瘤细胞在生长过程中其侵袭能力、生长速度、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性等方面能形成不同表型亚克隆的特性[3]。肿瘤异质性是肿瘤研究的一个重要方向,对解释肿瘤基础及临床研究中出现的诸多问题具有重要意义。随着分子生物学技术的发展,对于肿瘤异质性的研究方法已从形态学深入到细胞生物学、分子遗传学、分子病理学等方面,但其分子水平的研究多处于基因水平,而对蛋白质方面的研究甚少。由于蛋白质是生命活动的执行者和体现者,细胞各种重要的生理过程都是以蛋白质间相互作用来实现的,因此通过研究蛋白质的相互作用来探讨肿瘤异质性,将更直接、全面揭示异质性的发生机理及调控过程。借助于免疫共沉淀法来研究肿瘤异质性的分子机制无疑是一条很好的途径,随着这一研究方法的完善,它将在细胞异质性的研究中发挥重要作用[4]。 2.2酶与病毒 端粒酶(或端粒体酶)是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶。主要成分是RNA和蛋白质,其含有引物特异识别位点,能以自身RNA为模板,合成端粒DNA并加到染色体末端,使端粒延长,从而延长细胞的寿命甚至使其永生化[5]。应用免疫共沉淀技术,验证新基因AngRem104和糖皮质激素受体特异延伸因子(GR-EF)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功能奠定基础。AngRem104是我们在血管紧张素ò(Angò)刺激人肾小球系膜细胞(MSC)增生和硬化过程中获得的上调表达新基因,全长1690bp,蛋白相对分子质量为37000,是一个多组织广泛表达的基因,在肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均有AngRem104mRNA表达[6]。CD81全基因序列编码蛋白可与HBeAg在酵母细胞中相互作用。采用体外免疫共沉淀试验测了H BeAg与CD81的相互作
染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 关键词：染色质免疫沉淀2012-03-13 15:07 来源：互联网点击次数：12483 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA 的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。 它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原
第五章沉淀技术 学习目标：了解蛋白质的基本性质 掌握蛋白质沉淀的基本原理 掌握沉淀技术的基本方法 能够正确进行蛋白质的沉淀分离方法 第一节蛋白质沉淀的基本原理 沉淀是溶液中溶质由液相变为固相析出的过程。 沉淀技术是通过加入试剂或改变条件,使溶液中的溶质离开溶液生成不溶性颗粒而沉降析出的技术. 第一节蛋白质沉淀的基本原理 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程.此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的. 一蛋白质的溶解性 蛋白质的溶解性是由其组成,构象以及分子周围的环境所决定.影响蛋白质溶解度的主要因素分成蛋白质性质和溶液性质两类. 蛋白质性质的因素有:分子大小,氨基酸序列,可离子化的残基数,极性/非极性残基比率,极性/非极性残基分布,氨基酸残基的化学性质,蛋白质结构,蛋白质电性,化学键性质. 溶液性质的因素有:溶剂可利用度,pH值,离子强度,温度. 二蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质属于胶体分散系统.由于水化膜和双电层着两种稳定的因素,使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液.由于水化膜和双电层的存在,蛋
白质颗粒彼此不能接近,因而增加了蛋白质溶液的稳定性,阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来. 三沉淀动力学 溶解度是一个平衡特性，但是溶解度的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起:口热运动(布朗运动); 2对流运动，由机械搅拌产生:3差速沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中D和@两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，而机理3在沉隆过程中起主导作用(如在废水处理中)。由布朗运动所造成的碰撞导致异向聚集，而由对流运动所造成的碰撞导致同 向聚集。 为了简化沉淀过程的动力学，可把沉淀过程分成下述6 个步骤: @初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合; @晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒; 3扩散限制生长，晶核在布朗扩散作用下生长，生成亚微米大小的核，这一步速度很快: @流动引起的生长，这些核通过对流传递(搅拌) 引起的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在较低的速度下进行的; 5絮体的破碎，破碎取决于它们的大小、密度和机械阻力; 6 聚集体的陈化，在陈化过程中，絮体取得大小和阻力平衡。 第二节蛋白质沉淀技术实施 －、基本方法
4. 免疫共沉淀技术路线(CoIP) 2007-05-07 09:14 准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子 8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月） 9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10μg/μl） 10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育 12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG） 13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS 14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混
第二讲沉淀分离技术2学时 ※、通过本章学习应掌握的内容 1、什么是沉析 2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些 3、沉析的一般操作步骤是什么 4、何谓盐析其原理是什么 5、盐析操作时常用的盐是什么 6、影响盐析的主要因素有哪些 7、有机溶剂沉析法的原理是什么 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些 9、等电点沉析的工作原理是什么 10、其它常用的沉析方法有哪些 一、沉淀分离的目的及其方法 沉淀分离技术是经典的化学分离技术。沉淀的概念是指溶液中的介质在适当条件下由液相变成固相而析出的过程。 沉淀技术的目的包括两个：⑴通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质的目的。当目标成分是以固相形式回收时，固液分离可除去留在溶液中的非必要成分；如果目标成分是以液相形式回收时，固液分离可使不必要的成分以沉淀形式去除。⑵通过沉淀可使已纯化的产品由液态变成固态，有利于保存和进一步的加工处理。 沉淀分离技术通常包括下列各种沉淀方法： ⑴无机沉淀剂沉淀分离法：通常是以盐类作为沉淀剂的一类沉淀方法，如盐 析法，多用于各种蛋白质和酶类的分离纯化，以及某些金属离子的去除。常
用的沉淀剂有：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化纳等。 ⑵有机沉淀剂沉淀分离法：以有机溶剂作为沉淀剂的一种沉淀分离方法， 多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离；有时也用于蛋白质的沉淀和金属离子的去除；用于酶的沉淀分离时，易导致酶的失活。常用到的沉淀剂有：丙酮、乙醇、甲醇等。 ⑶非离子多聚体沉淀剂沉淀分离法：采用非离子型的多聚体作为目标成分的 沉淀剂，适用于生物大分子的沉淀分离，如酶、核酸、蛋白质、病毒、细菌等。典型的非离子型多聚体是聚乙二醇（PEG），根据其相对分子量的大小，有PEG600、PEG4000、PEG20000等型号。 ⑷等电点沉淀法：主要是利用两性电解质在等电点状态下的溶解度最低而沉 淀析出的原理。适用于氨基酸、蛋白质及其它属于两性电解质组分的沉淀分离，如大豆蛋白“碱提酸沉”的提取方法。 ⑸共沉淀分离法：又可称为生物盐复合物沉淀法，用于多种化合物特别是一 些小分子物质的沉淀。它是利用沉淀的同时对其它待分离成份吸附共沉淀而达到除杂的目的。 ⑹变性沉淀分离法：又称为选择性变性沉淀法，是利用特定条件使目标成分 变性，导致其性质的改变如溶解度下降而得以分离。适用于一些变性条件下差异较大的蛋白质和酶类的分离纯化。采取的变性条件有pH值、温度的改变以及添加剂、利用酶的作用等，腐竹的生产是利用大豆蛋白的热变性而进行分离的一个例子。 二、沉析的特点 操作简单、经济、浓缩倍数高，但针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强。 三、沉析操作的一般过程 1、在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 2、沉淀物的陈化，促进晶体生长；